DE2844313A1 - Bestimmung von isoenzymen - Google Patents

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DR. PHIL. FREi)A WUESTHOFF (1927-19J6) DIPL.-ING. GERHARD PULS (19J2-I971) DIPL.-CHEM. DR. E. FREIHERR VON PECHMANN DR.-ING. DIETER BEHRENS DIPL.-ING.; DrPL.-1FIRTSCH.-ING. RUPERT GOETZ

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Bestimmung von Isoenzymen

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WUESTHOFF-ν. PECHMANN-BEHREN S-GOETZ

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Beschreibung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins von Isoenzymen unterschiedlicher elektrischer Ladung, das darin besteht, daß man die Isoenzyme auf einer Anionen-Austauschersäule chromatographisch trennt, die jeweils eines der zu bestimmenden Isoenzyme enthaltenden Fraktionen getrennt eluiert und aufsammelt, jede der Fraktionen anwendet, um ein trockenes Reagens für das Isoenzym in Abwesenheit eines Substrats für das Isoenzym zu rekonstituieren, zu dem rekonstituierten Reagens ein Substrat für das Enzym zugibt und das rekonstituierte Reagens und das Substrat spektrophotometrisch analysiert.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Isoenzymen unterschiedlicher elektrischer Ladungen.

Im allgemeinen liegen Enzyme in verschiedenen Formen vor, die für bestimmte Organe spezifisch sind. Diese vielen Formen von Enzymen, die allgemein als "Isoenzyme" bezeichnet werden, besitzen die gleiche Aktivität in jedem Organ, haben das gleiche mittlere Molekulargewicht, aber unterscheiden sich in ihren Molekülladungen oder in ihren elektrischen Ladungen. In der Vergangenheit wurde die Identifizierung von verschiedenen Isoenzymen erreicht durch Trennung der ver-

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schiedenen Isoenzyme durch. Elektrophorese auf einem Trägermedium, wie einem Papier- oder Gelmedium.

Für Lactatdehydrogenase (LDH), die zur Diagnose von Erkrankungen verschiedener Organe herangezogen wird, hat es sich durch elektrophoretische Analyse gezeigt, daß sie in fünf unterschiedlichen (multiple) Formen in Blutserum vorliegt. ( E.S. Vesell et al, Proc.Soc.Esp.Biol.Med., 94, 96 (1957); T. Wieland et al, Biochem.Z., 329, 112 (1957); F. Wroblewski et al, Ann. N.Y. Acad. Sei., 94, 912 (1961); R. Richterich et al, Clin. Chem. Acta, 8, 178 (1963); und E.D. Wachsmuth et al, Biochem. Z., 336, 545 (1963)). Diese verschiedenen Formen werden im allgemeinen als LDH-, LDHp, LDHv, LDH. und LDH₅ bezeichnet, wobei LDH- die Form mit der höchsten negativen Ladung und LDH,- die Form mit der geringsten negativen Ladung ist und die anderen Formen entsprechend in ihrer Ladung verschieden sind. Bei Untersuchung von Gewebeauszügen und Blutsera und Bestimmung (correlation) nicht nur der Menge sondern auch, der Form von LDH hat es sich gezeigt, daß LDH für den Herzmuskel spezifisch ist und der Gehalt an LDH., und auch an LDHp im Blutserum bei Herzinfarkt erhöht ist (CR. Roe et al, J. Lab. Clin. Med., 80, 577 (1972)). Auf ähnliche Weise hat es sich gezeigt, daß LDHc für die Leber spezifisch ist und der Gehalt an LDHp- im Blutserum bei Lebererkrankungen erhöht ist. ( R.J. Wieme et al, Ann. ü.Y. Acad. Sei., 94, 898 (1961); L. Cohen et al, Med. Clin. Ii.Am. , 50, 193 (1966); I.N. Ramdeo et al, Am. J. Gastroenterol 55, 459 (1971); B.E. Sobel et al, Circulation, 45, 471 (1972)).

Die elektrophoretische Analyse hat auch gezeigt, daß Kreatinphosphokinase (CPK) in drei Formen vorliegt, CPK-MM, CPK-MB und CPK-BB (D.M. Dawson et al, Biochera.Biophys.Res. Comm., 21, 346(1965)), wobei diese Formen jeweils zunehmende negative Ladungen besitzen. Es hat sich gezeigt, daß CPK-MM sich in der Skelettmuskulatur, dem Herzen und der Lunge findet, sich CPK-MB hauptsächlich im Herzen und CPK-BB hauptsächlich im Hirn und dem Magen-Darm-Trakt findet. ( Van

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Der Veen et al, Clin. Ciiem. Acta, 13, 312 (1966)). Untersuchungen dieser CPK-Isoenzymformen haben gezeigt, daß der Gehalt an CPK-MM erhöht ist bei Patienten mit schwerem Muskeltrauma, während Patienten mit Herzinfarkt erhöhte Gehalte sowohl an CPK-MM als auch CPK-MB aufweisen. ( CR. Roe et · al, aaO, und Van Der Veen et al, aao).

Ferner hat die Analyse von sauerer Phosphata.se (AP) gezeigt, daß AP in vielen Formen vorliegt und eine Form, nämlich prostatische saure Phospha.tase (im folgenden als PAP abgekürzt), spezifisch ist für Erkrankungen der Prostata. ( W.H. Fishman et al, J. Biol. Chem., 200, 89 (1953), W.H. Fishman et al, J. Clin. Invest., 32, 1034 (1953), L.T. Yam, Am. J. Med., 56, 604 (1974) etc.).

Aufgrund der diagnostischen Bedeutung ist die Wichtigkeit der Isolierung, und Bestimmung des Gehaltes an verschiedenen Isoenzymen in Gewebeauszügen und Blutsera, wie sie z.B. oben beschrieben, sind, klar ersichtlich. Ferner ist die Notwendigkeit eine£^mwesentlichen vollständigen Trennung in die verschiedenen Formen für die Analyse offensichtlich für die diagnostische Genauigkeit von großer Bedeutung.

Folglich sind Verfahren, durch die die verschiedenen Formen von Isoenzymen, wie die oben angegebenen und diskutierten Isoenzyme, getrennt werden können, um diagnostische Informationen zu erhalten, wichtig zur Anwendung derartiger Isoenzyme als diagnostische Hilfsmittel.

Die Analyse von Isoenzymen von Kreatinphosphokinase hat sich als außerordentlich nützlich erwiesen zur Diagnose von Herzinfarktbildung. Das MB-Isoenzym von Kreatinphospho-r kinase findet sich in größeren Mengen nur im Herzgewebe, und eine hohe Gewebespezifität wird erzielt durch eine quantitative Bestimmung dieses Isoenzyms im Serum. Die Bestimmung des MB-Isoenzyms von Kreatinphosphokinase i . Serum führt zu einer deutlich verbesserten Spezifität der Diagnose

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von Herzinfarkt im Vergleich zu Messungen des Gesamtkreatins im Serum. Kreatinphosphokinase MB ist das nach, einem Herzinfarkt am schnellsten auftretende Enzym im Serum und auch das am schnellsten wieder verschwindende. Es kehrt üblicherweise innerhalb von 48 Stunden nach dem Herzinfarkt wieder auf normale Werte zurück.

