DE2401484A1

DE2401484A1 - Verfahren und mittel zur bestimmung der aktivitaet von isophosphorylasen im blut

Info

Publication number: DE2401484A1
Application number: DE19742401484
Authority: DE
Inventors: Manfred Dr Med Boehm; Georg Ernst Dr Krause; Horst Dr Rer Nat Will; Albert Wollenberger
Original assignee: Arzneimittelwerk Dresden GmbH
Current assignee: AWD Pharma GmbH and Co KG
Priority date: 1973-02-07
Filing date: 1974-01-12
Publication date: 1974-08-29
Also published as: GB1451004A; BG20730A1; HU169957B; SU976958A1; PL94983B1; DD101986A1; FR2327545B1; CS195756B1; FR2327545A1

Description

Verfahren und Mittel zur Bestimmung der Aktivität von Isophosphorylasen im Blut

Die Erfindung betrifft ein diagnostisches Mittel zum Nachweis und zur Bestimmung der Glykogenphosphorylase-Aktivität in extrazellulären Flüssigkeiten von Mensch und Tier. Ein derartiges diagnostisches Mittel insbesondere zur Erkennung von Herzmuskelschaden ist bisher nicht in Nutzung. Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Glykogenphosphorylase sind bekannt (1, 2). Sie betreffen den Nachweis der verschiedenen Reaktionsprodukte der durch das Enzym katalysierten Reaktion: Freisetzung von anorganischem Phosphat, Verlängerung der Glykosyl-Ketten des Glykogenmoleküls bzw. Bildung von Glukose-1-Phosphat. Für den Nachweis der jeweiligen Reaktionsprodukte liegen eine Vielzahl von Verfahrensweisen vor, die sich hinsichtlich ihrer Empfindlichkeit nur unwesentlich unterscheiden. Die bekannten Verfahren eignen sich somit mehr oder weniger zur quantitativen Erfassung der Enzymaktivität ohne die qualitativen Unterschiede der verschiedenen Isoenzyme der Phosphorylase zu berücksichtigen.

Der Nachweis von Aktivität der Phosphorylase, speziell der herzspezifischen Muskelphosphorylase im Blutserum des Menschen ist von großem diagnostischen Wert* da nach einer Zellschädigung (z.B. Herzinfarkt) dieses Enzym im Blutserum erscheint (3). Zweck der Erfindung ist es, die bisherigen Verfahren zur Glykogenphosphorylasebestimmung zu verbessern und qualitativ höhere Aussagen zu erhalten.

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Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Verfahren zur Bestimmung der Glykogenphosphorylase-Aktivität so zu gestalten, daß sowohl die Gesamtphosphorylase als auch bestimmte Isophosphorylasen nachzuweisen sind. Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß der Nachweis der Phosphorylase im angereicherten oder über eine Stärkesäule vorbehandelten Serum mit Hilfe einer empfindlichen Phosphatbestimmung in einem Halbmikroverfahren durchgeführt wird. Der Zusatz von spezifischen Verbindungen (z.B. Glukose-6-Phosphat, Desoxyglukose-6-Phosphat) kann zu einer Hemmung des herzspezifischen Enzyms führen, wodurch eine Differenzierung der Gesamtphosphorylasen in verschiedene Isophosphorylasen erreicht wird. Die Differenzierung der Isophosphorylasen wird weiterhin dadurch erreicht, daß die Isophosphorylasen im Blutserum nach der Behandlung an Stärke mittels eines elektropharetischen Verfahrens aufgetrennt werden und nach einer Inkubation in Gegenwart von Substraten anhand des Reaktionsproduktes Glykogen mittels Jod-Jod-Kalium-Anfärbung sichtbar gemacht werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich als Untersuchungsmethode zur sicheren Diagnose des Herzmuskelinfarktes, was mit den bisherigen Bestimmungsverfahren nichtherzspezifischer Enzyme nicht möglich ist. Im Blutserum von gesunden Personen kommt keine meßbare Aktivität von Phosphorylase vor. Aus diesem Grunde ist prinzipiell jeder Nachweis von Phosphorylase im Blutserum von infarktverdächtigen Personen von diagnostischer Bedeutung (Verfahren A); das Auftreten der herzspezifischen Muskelisophosphorylase wird mittels Verfahren B nachgewiesen.

