DE69109891T2 - Verfahren für die enzymatische Erlangung von Irone. - Google Patents

Verfahren für die enzymatische Erlangung von Irone.

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Ironen, deren Gemische von drei Isomeren, den α-, β- und γ-Isomeren, in der Lebensmittel-, der Parfüm- und der Kosmetikindustrie aufgrund ihres Veilchendufts verwendet werden.
  • Bei der Ernte enthalten Iris-Wurzelstöcke praktisch keine Irone, und erst im Verlauf einer längeren Lagerung entstehen die Duftstoffmoleküle, nach Z. Naturforsch. 38c, 179-184, (1983), wahrscheinlich durch oxidativen Abbau von Terpenoiden.
  • Bei herkömmlichen Verfahren zur Darstellung von Ironen läuft diese Oxidation sehr langsam in den geschälten Wurzelstöcken ab, die an einem kühlen und belüfteten Ort aufbewahrt werden, und man muß nach der Ernte mehr als 2 Jahre warten, um eine annehmbare Menge an lronen aus den Wurzelstöcken mit einem organischen Lösungsmittel oder durch Wasserdampfdestillation zu gewinnen.
  • Vor kurzem wurde jedoch in FR-A-2 620 702 gezeigt, daß die chemische Oxidation von Vorläuferverbindungen, insbesondere von Vorläuferverbindungen aus Triterpenen, die mit einem lipophilen Lösungsmittel aus Wurzelstöcken gewonnen werden, ohne daß ihre Reifung abgewartet wird, die Gewinnung von Ironen unter wirtschaftlich vorteilhaften Bedingungen erlaubt. Tatsächlich sind die Ausbeuten an Iron-Extrakt, bezogen auf die Gewichtseinheit an getrocknetem Wurzelstockmaterial, bei diesem Verfahren größer, und außerdem setzt es weder das Schälen der Wurzelstöcke, das notwendig ist, damit die Reifung an der Luft günstig abläuft, noch eine lange Aufbewahrung voraus.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt auch die Oxidation von Vorläuferverbindungen, die nach der Ernte aus den Wurzelstöcken gewonnen werden, wobei die danach vergehende Zeit keine entscheidende Rolle spielt, ggfs. nach ihrer Trocknung an der Luft, durch die ein Teil des Wassers entfernt und der Transport erleichtert werden. Diese Oxidation wird nicht mehr chemisch durchgeführt, was eine Verwendung der gewonnenen Irone in der Lebensmittelindustrie verbieten würde, sondern enzymatisch in Gegenwart eines peroxidierenden Systems. Dieses besonders einfach durchführbare Verfahren erlaubt die Herstellung von Ironen in Ausbeuten, die mindestens dreimal so groß sind wie beim herkömmlichen Verfahren.
  • Erfindungsgemäß werden die Vorläuferverbindungen aus frischen, mehr oder weniger getrockneten Iris-Wurzelstöcken mit einem lipophilen Lösungsmittel extrahiert, wonach man auf den Rückstand der Extraktion ein peroxidierendes enzymatisches System einwirken läßt, das Wasserstoffperoxid und eine Peroxidase oder Sauerstoff und eine Lipoxygenase enthält, ggfs. in Gegenwart eines Substrats für das Enzym, z.B. Dihydroxyfumarsäure oder Ascorbinsäure für die Peroxidase oder eine ungesättigte aliphatische Carbonsäure, aus der in Gegenwart der Lipoxygenase ein Hydroperoxid entstehen kann, wie z.B. Linolsäure, Linolensäure oder Arachidonsäure.