Obwohl Bestimmungen von Kreatinphosphokinase MB-Isoenzym spezifisch eine MyocardSchädigung anzeigen können, waren derartige Bestimmungen bisher beschränkt auf den Nachweis von MB-Isoenzym bei Patienten mit deutlich erhöhter Kreatinphosphokinaseaktivitat, da die bekannten elektrophoretischen Verfahren nicht ausreichend empfindlich waren, um die geringe MB-Isoenzymaktivität in Sera mit normaler oder leicht über das Normale erhöhter Gesamtkreatinphosphokinaseaktivität zu bestimmen. So waren bisher die Bestimmungen auf Patienten mit großen Infarkten und verhältnismäßig hoher Zunahme der Enzyma.ktivitäten beschränkt, bei denen es sich genau um die Fälle handelt, in denen MB-Isoenzymbestimmungen häufig für die korrekte Diagnose nicht entscheidend sind.

Probleme bei der Diagnose von akutem Myocardinfarkt treten üblicherweise in Fällen auf, in denen die Menge an necrotischem Gewebe verhältnismäßig klein ist. In diesen Situationen können elektrocardiographische Veränderungen minimal oder vorübergehend sein, und das klinische Erscheinungsbild kann atypisch sein. Unter solchen Umständen ist die Bedeutung einer leicht erhöhten Gesamtkreatinphosphokinaseaktivität im Serum fraglich, und in der Vergangenheit wurden derartige Werte häufig ignoriert oder intramuskulären Injektionen zugeschrieben. Eine quantitative Bestimmung des Isoenzyms MB hat zu einer feineren Auflösung dieser zweideutigen Diagnosebereiche geführt, und mit verbesserten analytischen Verfahren kann eine diagnostische Genauigkeit erzielt werden, selbst wenn der Gesamtkreatinphosphokinasewert normal oder nur leicht über das Normale erhöht ist.

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Eine größere Empfindlichkeit der Isoenzym-MB-Bestimmungen kann sich, als wertvoll auch, auf anderen Bereichen als der Diagnose von akutem Herzinfarkt erweisen. Der Befund eines ständig erhöhten Isoenzym-MB-Wertes im Serum von Patienten mit chronischen Vorhof-lachyarrhythmien legt nahe, daß unter bestimmten Bedingungen eine Nekrose des Myocardgewebes nicht als plötzliches Ereignis auftreten kann, sondern kontinuierlich vorsiehgeht. Es können andere Krankheitszustände, wie Blutandrang im Herzen (congestive heart failure) oder Herzmuskelerkra.nkungen (Cardiomyopathy) eintreten, bei denen eine geringe aber kontinuierliche Zerstörung von Myocardzellen auftritt.

Neben Patienten mit langanhaltendem Vorhofflimmern, Blutandrang im Herzen und Herzmuskelerkrankungen wurde eine abnorm hohe MB-Isoenzyma.ktivität nachgewiesen bei Patienten mit Muskeldystrophie und Polymyositis. Obwohl alle diese Erkrankungen Isoenzym-MB-Werte ergeben, die zu einer Fehldiagnose eines akuten Herzinfarkts führen können, scheinen sie leicht unterscheidbar zu sein, wenn MB-Isoenzym täglich bestimmt und die Änderungen über die Zeit verfolgt werden.

Der Ursprung von MB-Isoenzym bei diesen Muskelerkrankungen ist nicht bekannt, die wahrscheinlichste Quelle ist jedoch die Skelettmuskulatur, da. Spuren (bis zu 1 ^ der Gresamtkreatinphosphokinaseaktivität) von MB-Isoenzym in Extrakten von Skelettmuskeln gefunden wurden, wenn große Mengen analysiert wurden.

Die Analyse der Isoenzyme von Krea.tinphosphokinase wurde in erster Linie mit Hilfe von Verfahren durchgeführt, bei denen die unterschiedliche ladung der Isoenzyme ausgenutzt wurde. Elektrophorese unter Anwendung einer Vielzahl von Trägermedien, wie Celluloseacetat und Agarose, wurde weitgehend angewandt (Somer et al, Clin. Chem. Acta, 36,531 (1972); Roberts et al, Am. J. Cardio., 33, 650 (1974)). Zahlreiche Berichte haben jedoch die inhärenten Ungenauigkeiten der quantitativen Kreatinphosphokinase-MB-Bestimmung

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aus Elektroplioresemustern aufgrund einer Substraterschöpfung während des Anfärbens gezeigt, die zu einer'Überbewertung des MB-Bandes führen kann. Die Anwendung eines Ionenaustauscherharzes zur Trennung von Kreatinphosphokinase-Isoenzymen im Serum wurde erstmals 1967 beschrieben, wobei DEAE-Sephadex (Pharmacia, Inc.) beim ansatzweisen Verfahren angewandt wurde, um die Hirn- und Muskelformen zu bestimmen (Dubo et al, Lancet, Okt. 7, 1967, S. 743). In anschließenden Arbeiten wurde die Anwendung dieses Harzes für die Analyse von Kreatinphosphokinase-Isoenzymen verfeinert (Ta.kahashi et al, Glin. Chem. Acta, 38, 285 (1972)) und an klinische Routineuntersuchungen für Kreatinphosphokinase MB-Bestimmungen angepaßt (Mercer, Glin. Chem., 20, 36 (1974). Die Ionenaustauscherverfahren bieten einige Vorteile gegenüber der Elektrophorese einschließlich einer größeren Empfindlichkeit einer verbesserten MB-Bestimmung und der Anwendung von Standardlaborspektrophotometern (Yasminch et al, Clin. Chem., 21, 381 (1975); Mercer et al, Clin. Chem., 21, 1088 (1975)), wie sie für kinetische UV-Analysen geeignet sind.

Das größte Problem bei der elektrophoretischen Trennung von Kreatinphosphokinase-Isoenzymen ist eine Überbewertung von MB-Isoenzymen aufgrund einer Unterbewertung von MM-Isoenzym und eine Inaktivierung von deutlichen Mengen von MB-Isoenzym (20 bis 50 °/o) durch die in den Trägern entwickelte Wärme, wenn die Elektrophorese bei Raumtemperatur durchgeführt wird. Quantitativ scheint die untere Grenze für einen visuellen Nachweis bei 40 E/l zu liegen und bei Elution bei ungefähr 5 E/l.

Pur lonenaustauscherzwecke ist Serum eine außerordentlich unreine Probe, sodaß viele der Ionenaustauscherverfahren für die Bestimmung von MB-Isoenzym an einer möglicherweise geringen Gewinnung und schlechten Trennung leiden. Diese Probleme können einer Sättigung von Bindungsstellen zugeschrieben werden, und bei den meisten Verfahren werden jetzt Verdünnungen angewandt, um diese Schwierigkeit zu überwinden. E3 können auch größere Mengen an Ionenaustauscher angewandt

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werden, aber das erfordert ungünstigerweise auch größere Mengen an Puffer für die Elution und führt folglich ebenfalls zu einer größeren Verdünnung. Das Problem der Verdünnung kann, wenn es nicht vermieden wird, überwunden werden durch ein erneutes Einengen mit speziellen Vorrichtungen (Amicon Corp. Minicon B-15 concentrator). Diese Arbeitsweise kann jedoch bei klinischen Routineuntersuchungen unbequem sein, insbesondere da diese Vorrichtungen zum Einengen dazu neigen, unzuverlässige Mengen zu ergeben.