Anhand folgender Ausführungsbeispiele wird die Durchführung der Phosphorylase-BeStimmung nach Verfahren A und B sowie die Zusammensetzung und Anwendung des Bestimmungsmittels beschriebenr

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Verfahren A: Beispiel 1:

Mittel zur Phosphorylase-Bestimmung mit folgender Zusammensetzung:

Lösung-1: 0,1 m Natriumfluorid

0,001 m Natrium-ß-Glyzerophosphat, pH 6,1 0,015 m Merkaptoäthanol

Lösung 2: 0,04 m Natrium-ß-Glyzerophosphat, pH 6,8 0,001 m Äthylendiamintetraessigsäure Ό,015 m Merkaptoäthanol

Lösung 3r 0,04 m Glyzylglyzin, pH 6,8 0,01 m Merkaptoäthanol
0,008 m ÄthylendiamintetraessigsMure

Lösung 4: 3,3 % Glykogen

Lösung 5: 0,083 m Glukose-1-Phosphat

0,005 m Adenosinmonophosphat

Serum wird mittels Membranfiltration im Verhältnis 2:1 bis 3:1 konzentriert bzw. mit unlöslicher Stärke vorbehandelt. Im letzteren Fall werden 3-4 ml Serum bei 4 ⁰C auf eine Stärkesäule (2x1 cm), die mit Lösung 1 äquilibriert ist, aufgetragen; anschließend wird 3 mal mit Je 3 ml Lösung 1 gewaschej
eluiert.

gewaschen und mit 2 ml Lösung 2 bei 30 ⁰C die Phosphorylase

Es werden 1 Teil des konzentrierten Serums mit 1 Teil Lösung 3 gemischt; zu 5 Teilen dieser Mischung bzw. des Eluats der Stärkesäule werden 3 Teile von Lösung 4 und 2 Teile von Lösung 5 gegeben. Nach 60minütiger Inkubation bei 37 ⁰C erfolgt die Denatuierung mit Trichloressigsäure und die Analyse des Reaktionsproduktes Phosphat nachbekannten Verfahren (s. 4).

Beispiel 2:

Verfahren nach Beispiel 1, nur erfolgt die Bestimmung der Enzymaktivität in Gegenwart von spezifischen Hemmstoffen

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einer Isophosphorylase, so daß sich aus der Differenz zur Bestimmung nach Beispiel 1 der Anteil der herzspezifischen Muskelphosphorylase-Aktivität berechnen läßt.

Verfahren Bg

„Mittel zur Auftrennung der Isophosphorylasen und Nachweis der Enzymaktivität mit folgender Zusammensetzungr

Lösung 1t 0,042 m Trie(hydroxymethyl)-aminomethan 0,001 m Athylendiaminotetraessigsäure 0,049 m Borsäure, pH 8,2

Lösung 2: 0,03 m Glukose-1-Phosphat

0,002 m Adenosinmonophosphat

0,002 m Natrium-ß-Glyzerophosphat, pH 6,8

0,002 m Äthylendiaminotetraessigsäure

0,001 m Merkaptoäthanol

0,1 m Natriumfluorid

Lösung 3: 0,Q1 m Jod

0,014 m Kaliumiodid

ÄLiquate des phosphorylasehaltigen Eluats der Stärkesäule (s. Verfahren A) werden im Verhältnis 2:1 mit 1,2 m Saccharose verdünnt und mittels diskelektrophoretischer Technik in Isophosphorylasen aufgetrennt. Das Trenngel (5 % Akrylamid, 0,2 % Ν,Ν'-Methylbisakrylamid) enthält 0,1 % Glykogen und ist mit Lösung 1 gepuffert, die gleichzeitig den Elektrodenpuffer darstellt. Nach Inkubation der enzymtragenden Gele in Lösung 2 werden die an dem im Gel einpolymersisierten Glykogen entstandenen amyloseartigen Seitenketten durch Lösung 3 sichtbar gemacht.

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Claims

—5-Patentansprüche:

Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von Isophosphoryliasen im Blut, dadurch gekennzeichnet, daß angereichertes oder mit Stärke vorbehandeltes Blutserum zur Bestimmung der Enzymaktivität anhand von entstehenden Reaktionsprodukten wie anorganisches Phosphat oder amyloseartige Seitenketten des Glykogens eingesetzt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das angereicherte mit einer Glyzylglyzin—, Merkaptoäthanol- und Äthylendiamintetraessigsäure-haltigen Lösung im Verhältnis 1r1 gemischte oder das über eine Stärkesäule durch Adsorption und Waschen mit einer Natriumflvori 1 Natrium-ß'-GlyzerophOsphat— und Merkaptoäthanol-haltigen Lösung (pH 6,1 4°O sowie Elution der Phosphorylase bei 30 ⁰C und pH 6,8 mit einer Lösung gleicher Bestandteile vorbehandelte Serum im Verhältnis 5:3 mit einer Glykogenhaltigen Lösung gemischt wird, 2 Teile einer Glukose-1-Phosphat-, Ad'enosinmonophosphat-haltigen Lösung, die zusätzlich einen Phosphorylasehemmstoff enthalten kann, zugegeben, 60. Minuten inkubiert, danach mit Trichloressigsäure denaturiert und abschließend der Phosphatgehalt in bekannter Weise nach Reduktion des Phosphomplybdat— komplexes optisch festgestellt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Blutserum auf einer Stärkesäule nach Anspruch 2 vorbehandelt wird, das erhaltene Eluat mit 1,2 m Saccharose im Verhältnis 2:1 verdünnt auf ein 0,1 % Glykogen enthaltendes mit einer Tris(hydroxymethyl)-aminomethan-,