  • Der erste Schritt der Gewinnung der Terpen-Vorläuferverbindungen aus den Wurzelstöcken wird mit zerkleinertem oder sogar zermahlenem Wurzelstockmaterial, vorzugsweise mit einem üblicherweise in der Riechstoffindustrie verwendeten lipophilen Lösungsmittel durchgeführt, wie z.B. einem alkoholischen Lösungsmittel, wie Methanol oder Ethanol, einem chlorierten Lösungsmittel, wie Methylenchlorid oder Dichlorethan, oder einem aromatischen oder aliphatischen Kohlenwasserstoff, wie z.B. Benzol oder Hexan, üblicherweise bei der Rückflußtemperatur des Lösungsmittels. Gegebenenfalls kann man Gemische von Lösungsmitteln verwenden oder zwei aufeinander folgende Extraktionen mit verschiedenen Lösungsmitteln durchführen. Vorzugsweise werden alkoholische oder chlorierte Lösungsmittel verwendet, die für Terpenverbindungen bessere Lösungsmittel sind als Kohlenwasserstoffe, am bevorzugtesten Methanol und Methylenchlorid. Ferner kann man, um die bei dieser Extraktion mit übergegangenen wasserlöslichen Verbindungen zu entfernen, den Eindampfrückstand in einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, wie z.B. Ethylenchlorid, wieder auflösen und die organische Phase mit Wasser waschen, bevor das organische Lösungsmittel erneut entfernt wird.
  • Der zweite Schritt der enzymatischen Oxidation wird unter herkömmlichen Bedingungen in Wasser durchgeführt, ggfs. in Gegenwart eines grenzflächenaktiven Stoffs, wie z.B. eines Sorbitanfettsäureesters (Tween ), oder eines weiteren Lösungsmittels, das die Dispergierbarkeit der hydrophoben Moleküle in dem Medium verbessert, ohne die Enzyme zu denaturieren, wie z.B. Dioxan, Tetrahydrofuran oder ein Alkohol, bei für die Enzymaktivität bestmöglicher Temperatur und bestmöglichem pH-Wert, im allgemeinen bei 25 bis 35 ºC und einem pH-Wert größer als 7.
  • Lipoxygenasen findet man in zahlreichen Pflanzen: Auberginen, Tomaten, Kartoffeln und Soja; üblicherweise wird die im Handel erhältliche Soja-Lipoxygenase verwendet. Peroxidasen sind ebenfalls in zahlreichen Pflanzen vorhanden, am gebräuchlichsten ist aber die Rettich-Peroxidase; ferner können die Manganperoxidasen und die Chlorperoxidasen, die aus unterschiedlichen Mikroorganismen isolierbar sind, oder die Lactoperoxidase der Milch genannt werden.
  • Es ist bekannt, daß die gebildeten Irone oxidativ abgebaut werden können und daß die Umsetzung nicht länger durchgeführt werden soll, als für die Bildung der Irone nötig ist. Der Fachmann kann ohne weiteres durch Vorversuche die vorteilhaftesten Konzentrationen an Reagentien in dem Medium und die vorteilhafteste Dauer der Umsetzung bestimmen; der Reaktionsfortschritt kann gaschromatographisch verfolgt werden.
  • Die Irone werden durch Wasserdampfdestillation oder durch Extraktion mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel isoliert.
  • Im folgenden werden Beispiele zur Durchführung der Erfindung beschrieben.
  • Beispiel 1 Erster schritt: Gewinnung der Vorläuferverbindungen
  • 2,5 kg Wurzelstöcke von Iris pallida aus Italien, die getrocknet sind, aber noch 60 % Wasser enthalten, werden gereinigt und mit 24 l 96%igem Ethanol in einen Behälter mit 60 l Inhalt aus nichtrostendem Stahl gegeben, der einen zentral angeordneten Blattrührer aufweist. Das Gemisch wird 20 h bei der Rückflußtemperatur des Lösungsmittels gehalten, dann auf Umgebungstemperatur gebracht und filtriert; das Filtrat wird im Vakuum bis zur Trockne aufkonzentriert; die getrennten Feststoffe werden mit 12 l Methylenchlorid wieder in den Behälter eingebracht, wonach das Gemisch 20 h bei der Rückflußtemperatur des Lösungsmittels gehalten und anschließend bei Umgebungstemperatur filtriert wird, wonach das Filtrat im Vakuum bis zur Trockne aufkonzentriert wird; anschließend werden die Rückstände vereinigt und in 2 l Methylenchlorid wieder aufgelöst. Die organische Phase wird zweimal mit Wasser gewaschen und bis zur Trockne unter Erhalt von 1 kg Trockenextrakt verdampft, der der enzymatischen Peroxidation unterzogen wird.