Jedes Verfahren zur Bestimmung von Kreatinphosphokinase-Isoenzym für klinische Labors sollte nach vier Kriterien untersucht werden: Auftrennung, Zuverlässigkeit, Empfindlichkeit und Effektivität, Die Auftrennung ist die Möglichkeit, jede Fraktion einzeln genau zu messen, ohne eine gegenseitige Störung bzw. Verunreinigung. Die Zuverlässigkeit ist die Möglichkeit, eine gleichmäßige Auftrennung wiederholt für einen breiten Bereich von Proben zu erreichen. Die Empfindlichkeit ist die Grenze der Nachweisbarkeit und die Effektivilät ist das Verhältnis der Kapazität zur Einfachheit und Schnelligkeit.

Die elektrophoretischen Verfahren zeichnen sich durch ihre Auflösung und Zuverlässigkeit aus, wobei die Fraktionen klar sichtbar sind und die Gefahr eines irrtümlich positiven Wertes gering ist. Diese Verfahren sind jedoch relativ ineffizient, erfordern Erfahrung und mindestens 30 Minuten Zeit, Die Elution von Agarose eignet sich nicht für Routinelaborverfahren. Ohne Elution sind die Verfahren unempfindlich.

Zur Zeit übliche Ionenaustauscherverfahren ergeben eine gute Auftrennung und Zuverlässigkeit, es kann jedoch zu einer Überladung des Austauschers kommen, und die Verfahren werden durch den pH-Wert, die Ionenstärke, die Geometrie der Säule und Störungen der Durchflußgeschwindigkeit nega.tiv beeinflußt, Faktoren, die möglicherweise zu einer nicht erkannten Störung der Auflösung und Zuverlässigkeit führen. Ionen-

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austauscherverfahren aind trotzdem möglicherweise empfindlicher und wirksamer als elektrophoretisch^ Verfahren.

Es wird angenommen, daß bei dem Verfahren der Ionenaustauscher-Chromatographie die Molekularladung der Isoenzyme ausgenutzt wird, um die Isoenzyme reversibel an ein Ionenaustauschermaterial zu binden, wobei anschließend eine selektive Elution und ein Sammeln der Fraktionen möglich wird, aufgrund der Veränderungen der Umgebung, der das Ionenmaterial, an das die Isoenzyme gebunden sind, ausgesetzt wird. Speziell sind die Isoenzyme solcher Enzyme wie Milchsäuredehydrogenase, Kreatinphosphokinase und sauere Phosphatase negativ geladen und werden an schwach basische Anionenaustauscherharzen gebunden. Allgemein wird bei der Ionenaustauscher-Chromatographie eine Probe von Blutserum oder Gewebeextrakt, die die anfangs vorhandenen Isoenzyme enthält, auf eine Säule aufgebracht, die mit dem Ionenaustauschermaterial beschickt ist. Indem die Probe durch das Ionenaustauschermaterial in der chromatographischen Säule hindurchgeht, werden die Isoenzyme aufgrund ihrer negativen Ladung an dem Ionenaustauscherharz an die aktiven Stellen des Harzes gebunden, wobei der Grad der Bindung von der Ladungsdichte a.bhängt. Um die vorhandenen Isoenzymkomponenten in einer getrennten Isoenzymform zu isolieren, werden die an das Ionenaustauscherharz gebundenen Isoenzyme von diesem Harz eluiert durch Veränderung der Ionenstärke und des pH-Werts der Umgebung. Es tritt eine selektive Verdrängung (bzw. Elution) eines bestimmten Isoenzyms oder von Isoenzymen unter Ausschluß von anderen Isoenzymen ein. Um die Isoenzyme in getrennter Form zu gewinnen, wird das Ionenaustauscherharz mit unterschiedlichen Lösungen steigender Ionenstärke und/oder sinkendem pH-Werts gewaschen, d.h. das Ionenaustauscherharz wird nacheinander mit verschiedenen Salzlösungen gewaschen, die eine zunehmende Konzentration und abnehmende pH-Werte besitzen. Aufgrund der stufenweisen Zunahme der Ionenstärke wird eine selektive Verdrängung (Elution) der Isoenzyme in der Reihenfolge ihrer Ladungs- * austauscher

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dichte erzielt, da ihre Bindungsstärke zu dem Ionenaustauscherharz verringert wird. Dadurch werden die am schwächsten negativ geladenen Isoenzyme zuerst eluiert und anschließend nacheinander in der entsprechenden Reihenfolge durch Elution(en) in Abhängigkeit der Reihenfolge der Zugabe der einzelnen Elutionslösungen nach und nach die stärker negativ geladenen Isoenzyme später elxiiert.

Die Ionenaustauscher-Säulenchromatographie wurde in der Vergangenheit angewandt, um sowohl CPK- als auch LDH-Isoenzyme in ihre einzelnen Isoenzymformen aufzutrennen. Speziell beschreibt K. Takahashi et al in Olin. Chem. Acta, 38, 285 (1972) ein Verfahren, bei dem Gewebeextrakt und Blutserum einer Gradientenelution bei der Ionenaustauscher-Chromatographie unter Verwendung von DEAE-Sephadex A-50 unterworfen werden, um CPK-Isoenzyme zu erhalten. Bei diesem Verfahren wurden 5 ml Fraktionen analysiert, wobei insgesamt 50 Fraktionen angewandt wurden, um eine Probe von anfangs 1 ml zu fraktionieren. Die beschriebene Gradientenelution bei der Ionenaustauscher-Chromatographie wurde durchgeführt mit Hilfe eines Salzgradienten-Verfahrens unter Anwendung einer gepufferten Natriumchloridlösung mit einer Konzentration im Bereich von 0 bis 0,5m und einem pH-Wert von 7,5. Leider ist das von Takahashi et al beschriebene Verfahren mühsam und zeitraubend, da eine Gradientenelution erforderlich ist, wobei viele Fraktionen aufgefangen und auf das Vorhandensein von CPK-Isoenzymen analysiert werden müssen. Tatsächlich wurden in vielen Fällen 50 verschiedene Fraktionen für die Analyse gesammelt.