Athylendiamintetraessigsäure- und Borsäure-haltigen Lösung gepuffertes Acrylamid-Trenngel aufgegeben, diselektrophoretisch getrennt und abschließend nach einer Inkubation

in einer wässrigen Lösung, die Glukose-1-Phosphat, Adenosinmonophosphat, Natrium-fi-Qlyzerophosphat, Äthylendiamintetraessigsäure, Merkaptoäthanol und Natriumfluorid enthält, die Bildung, der am Glykogen entstandenen

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amyloseartigen Seitenketten durch Jod-Jod-Kalium-Anfärbung sichtbar gemacht wird.

4,, Mittel zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagenzien in wässriger " Lösung folgender Konzentrationsbereiche vorliegen: Lösung 1: (pE 5,5 - 7,0; O - 5⁰C). 1 FDl/1 - 1Q~³ M/l Natriumf luorid 0,1 Mol/l - 10"⁴ 1/1 iiatrium-ß-Glyzerophosphat 0,1 Mol/l - 10~⁴ M/l Merkaptoäthanol

Lösung 2: (pH 6,0 - 7,5; 10 - 35⁰C)-0,1 Mol/l - ΙΟ"⁴ Mol/l Natrium-ß-Glyzerophosphat 1 Mol/l - 10 Mol/L Äthylendiamintetraessigsäure Q,1 Mol/l - 10~⁴ M/l Merkaptoäthanol

Lösung 3: (pH 6-7,5)

1 Mol/l - *0~3 Mol/l Glyzylglyzin 0,1 Mol/l - 10~⁴ Mol/l Merkaptoäthanol

1 Mol/l - IG Mol/l Äthylendiamintetraessigsäure

Lösung 4:

1 Mol/l - 10~%ol/l Glukose-1 -Phosphat

0,1 Mol/l - 10 Mol/l Adenosinmonophosphat

Lösung 5:

100 g - 0,1 g/l Glykogen

Lösung6: (pH 7 - 9)

1 Mol/l - 10 Mol/l Tris(hydroxylmethyl)-aminomethan 1 Mol/l - 10 Mol/l Äthylendiamintetraessigsäure 5" Mol/l - 1O^-"³ Mol/l Borsäure

Lösung 7: (pH 6-7,5)

1 Mol/l - 10~³ Mol/l Glukose-1-Phosphat

0,1 Mol/l - 10"^ Mol/l Adenosinmonophosphat

0,1 Mol/l - 10~⁴ Mol/l Natrium-ß-Glyzerophosphat

1 Mol/l - 10 Mol/l Äthylendiamintetraessigsäure

0,1 Mol/l - 10"⁴ Mol/l Merkaptoäthanol

1 Mol/l - 10~³ Mol/l Natriumfluorid

Lösung 8:

O₅O5 Mol/l - 10~⁴ Mol/l Jod

I Mol/l ~ 1ΓΓ³ Mol/l Kaliumiodid

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Literatur:

1. Pfannemüller, B.r In: Handbuch der Physiologisch- und pathologisch-chemischen Analyse (Hrg. Hoppe-Seyler u. Thierfeider), Springer Verlag, Berlin-Göttingen-Heidelberg, Band VI/B, S. 225-253 (1966). ^{Λ ;} ;/;/!:,

2. Will, H. und R.-G. Krauler Acta bioi .med.german. 28, 919-933 (1972).

3. Krause, E.-G., H. Bcihm, H. Will, und A. Wollenbt^fcer: Dtsch. Ges.wesen 27« 903 (1972).
4. Weil-Malherbe, H.r Ins Handbuch der Physiologisch- und pathologisch-chemischen Analyse (Hrg. Hoppe-Seyler u. Thierfeider), Springer Verlag, Berlin-Göttigen-Heidelberg, Band III/1, S. 457-538 (1955).

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