  • Zweiter Schritt: Herstellung der Irone
  • 10 g Extrakt werden in 90 ml einer wäßrigen, mit Natriumborat gepufferten Lösung (0,01 M, pH 9,2) suspendiert. Man gibt 10 ml Dioxan und 0,17 g Soja-Lipoxygenase mit einer Aktivität von 6 U/mg, die im Handel von Fluka erhältlich ist, zu. Das Gemisch wird unter starkem Rühren 24 h bei 30 ºC in einer Sauerstoffatmosphäre gehalten. Anschließend wird das Reaktionsmedium einer Wasserdampfdestillation mit etwa 1 l Wasser unterzogen. Die übergegangenen Irone werden gaschromatographisch bestimmt. Man erhält so 0,77 g Irone pro Kilogramm Trockengewicht an anfangs eingesetztem Wurzelstockmaterial. Die chemische Oxidation ergibt ungefähr das gleiche Ergebnis.
  • Beispiel 2
  • Es wird wie in Beispiel 1 verfahren, wobei jedoch im zweiten Schritt Linolsäure in einer Konzentration von 10&supmin;³ M in das Reaktionsmedium eingebracht wird.
  • Man erhält so nach 24 h 1,8 g Irone, und wenn man die Umsetzung auf 48 h ausdehnt, erhält man 2,2 g Irone pro Kilogramm Trockengewicht an anfangs eingesetztem Wurzelstockmaterial.
  • Beispiel 3
  • 10 g Extrakt, die in 20 ml Dioxan gelöst sind, werden in 100 ml Phosphatpuffer (pH 8, 10 mM) mit 40 mg Meerrettichperoxidase und 0,3 umol Wasserstoffperoxid eingebracht. Die Peroxidase weist eine Enzymaktivität von 100 U/mg auf, wobei 1 Einheit l umol Guajakol entspricht, das pro Minute und Pro Mikrogramm Enzym umgewandelt wird. Nach 60 h werden die gebildeten Irone durch Wasserdampfdestillation abdestilliert. Es werden so 680 mg Irone pro Kilogramm Trockengewicht an Wurzelstockmaterial isoliert. Ohne Enzym entstehen nur 50 mg Irone pro Kilogramm.
  • Beispiel 4
  • Es wird wie in Beispiel 3 verfahren, wobei man aber außerdem 4,38 mg Ascorbinsäure in das Medium einbringt. In 24 h bilden sich dann 400 mg Irone pro Kilogramm, in 60 h 450 mg Irone pro Kilogramm.

Claims (9)

1. Verfahren zur Herstellung von Ironen, dadurch gekennzeichnet, daß die aus frischen Iris-Wurzelstöcken extrahierten Vorläuferverbindungen der Einwirkung eines peroxidierenden enzymatischen Systems unterzogen werden, das Sauerstoff und eine Lipoxygenase oder Wasserstoffperoxid und eine Peroxidase enthält.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym eine Lipoxygenase ist.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Reaktionsmedium außerdem eine ungesättigte aliphatische Carbonsäure enthält, die in Gegenwart der Lipoxygenase in ein Hydroperoxid übergeführt werden kann.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Reaktionsmedium Linolensäure oder Linolsäure enthält.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym eine Peroxidase ist.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß dem Reaktionsmedium ein grenzflächenaktiver Stoff oder ein weiteres Lösungsmittel zugegeben wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Lösungsmittel unter Dioxan und Tetrahydrofuran ausgewählt ist.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorläuferverbindungen mit einem lipophilen Lösungsmittel, das unter alkoholischen Lösungsmitteln, chlorierten Lösungsmitteln, aliphatischen und aromatischen Kohlenwasserstoffen sowie Gemischen dieser Lösungsmittel ausgewählt ist, aus Wurzelstöcken extrahiert werden.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Lösungsmittel unter Methanol, Ethanol und Methylenchlorid ausgewählt ist.
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