D.W. Mercer in Clin. Chem., 20, 36 (1974) und ibid,

20, 895 (1974) und spätere Forscher (M.A. Varat et al, Circulation 51, 885 (1975) und D.A. Nealon et al, Clin. Chem.,

21, 392 (1975)) beschreiben ein Verfahren unter Anwendung einer stufenweisen oder diskontinuierlichen Ionenaustauscher-Chromatographie zur Fraktionierung von CPK-Isoenzymen. Die Ionenaustauscher-Chromatographie wurde an einer mit DEAE-Sephadex A-50 Ionenaustauscherharz gefüllten chromatographi-

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sehen Säule durchgeführt, wobei eine Serumprobe aufgebracht und anschließend mit einer Reihe von 2 oder 3 EluenstLen eluiert wurde. Bei dem Verfahren nach Mercer wurden gepufferte wäßrige Lösungen mit 0,1m bzw. 0,2m Natriumchlorid jeweils mit einem pH-Wert von 8 angewandt und in einigen Fällen ein drittes Eluens, umfassend eine gepufferte wäßrige Lösung mit 0,5m Natriumchlorid mit einem pH-Wert von 7,0. Bei der Fraktionierung wurde die ursprüngliche Probe,im allgemeinen 1 ml, fraktioniert, wobei mehrere einzelne 1 ml Fraktionen aufgefangen wurden. In jeder dieser Fraktionen wurde dann die CPK-Aktivität bestimmt. Diese diskontinuierliche Ionenaustauscher-Chromatographie-Fraktionierung von CPK-Isoenzymen führte zur Bildung von einigen 10 einzelnen Fraktionen, von denen jede analysiert und die CPK-Aktivität bestimmt werden mußte. Als Endergebnis liefert das diskontinuierliche Ionenaustauscher-Chroma.tographie-Verfah.ren eine Kurve der Werte für die CPK-Aktivität für jede der Fraktionen gegen die Fraktionsnummer. AuchhLer ist, wie bei dem Gradientenverfahren nach Takahashi et a.l, die Analyse einer großen Anzahl von Fraktionen erforderlich, um dieses Verfahren zur Analyse von CPK-Isoenzymen anzuwenden.

Ferner haben aufgrund der Schwierigkeiten bei der elektrophoretischen Analyse Forscher wie L.E. Nathan et al, Clin. Chem., 19, 1Ό36 (1973) Verfahren zur Ionenaustauscher-Chromatographie auf DEAE-Sephadex für LDH-Enzyme entwickelt und beschrieben, um LDH₁- zur Bestimmung als diagnostisches Hilfsmittel bei Lebererkrankungen anwenden zu können.

In der US-PS 4 013 513 ist ein Verfahren zur Trennung und Isolierung von Fraktionen beschrieben, enthaltend Isoenzyme von einer Probe eines leberextraktes oder von Blut-

serum, umfassend eine chromatographische Trennung mit Hilfe einer Ionenaustauschersäule(der Probe, die das Isoenzym enthält) in eine erste Fraktion, enthaltend das Leberisoenzym von Milchsauredehydrogena.se, und eine zweite Fraktion, enthaltend die Myocard- bzw. Herzisoenzyme von Milchsäuredehydrogena.se, das Myocardisoenzym von Kreatinphosphokinase,

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(das MB-Isoenzym) und Prostansäurephosphatase, wobei die Probe über eine Ionenaustauschersäule aus einem schwach basischen Anionenaustauscherharz gegeben und anschließend eluiert und die erste und zweite Fraktion gesammelt werden. In dieser Druckschrift sind jedoch keine Einzelheiten bezüglich der Methoden der Sammlung des Eluats und Analyse angegeben, außer daß die Überwachung mit üblichen spektrophotometrischen Verfahren zur Bestimmung der Isoenzymaktivität durchgeführt werden kann.

Bei Untersuchung des Standes der Technik, für den die oben angegebenen Druckschriften repräsentativ sind, kann man sehen, daß, obwohl die Trennung durch Ionenaustauscher-Chromatographie einen deutlichen Vorteil gegenüber elektrophoretischen Verfahren darstellt, bei den bekannten Verfahren der Trennung und Isolierung der klinisch wichtigen CPK-Isoenzyme und LDH-Isoenzyme durch Ionenaustauscher-Chromatographie noch Probleme bestehen, da nach diesen bekannten Verfahren die Abtrennung der einzelnen Isoenzyme im allgemeinen eine große Anzahl von Proben erfordert, die anschließend zur Bestimmung der CPK-- und LDH-Isoenzymgehalte untersucht werden müssen, und aufgrund der in der Literatur beschriebenen damit verbundenen Probleme haben die Verfahren zur Sammlung von Fraktionen verschiedener Isoenzyme geführt, die für die klinische Auswertung, insbesondere für Herζerkrankungen, nicht getrennt und gesammelt werden müssen. Außerdem'ha.ben die in der Literatur beschriebenen Verfahren unter Anwendung von Ionenaustauscher-Chromatographie zur Trennung von CPK- oder LDH-Enzymen nicht nur zur Bildung von vielen einzelnen Fraktionen geführt sondern auch zu einer außerordentlich starken Verdünnung der Eluate,aufgrund der aufeinanderfolgenden Elution, die bei den beschriebenen Verfahren erforderlich ist,oder aufgrund der Herstellung der Eluate für übliche spektrophotometrische Verfahren.

Es wurde nun ein Verfahren entwickelt zur Bestimmung kleiner Mengen eines Isoenzyms durch Elution des Isoenzyms aus einer kleinen Ionenaustauschersäule, sodaß das Isoenzym

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direkt in ein Glas mit dem Reagens fließt, von dem das Substrat weggelassen worden ist. Die Bestimmungsreaktion wird eingeleitet durch Zugabe eines kleinen Anteils konzentrierten Substrats zu dem Eluat-Reagens. Bei diesem Verfahren können geringe Isoenzymmengen nachgewiesen werden, da das enzymhaltige Eluat nicht wie bei üblichen Bestimmungsverfahren wesentlich verdünnt wird.

Bei den bekannten Verfahren der Eluierungdes interessierenden Isoenzyms aus einer Ionena.ustauschersäule wurde das Isoenzym zu einem Eluat verdünnt, wo es zu stark verdünnt war, um nach üblichen Verfahren bestimmt werden zu können. Die bekannten Verfahren umfaßten die Zugabe eines kleinen Anteils der Isoenzymlösung zu einer Lösung,enthaltend das Enzymsubstrat und notwendige Reagentien, um die durch das Enzym katalysierte Reaktion überwachen zu können.

Dieses Verfahren führt dazu, daß die Reaktion unmittelbar nach Zugabe der Isoenzymlösung zu dem Enzymsubstrat-Reagens-G-emisch beginnt.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird der gesamte Anteil des Eluats, enthaltend das interessierende Isoenzym, als Probe angewandt und nicht nur ein kleiner Teil davon. Außerdem wird ein Bestimmungsreagens angewandt, das die gesamten für die Bestimmung der Enzymaktivität erforderlichen Bestandteile enthält, mit Ausnahme des Hauptsubstrats für das Enzym, z.B. wird bei der Bestimmung von Kreatinphosphokinase zunächst Kreatinphosphat weggela.ssen. Das Reagens wird in trockener Form, z.B. in lyophilisierter Form, in einem einzigen Behälter zur Verfügung gestellt und alle Bestandteile des Reagenses sind in ausreichender Menge vorhanden, um optimale Konzentrationen an jedem Bestandteil zu erzielen, wenn sie in einem'Volumen gelöst werden, das gleich ist dem Volumen des gesamten Teils des Eluats, das das interessierende Isoenzym enthält. Da.s hauptsächliche Substrat, z.B. Kreatinphosphat für Kreatinphosphokinase, wird getrennt in einer solchen Konzentration zugegeben, daß ein kleiner Anteil davon zu dem Reagens zugesetzt werden

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kann und zu einer Konzentration an primärem Substrat in dem Reagens führt, die für die Bestimmung der biologischen Aktivität des Isoenzyms optimal ist.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wird Serum a.uf eine entsprechende Ionenaustauschersäule aufgebracht, und die nicht interessierenden Isoenzyme werden aus der Säule ausgewaschen, und verworfen. Die Ionenaustauschersäule wird dann über ein Glas gegeben, in dem sich das trockene Bestimmungsreagens für das Enzym befindet, das kein primäres Substrat für das Enzym enthält und das mit Flüssigkeit rekonstituiert werden soll. Ein Puffer mit einer ausreichenden Ionenstärke, um das gewünschte Isoenzym zu eluieren, wird in einer Menge, die ausreicht, das trockene Bestimmungsreagens zu rekonstituieren, auf die Säule aufgebracht. Das das gewünschte Isoenzym enthaltende Eluat wird in dem Reagensglas aufgefangen und dient gleichzeitig dazu, das Reagens zu rekonstituieren'. Die Bestimmung wird durch Zugabe des konzentrierten Substrats für das Enzym in das Glas gestartet und der Verlauf der Reaktion auf übliche Weise über-

wa cht.

