SU504503A3 - Способ проведени ферментных реакций - Google Patents

Description

I

Изобретение относитс  к медицине.

Известен способ проведени  ферментных реакций, заключающийс  в том, что водный раствор фермента подвергают контакту с Цодным раствором субстрата.

Г С целью повышени  выхода целевого про дукта в случае, когда субстрат Иезначительно растворим в воде, субстрат рйствор ют ; в органическом растворителе, не смеишваю ;й1вмс  с вод,рй.1,

I Как известно, раньше энзимные реакции :Ьроводили только в водной среде. Дальией;шие исследовани  в этой области обиаружи-; ПИ возможность проведени  энзимных пре- ; .вращений, не растворимык в воде, посредICTBOM работы в водно-органических двух- : фазных системах, характеризуемых тем, что оргавмческий растворитель (не смешиваю- ; щийс  в воде)  вл етс  хорошим раствори- ;Телем дл  субстрата , по этой причине энэиМ |про вл ет действие в соответственной дл  иего водной окружаюиюй среде, причем иепосредственное цойствие со стороны растворител  при этом прекращаетс .

В качестве пригодных дл  применени  оргаиических растворителей можно рекомендовать следующие: сложные эфиры карбоиовых кислот, имеющих 2-15 атомов углеро-, I да, простые алкильные эфиры спиртов, имеющих 4-10 атомов углерода, сложные алкильные эфиры спиртов, имеющих 4-10 атомов углеродауалифатические, ароматические и ииг- |лЬалифатические углеводороды, галоидзамеще |нкю углеводороды.

: Пример 1.5 мл этилацетата, со1держащего 10 мг/мл эстрадиола (3,6 х

Г -2

X 1О М), эмульгируют с равным объемом

ацетатного буфера 6,1 М (,4). содер; .р

|Жэщего 0,О60 мг/мл(10 М) лакуазы.

. ;„

I Смесь инкубируют при температуре

i. о

i25 С при перемешивании, причем в газовой 1фазе содержитс  чистый кислород или воз|йух . Через различные промежутки времени |Отбирают 5 мл органической фазы и исполы. |3уют дл  анализа эстраднола и возможных (продуктов.

Источником энзима  вл етс  очищенный 0нзим из жидкой среды, получаемой при |сультивировании грибков Ровурогиэ uerslcofe Через 4 час.; при указанных выше услоЬи х проведени  реакции- поло&инное коли чество эстрадиола превращаетс  в продукты рсоторые могут быть различены с помощь о Хроматографического анализа. При аналогичных испытани х, проводимых в отсутстйин органического растворител , при насыЬюнии :эстрадиолом ацетатного буфера, коН-орый сойержит лакуазу, было невозможно доказать наличие реакций с применением обычных методов.

; Несколько другнх органических растворителей , (например трихлорэтан, диэтиловый эфир, дихлорэтан) могут служить заменител ми дл  этилацетата.

Пример 2. 3,2 мл фосфатного буфера , 0,2М1прнрН 7,6, содержащего 2,5мл КАД и 0,05 Н5ДН единиц эмульгируют с 3,2 мл органического растворител , со:- . -:

держащего 13 мг тестостерону (Д 44 х 10 М) при температуре 22 С.

Смесь перемешивают со скоростью 1ОО I качаний в 1 мини через различные промежутки времени определ ют оптическую плотность водной фазы при 340 пт. Данные определени  оптической плотнос|ТИ представлены в табл.1.

Т а б л и ц а 1.

а в случае отсутстви  органического pacтворител , общее возрастание оптической плотности при 34О швпограничиваетс  растворимостью тестостерона в {насышен ный раствор, содержит 25-Зр м/мл рона). Таким образом, при отсутствив орга ..нического растворител , значение оптическо плотности никогда не прёвышало примврно, 0.3. j Пример 3. 3мл буферного pscT; вора, содержащего окисленный КО-фактор и пируват натри , смешивают с двум  свободными энзимами L ДН или N АДН. К водному раствору добавл ют равный объем органической фазы, содержащей стероид, и осуществл ют эмульгирование Двух фаз. Реакцию провод т при встр хивании реакционной смеси при. 90 качани х в 1 мин. Затем развитие отдельных реакций узнают , определ   количества конвертированного и неконвертированного стероидов, которые присутствуют в органической фазе. В заданные моменты времени фазы смешивают , отбирают точно определенный объем органической фазы и определ ют содернжание тестостерона и аидростендиона по методу тонкослойной хроматографии с применением в качестве средства дл  элюировани  системы этилацетат-бензол - н.гексан (100 : 80 ; 60). Стероиды экстрагируют с подложки носител  хлороформом i в течение 24 час ;при комнатной температуре. После; испарейй  хлороформа стероиды анализируют с помощью спектрюфотометра при 240 в среде этанола. Источником энзима  вл етс  гидроксостероид дегидрогеназа (Н5ДН) из клеток PseudloTnon.a& testostei-oni себе лактик дегидрогеназа () фирмы Берингер . Пример 4. 5 мл раствора энзима :встр хивают с 2,5 мл оливкового масла, растворенного в 2,5 мл дихлорацтана, и темперируют при в течение 1 час при перемешивании. I Через определенный промежуток времени добавл ют 30 мл смеси равных частей ацетона с этанолом, затем растирают с 0,05М углекислого натри . Результаты испытаний представлены в табл. 2.

- верителем,

мг за 1 час при 37 С

Пример 5. Испытание 1.

Составл ют реакционную смесь из 10мл полифосфатного буфера (ОДМ, ), в JKOTOpoM раствор ют следующие вещества: 12,5 мг семикарбазида, 16,7 мг гпишна, ;3 Kfr вбсстановленного глютатиона, ЗО мг J ifAfl. Смесь инкубируют совместнощс 5 / бутанола при перемешивании.

Врем ,; .мин;.

Таблица 2.

Испытание с раст- Испытание без

эмульсии, без

раствориуел 

моли жирной кислоты, выдел вшиес 

Испытание 2.4 Далее испытание про во- :д т с бензолом.

20

I Дл  этого такую же реакционную смесь, IxaK при испытании 1, инкубируют совмест|но со смесью 5 мл бутанола и 5 мл бен|зола при перемешивании при 20 С.

5

Результаты испытаний сведены в табл.3. Таблица 3.

С тическа  плотнос-й при 340 птп Испытание 1 Испытание 2