Zur Herstellung des Blutserums für die erfindungsgemäße Analyse entnimmt man im allgemeinen ganzes Blut aus der Vene, sa.mmelt es in Abwesenheit eines Antikoagulans und läßt es - im allgemeinen ungefähr 10 bis 50 Minuten oder möglicherweise länger-koagulieren und zentrifugiert es anschließend, um das Serum als überstehende Flüssigkeit zu gewinnen. Während Hämolyse, wenn eine solche eintritt, das erfindungsgemäße Trennungsverfahren nicht beeinflußt, sollte sie vermieden werden, um Fraktionen zu erhalten mit diagnostisch aussagefähigen Gehalten an den interessierenden Isoenzymen.

Die ursprünglich angewandte Probengröße kann etwas variieren, aber hängt natürlich von dem Volumen der anzuwendenden chromatographischen Säule und der Menge bzw. der

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Kapazität des angewandten Ionenaustauscherharzes sowie der Empfindlichkeit der in der letzten Stufe angewandten Isoenzymanalyse und ähnlichen Paktoren' ab. Tatsächlich wird eine Stahdardprobe im allgemeinen von ungefähr 0,1 bis 2, vorzugsweise 0,4 bis 1,6 und insbesondere 0,5 ml angewandt. Die gewonnene Probe, deren Größe für die anschließende genaue Diagnose notiert wird, wird einfach auf eine chromatographische Säule aufgegeben, die das zu verwendende Ionenaustauscherharz enthält.

Es kann ein geeigneter Temperaturbereich von ungefähr 2 bis 45°C, vorzugsweise 20 bis 37°C angewandt werden. Soweit später nicht anders angegeben, können die weiteren Stufen bei dem erfindungsgeraäßen Verfahren, die später näher erläutert werden, günstigerweise in den oben angegebenen Temperaturbereichen durchgeführt werden. Die Einstellung der Temperatur innerhalb dieser Bereiche ist nicht erfindungswesentlich, es sollte jedoch beachtet werden, daß, um aussagekräftige Werte für die Diagnose zu erhalten, der Abbau oder die Denaturierung der Komponenten durch zu hohe Temperaturen vermieden werden sollte. Ebenso sollten zu niedrige Temperaturen vermieden werden wegen einer möglichen Veränderung des Ionenaustausch.erha.rzes. Weiter ist die Zeit, die nach der Probenherstellung und vor Beginn des erfindungsgemäßen Verfahrens vergeht, nicht erfindungswesentlich, aber auch hier sollte, um einen Abbau oder eine Denaturierung der Probe durch die Zeit zu vermeiden, die Zeit, die zwischen der anfänglichen Probeherstellung und dem Beginn des erfindungsgemäßen Verfahrens verstreicht, nicht mehr als ungefähr 2 bis 5 Tage, vorzugsweise nicht mehr als ungefähr 24 Stunden betragen.

Die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren angewandte chromatographische Säule, die das Ionenaustauscherharz enthält, kann irgendeine für die Säulenchromatographie geeignete Form besitzen. Eine geeignete Säule umfaßt eine zylindrische Säule mit einer Verengung nach dem unteren Ende der Säule zu, um das Ionenaüstauscherharz in der Säule festzuhalten und den Flüssxgkeitsdurchgang zu ermöglichen,und einen

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oberen Teil, der sich nach außen erweitert oder vergrößert oder der ein Reservoir oder eine andere Einrichtung zur Zugabe der Probe und Elutionslösung in dem für das erfindungsgemäße Verfahren angewandten Volumen ermöglicht, um die Zugabe der Anfangsprobe und der anschließenden Elutionslösung zu erleichtern. Im wesentlichen kann irgendeine geeignete chromatographische Säule irgendeiner Größe und Dimension angewandt werden, wie sie im allgemeinen zur Säulenchromatographie angewandt wird. Natürlich sollten der Säulendurchmesser und die Dimensionen entsprechend gewählt werden, um eine wirksame Trennung und Fraktionierung während der Chromatographie zu ermöglichen, und im allgemeinen kann das Verhältnis Länge zu Innendurchmesser von ungefähr 3:1 bis 20:1 variieren, vorzugsweise im Bereich von 4:1 bis 8:1. Im wesentlichen das einzige Erfordernis für die chromatographische Säule ist, daß sie ein ausreichendes Volumen besitzt, um eine entsprechende Menge Ionenaustauscherharz aufzunehmen und das maximale Lösungsvolumen entweder der ursprünglichen Probe oder der Eluenslösung, die während des erfindungsgemäßen Verfahrens zugegeben wird, aufzunehmen. Geeignete Vorrichtungen aer Säule, die angewandt werden können, um das Ionenaustauscherharz festzuhalten, umfassen einen Ba.umwollpfropfen, gesintertes Glas, poröse Keramik- oder Polymerpfropfen usw. Im wesentlichen kann jedes beliebiges inerte Material angewandt werden, das die Probe, die Eluenslösung oder das Ionenaustauscherharz nicht beeinflußt und das Ionenaustauscherharz festhält und den Durchgang der flüssigen Lösungen ermöglicht. Als spezielles Beispiel hat es sich gezeigt, daß für Lösungsvolumina, Volumina der Anfangsprobe und der Eluenslösungen von 10 ml oder weniger und bei Verwendung von Diäthylaminoäthyldextran-Anionenaustauscherharz eine Säule mit einer Länge von 79 tnm und einem Innendurchmesser von 9mm günstig angewandt werden kann, obwohl diese Werte nur beispielhaft sind und keine Begrenzung darstellen. Ein 4 ml Reservoir, z.B. für die Zugabe der Elutionslösung, ist für die oben angegebene Säule günstig.

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Geeignete schwach, basische Ionenaustauscherharze, die bei dein erfindungsgemäßen Verfahren angewandt werden können, sind schwach basische Anionenaustauscherharze, wie Diäthylaminoäthyldextran (im folgenden als DEAE-Dextran bezeichnet) (DEAE-Sephadex A-50 der Pharmacia, Schweden) und Diäthylaminoäthylcellulose ( im folgenden als DEAE-Cellulose bezeichnet) (z.B. von Whattman and Bio-Rad). Andere Beispiele für Ionenaustauscherharze, die für das erfindungsgemäße Verfahren angewandt werden können, sind u.a. Diethylaminoäthylagarose (im folgenden als DEAE-Aigarose bezeichnet) (Biogel A der Bio-Rad), Diäthylaminoäthylacrylamid (im folgenden als DEAE-Acrylamid bezeichnet). DEAE-Sephadex A-50 ist für das erfindungsgemäße Verfahren bevorzugt, da ein derartiges Harz eine geeignete Ladungsdichte, eine geeignete Durchflußgeschwindigkeit besitzt und es möglich ist, die Flüssigkeit so durch die Säule zu leiten, daß ein Flüssigkeitsverlust vermieden wird, und günstigerweise umfassen die Eigenschaften eines derartigen Diäthylaminoäthyldextranharzes eine Ionenaustauschkapazität von ungefähr 0,5 bis 5 mÄq/g und das Harz ist imstande, Substanzen mit einem Molekulargewicht von ungefähr 30 000 bis 200 000 hindurchzulassen .

Eine entsprechende Menge des Anionenaustauscherharzes, das, wie im folgenden angegeben, vorbehandelt worden ist, wird dann in die chromatographische Säule gegeben und etwaige Flüssigkeit aus der Säule a.bgezogen. Die angewandte Menge des Anionenaustauscherharzes variiert etwas, da die Menge im allgemeinen zusammenhängt mit dem Volumen der Anfangsprobe, die fraktioniert bzw. aufgetrennt werden soll,und dem Volumen der angewandten Eluenslösung. Im allgemeinen liegt für ein Anfangsprobenvolumen von ungefähr 1 ml und Volumina der Elutionslösung von 10 ml oder weniger eine entsprechende Menge des vorbehandelten Anionenaustauscherharzes im Bereich von ungefähr 40 bis HO mg, vorzugsweise 70 bis 110 mg für DEAE-Dextranharz (DEAE-Sephadex A-50), ungefähr 250 bis 350 mg für DEAE-Oelluloseharz, ungefähr 125 bis 175 mg für DEAE-Argaroseharz und ungefähr

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125 bis 175 mg für DEAE-Acrylamidharz. Wenn größere oder kleinere Volumina der Anfangsprobe angewandt werden, kann die Menge an Anionenaustauscherharz leicht entsprechend eingestellt werden.

Wie oben angegeben, ist das Ionenaustauscherharz im allgemeinen vorbehandelt, z.B. durch Einweichen des Harzes, um eine Quellung zu erreichen und das Anionenaustauscherharz in eine Umgebung mit dem richtigen pH-Wert und der entsprechenden Ionenstärke zu bringen. Wenn z.B. Diath.yla.minoäthyldextra.n (DEAE-Sephadex A-50) angewandt wird, kann die Vorbehandlung mit einer wäßrigen gepufferten Salzlösung, enthaltend ein Anion entsprechend der ursprünglichen Anionenform des Ionenaustauscherharzes, vorbehandelt werden, und, wenn dieses in Chloridform vorliegt, einer wäßrigen gepufferten Salzlösung von Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Lithiumchlorid oder einem anderen wasserlöslichen Chlorid, vorzugsweise Natrium- oder Kaliumchlorid, insbesondere Natriumchlorid mit einem pH-Wert von ungefähr 7,0 bis 8,5, vorzugsweise 7,9 bis 8,1. Vorzugsweise wird die erste wäßrige gepufferte Salzlösung, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren angewandt wird, für die Vorbehandlung verwendet. Die Pufferung der wäßrigen Chloridlösung kann erreicht werden durch Verwendung eines.kationischen Puffers, wie Tri(hydroxymethyl)aminomethan/HCl (Tris/HCl), oder einem Alkylamin, Aminoäthylalkohol, Ammoniak, Barbitol bei einem pH-Wert unter 7,5, Äthylendiamin, Imidazol, Pyridin usw. Eine geeignete Pufferkonzentration ka.nn im Bereich von ungefähr 0,01 bis 0,1m liegen, wobei 0,05m Tris/HCl-Puffer bevorzugt sind. Die anderen Anionenaustauscherharze, die für das erfindungsgemäße Verfahren geeignet sind, werden entsprechend auf ähnliche Weise vorbehandelt.

Nachdem die feinen Teile von dem vorbehandelten Anionenaustauscherharz entfernt worden sind und dieses in die chroma.tographische Säule gegeben worden ist, wird eine Menge der wäßrigen Vorbehandlungslöaang, z.B. wie oben beschrieben, d.h. eine wäßrige gepufferte Natriumchloridlösung mit dem gleichen pH-Wert, z.B. von ungefähr 7,0 bis 8,5,

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vorzugsweise 7,9 bis 8,1, wie die für die Vorbehandlung verwendete Chloridlösung in die chromatographische Säule, enthaltend das Anionenaustausch.erh.arz gegeben, und man läßt die überschüssige lösung dann aus der Säule ablaufen. Wahlweise kann eine wäßrige gepufferte Kaliumchlorid-oder Lithiumchloridlösung mit ähnlichen Eigenschaften anstelle der wäßrigen gepufferten Natriumchloridlösung verwendet werden, wenn das erwünscht ist. Der Einfachheit halber wird eine wäßrige Lösung mit ähnlichen Eigenschaften unter Verwendung des gleichen Salzes angewandt, z.B., wenn für die Vorbehandlung eine wäßrige Natriumchloridlösung verwendet worden ist, wird eine ähnliche wäßrige gepufferte Batriumchloridlösung angewandt.

Für die angewandten wäßrigen Lösungen wird im allgemeinen Wasser als Medium für das Salz und den Puffer verwendet, aber es können auch entsprechende andere verträgliche Substanzen, die die Probe oder das Anionenaustauscherharz nicht angreifen, wie entsprechende Konservierungsmittel, z.B. antimikrobielle Mittel, zusätzlich vorhanden sein.

Ferner kann das erfindungsgemäße Verfahren leicht durchgeführt werden, und die zwischen den einzelnen Stufen vergehende Zeit ist nicht von Bedeutung für die Arbeitsweise, aber es sollte nicht übermäßig viel Zeit vergehen, um eine Zerstörung oder Denaturierung der Isoenzyme zu vermeiden und aussagekräftige Werte für die Isoenzymbestimmung zu erhalten. Wenn es unvermeidlich ist, daß eine gewisse Zeit verstreicht, ist es günstig, die Probe, die die gebundenen Isoenzyme enthaltende Säule oder die eluierten Fraktionen im Kühlschrank aufzubewahren, um eine Veränderung oder Denaturierung der Materialien möglichst gering zu halten.

Bei der Analyse von Krea.tinphosphokina.se MB-Isoenzym nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wird eine chromatographische Säule, z.B. mit einer Länge von 79 mm und einem Innendurchmesser von 9 mm,mit einem porösen Baumwollstopfen, der das untere Ende abschließt, um das Harz festzuhalten,

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aber den Flüssigkeitsdurchgang zu ermöglichen, und mit einem nach außen erweiterten oberen Ende angewandt und mit 90 mg vorgequollenem Diäthylaminoäthyldextran (DEAE-Sephadex A-50) gefüllt (in 0,1m Natriumchloridlösung, die mit 0,05m Tris gepuffert ist).

Es wird eine stufenweise Eluierung angewandt, um das MB-Isoenzym von den MM- und BB-Formen zu trennen. Die MB-Fraktion rekonstituiert ein Reagens in einem Glas sowie sie aus der Säule austritt. Um eine möglichst geringe Verdünnung des MB-Osoenzyms zu ermöglichen und damit eine hohe Empfindlichkeit zu erreichen, wird nur der mittlere Teil in Form einer 3 ml Fraktion gesammtelt. Das führt zu einer Gewinnung von ungefähr 85 % des auf die Säule aufgebrachten MB, wobei die stärker verdünnten Anfangs- und Endteile der Fraktion verworfen werden. Das System ist jedoch so geartet, daß diese Menge der Gewinnung sehr konstant ist. Das MB wird bei 340 mm spektrophotometrisch bestimmt, nachdem das die MB-Fraktion enthaltende Reagens auf 3O⁰C erwärmt und ein Reaktionsinitiator (Kreatinphosphat) zugegeben worden ist. Die Bestimmungsreaktion ist eine Modifikation des Verfahrens nach Rosalki-Oliver, J. Lab. Clin. Med., 69, 695 (1967), das auf eine maximale Empfindlichkeit optimiert worden ist und bei dem N-Acetyl-L-cystein als Kreatinphosphokinaseaktivator angewandt wird. Die Reaktionsfolge, die eingeleitet wird, wenn Kreatinphosphat zu dem Glas zugegeben wird, führt zu einer Zunahme der NADH-Konzentration, die kinetisch bei 340 nm abgelesen wird. Die Reaktionsfolge ist:

CPK-MB
Kreatinphosphat + ADP =^ Kreatin + ATP

Hexokinase
ATP + Glucose * Glucose-6-phosphat + ADP

Glucose-6-phosphat

Glucose-6-phosphat ^ 6-Phosphogluconat + NADH

dehydrο gena s e

.. /20 909830/O&SS

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Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

Bestimmung von Kreatinphosphokinase-MB-Isoenzym

0,5 ml Serum wurden auf eine entsprechende Ionenaustauschersäule aufgebracht und das MM-Isoenzym aus der Säule ausgewaschen und verworfen. Die Säule wurde über ein Glas gestellt, enthaltend ein trockenes Bestimmungsreagens für Kreatinphosphokinase, das kein Kreatinphosphat enthielt und so ausgebildet war, daß es mit 3 ml Flüssigkeit rekonstituiert werden konnte. 3 ml eines Puffers mit einer ausreichenden Ionenstärke, um das MB-Isoenzym zu eluieren, wurden auf die Säule aufgebracht und das das MB-Isoenzym enthaltende Eluat in dem Glas aufgefangen, wodurch gleichzeitig das Reagens rekonstituiert wurde. Die Bestimmung wurde eingeleitet durch Zugabe von 0,1 ml konz. Kreatinphosphatlösung zu dem Glas und Überwachung des Reaktionsverlaufs auf übliche Weise.

Die Empfindlichkeit dieses Verfahrens gegenüber bekannten Bestimmungsverfahren kann durch die folgenden Berechnungen gezeigt werden.

Kreatinphosphokinase-MB (OPK-IiB)-Gehalt im Serum: 2 E/l Verdünnung des Serums durch die Säule: Probe = 0,5 ml

MB-Eluat = 3,0 ml Verdünnung = 6-fach

Konzentration an OPK-MB im Eluat: 2 E/l + 6 = 0,333 E/l

Geschwindigkeit der Absorptionsänderung bei einer üblichen Bestimmung (0,1 ml Probe in 3,1 ml Reagens)

= 0,000067/min. ../21

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Geschwindigkeit der Absorptionsänderung bei dem erfindungsgemäßen Verfahren (3,0 ml Probe in 3,1 ml):

= ,0021/min.

Verbesserung der Empfindlichkeit mit dem erfindungsgemäßen Verfahren:

OOO²I , - 31-fach

7 ~

0,000067

Die in diesem Beispiel angewandten Reagentien waren:

CPK-MM-EIutionspuffer

Natriumchlorid, Tris gepuffert")

gehemmte Schimmelbildung J ¹⁰°

CPK-MB-EIutionspuffer

Natriumchlorid, Tris gepuffert )

gehemmte Schimmelbildung J ²⁵° ^m°'¹/¹

Isoenzym-Trennsäule

DEAE-Sephadex A-50 in 0 1,6+0,1 ml

OPK-I«M-Puffer j äquilibriertes Harz in

der Säule nach dem Ab-CPK-MB-Substrat _laufen>

Glucose 20 mMol/l
Magnesiumionen 10 mMol/l
Adenosindiphosphat (ADP) 2 mMol/l Nicotinamid-adenin-dinucleotid (NADH) 1,5 mMol/l Hexokinase, Bäckerhefe 3000 E/l* Glucose-6-phosphat-dehydrogenase 4000 E/l** N-Acetyl-L-cystein 30 mMol/l
Adenosin-monophosphat 6 mMol/l
Püllstoffe
Puffer

* Eine internationale Einheit (E) von Hexokinase ist die Enzymmenge, die 1 Mikromol Glucose-6-phospha.t/min bei 30⁰O und einem pH-Wert von 8,5 bildet;

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** Eine internationale Einheit (E) Glue öse-6-phosphatdehydrogenase ist die Enzymmenge, die ein Mikromol NlD in einer Minute bei 3O⁰C und einem pH-Wert von 7,8 in NADH umwandelt.

Der Kreatinph.osph.at-Initia.tor wird in einer Menge von 169 mg/Glas (0,6 ml rekonstituiert) zugegeben.

Beispiel 2

Ein Glas mit CPK-MB-Kreatinphosphat-Initiator wurde mit 0,6 ml OPK-MB-Puffer rekonstituiert.

Überschüssiger Puffer wurde aus der Säule abgezogen. 500 /Ul Serum (klares, nicht hämolysiertes Serum, das sobald wie möglich nach der Entnahme von roten Blutkörperchen befreit worden war) wurden in die Säule pipettiert und konnten vollständig in das Harzbett eindringen.

2 ml CPK-MB-Puffer wurden zu der Säule gegeben und das ganze Eluat gesammelt.

Nachdem nichts mehr aus der Säule auslief wurden 4,0 ml CPK-MM-Puffer zugegeben.

Nachdem nichts mehr aus der Säule auslief, wurde 1 ml CPK-MB-Puffer zugegeben.

Nachdem wiederum nichts mehr aus der Säule auslief, wurde ein Glas, enthaltend CPK-MB-Substrat, unter die Säule gegeben, sodaß die Ausla.uföffnung der Säule in das Glas hineinragte. Es wurden 3 ml CPK-MB-Puffer zugegeben und das Eluat in dem Substratfläschchen aufgefangen.

Nachdem wiederum nichts mehr aus der Säule auslief, wurde das Glas bzw. das Pläschchen 10 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Der gesamte Inhalt des Glases mit rekonstituiertem CPK-MB-Substrat wurde in eine Küvette gegeben und diese,bis sie die Reaktionstemperatur erreicht

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hatte, in einen Inkubator von 30⁰C gegeben.

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100 /ul CPE-MB-Kreatinphospha-t-Initiator wurden zu der Küvette gegeben und durch vorsichtiges Umkippen gegen einen Polyäthylenfilm vermischt.

Die Küvette wurde in ein vorher erwärmtes Spektrophotomet.er gegeben und 3 min für die Verzögerung (lag phase) stehengelassen. Nach 3 min langem Anlaufen wurde die Anfangsa.bsorption (A.) notiert. Die Reaktion wurde 4 min überwacht. Die Endabsorption (A~) wurde genau 4 min nach der Anfangsabsorption (A.) notiert. Die Absorptionsänderung Δ Α entspricht Ar.-A..

Die folgende Gleichung wurde angewandt, um die CPK-MB-Aktivität zu berechnen:

E/l'= (AA) x 400

Der Paktor "400" ist abgeleitet aus der folgenden Gleichung:

CPK-MB _β (ΔΑ) χ (1000) χ (3,1) x (S)

Φ/¹) (6,22) χ (4) χ (3,0) χ (0,734) χ (0,85)

Δα = Absorptionsänderung
1000 = Umwandlung Millimol -* Mikromol 3,1 = Volumen der MB-Fraktion in ml 6,22 = Millimolare Absorption von NADH bei 340 mm (nm)

4 = Zeit über die die Absorptionsänderung beobachtet wurde (min)

6 = Verdünnungsfaktor des CPK-MB aus der Probe in der MB-Fraktion (3,0 ml/0,5 ml)

0,734 = Fraktion der CPK-Aktivität, die in Gegenwart

des hohen NaCl-Gehalts des MB-Puffers verbleibt

0,85 = Fraktion des CK-MB, die aus der Säule eluiert

worden ist und in der 3,0 ml MB-Fraktion zurückgewonnen wird-

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Aufgrund der Annahme, daß die minimale nachweisbare Absorptionsänderung durch, das Instrument 0,001 über 4 min beträgt,ist die Empfindlichkeit des Systems Reagens/ Instrument so, daß ein Minimum von 0,4-0 E/l CPK-MB in einer Serumprobe nachgewiesen werden kann.

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Claims (1)

1. DR.-ING. I RANZ WUESTHOFF

   PATENTANWÄLTE .

   DR. PUIL. FRETA WUESTHOFP (1027-I056)

   WUESTHOFF-v.PECHMANN-BEHREiNS-GOETz, dipl.-ing.gerhard pols

   DrPL.-CHEM. DR. E. FREIHERR VON PECHMANN PROFESSIONAL REPRESENTATIVES BEFORE THE EUROPEAN PATENT OFFICE DR.-ING. DIETER BEHRENS

   MANDATAtRES AGREES PRES l'opFICE EUROPEEN DES BREVETS DirL.-ING.JDIPL.-WIRTSCH.-ING. RUPERT GOETZ

   D-8000 MÜNCHEN 90

   2844313 SCHWEIGERSTRASSE 2

   telefon: (089) 66 20 51 telegramm: protectpatent Telex: 524070

   IA-5I 062

   Anm.: American Hospital ..

   Patentansprüche

   . ΐΛ Verfahren zur Bestimmung . von Isoenzymen mit unterschiedlichen elektrischen Ladungen in einer Probe, dadurch gekennzeichnet , daß man

   (a) das Isoenzym durch Ionenaustauscher-Chroma.tograph.ie der Probe über ein schwach basisches Ionenaus tau scherharz und abschließendes Eluieren und Sammeln der Fraktionen, die jedes der Isoenzyme enthält, die bestimmt werden sollen, trennt und isoliert,

   (b) getrennt jede der Fraktionen untersucht,indem man

   1. die Fraktionen zu einem trockenen Reagens für das zu bestimmende Isoenzym in Abwesenheit eines Substrats für das Enzym zur Rekonstitution des Reagenses zugibt,

   2. zu dem rekonstituierten Reagens ein Substrat für das zu bestimmende Isoenzym zugibt und

   3. das rekonstituierte Reagens und Substrat spektrophotometrisch analysiert.

   2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Isoenzyme Kreatinphosphokina.se-Isoenzym-MM und Kreatinphosphokinase-Isoenzym-MB verwendet.

   3. Verfahren nach Anspruch 1 zur Bestimmung von Isoenzym von Kreatinphosphokina.se, dadurch gekennzeichnet, daß man

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   (a) ein schwach, basisches Ionenaustauscherharz mit einem wäßrigen gepufferten Alkalichlorid, enthaltend ungefähr 0,1 Mol Alkalichlorid, äquilibriert

   (b) die Probe in nicht dialysierter, nicht veränderter ionischer Form durch das äquilibrierte Ionenaustauscherharz leitet und die auslaufende Flüssigkeit sammelt;

   (c) durch das Ionenaustausoherharz nacheinander getrennte Volumina einer wäßrigen gepufferten Alkalichloridlösung hindurchleitet mit einer ersten molaren Ionenkonzentration von ungefähr 0,1 und die auslaufende Flüssigkeit getrennt von der auslaufenden Flüssigkeit der Stufe (b) sammelt, da.nn durch das gleiche Ionenaustauscherharz eine wäßrige gepufferte Alkalichloridlösung mit einer zweiten molaren Ionenkonzentration von ungefähr 0,25 hindurchleitet und die auslaufende Lösung getrennt von den Lösungen der Stufe (b) und der ersten Lösung der Stufe (c) sammelt.

   (d) jedes der getrennten Eluate untersucht, indem man

   1. die Fraktionen zu einem trockenen Reagens für Kreatinphosphokina.se in Abwesenheit von Kreatinphosphat zur Rekonstitution des Reagenses zugibt,

   2. Kreatinphosphat zu dem rekonstituierten Reagens gibt und

   3. das rekonstituierte Reagens plus Kreatinphosphat spektrophotometrisch analysiert.

   4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3> dadurch gekennzeichnet, daß man als Puffer ungefähr 0,05m Tris-Puffer verwendet.

   5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4> dadurch gekennzeichnet, daß man als Probe nicht dialysiertes Blutserum in unveränderter ionischer Form verwendet.

   6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5·zur Bestimmung von Kreatinphosphokina.se-MB-Isoenzym, dadurch gekennzeichnet, daß man

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   (a) ein schwach ba.sisch.es i&fonenaustauscherharz mit einer ■wäßrigen gepufferten Alkalichloridlösung, enthaltend ungefähr 0,1m Alkalichlorid äquilibriert,

   (b) die Probe in nicht dialysierter, nicht veränderter ionischer Form durch das äquilibrierte Anionenaustauscherharz leitet und die austretende Flüssigkeit sammelt,

   (c) durch das Anionenaustauscherha.rz eine 0,1m wäßrige gepufferte Alkalichloridlösung leitet und die austretende Flüssigkeit sammelt und verwirft,

   (d) durch das Anionena.ustauscherharz eine 0,25m wäßrige gepufferte Alkalichloridlösung leitet,

   (e) die austretende Flüssigkeit in einem Glas, enthaltend ein trockenes Reagens für Kreatinphosphokinase in Abwesenheit von Kreatinphosphat zur Rekonstituierung des Reagenses sammelt,

   (f) Kreatinphosphat zu dem Glas zugibt und

   (g) den Inhalt des Glases spektrophotometrisch untersucht.

   ·}". Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, , daß man als Ionenaustauscherharz DEAE-

   sephadex verwendet.

   8. Verfahren nach Anspruch 3 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagens Glucose, Magnesiumionen, Adenosindiphosphat, Nicotinamid-adenin-dinucleotid, Hexokinase, Glucose-6-phosphat-dehydrogenase, n-Acetyl-L-cystein und Adenosin-monophosphat enthält.

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