CS195756B1 - Method of determination of the efficacy of the glycogenphosphorylasis in the blood - Google Patents
Method of determination of the efficacy of the glycogenphosphorylasis in the blood Download PDFInfo
- Publication number
- CS195756B1 CS195756B1 CS85674A CS85674A CS195756B1 CS 195756 B1 CS195756 B1 CS 195756B1 CS 85674 A CS85674 A CS 85674A CS 85674 A CS85674 A CS 85674A CS 195756 B1 CS195756 B1 CS 195756B1
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- solution
- liter
- glycogen
- moles
- mercaptoethanol
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Vynález se týká způsobu stanovení účinnosti lsoíosforylázy v krvi. Jde zejména o glykogen fosforylázy.
Vynález si klade za úkol zlepšit způsob stanovení glykogenfosforylázy tak, aby bylo možno stanovit jak celkovou fosforylázu, tak určité isofosforylázy.
Jsou známy způsoby kvantitativního stanovení glykogenfosforylázy, například účinnosti fosforylázy ze svalů měřením glukózo-l-fosfátu nebo orthofosfátu v homogenátech tkání.
1. Pfannemilller, B.: In: Handbuch der Physiologisch- und pethologisch-chemlschen Analyse (Hrg. Hoppe-Beyler u. Thierfelder], Springer Verlag, Berlin-Gčttingen-Heidelberg, sv. VI/B, str. 225 až 253 (1966),
2. Will, H. urid R. G. Krause: Acta biol. med. german. 28, 919 až 933 (1972).
Tyto způsoby spočívají v tom, že se zjišťují různé reakční produkty reakce, která je katalyzována enzymem. Jde o uvolnění anorganického fosfátu, prodloužení glykosylových řetězců molekuly glykogenu, popřípadě tvorba glukózo-l-fosfátu. Ke zjištění těchto produktů je známa celá řada způsobů, které se od sebe liší svou citlivostí jen nepodstatně. Známé způsoby se více nebo
S měně hodí ke kvantitativnímu stanovení účinnosti enzymu, bez ohledu na kvalitativní rozdíly mezi různými isoenzymy fosforylázy. Stanovení účinnosti je v krevním séru spojeno s tou nevýhodou, že. je přítomno pouze velmi malé množství fosforylázy při velkém přebytku jiných bílkovin.
Zjištění účinnosti fosforylázy, zejména specifické fosforylázy pro srdeční sval v krevním séru u lidí, má velký diagnostický význam, protože po poškození buněk svalu, například při infarktu, se tento enzym objevuje v krevním séru [Krause, E. G., H. Běhm, H. Will a A. Wollenberger: Dtsch. Ges. wesen 27, 903 (1972)). Způsob zjišťování účinnosti glykofenfosforylázy v krevním séru však dosud není znám.
Vynález si tedy klade za úkol navrhnout způsob stanovení účinnosti glykogenfosforylázy v krevním séru.
Předmětem vynálezu je způsob stanovení účinnosti glykogeníosforylázy v krevním séru, vyznačující se tím, že se krevní sérum po předběžném zpracování smísí se substrátem pro enzym a roztokem, obsahujícím efektor a po inkubaci se měří enzymatická účinnost podle vzniklých reakčních produktů.
Krevní sérum se předběžně zpracovává koncentrací pomocí membránové filtrace v poměru 2:1 až 3:1 a popřípadě se předběžně zpracovává škrobem. К předběžnému zpracování škrobem se sérum nanese na sloupec naplněný škrobem při teplotě 0 až 5 °C. Sloupec se uvede do· rovnovážného stavu v roztoku s obsahem 1 až 103 molu/litr fluoridu sodného, 0,1 až 10“4 molu/litr j3-glycerofosfátu sodného a 0,1 až 104 molu/litr merkaptoethanolu o pH 5,5 až 7,0. Potom se roztok nechá procházet sloupcem, načež se vymývá fosforylázou při teplotě 10 až 35 °C a pH 6,0 až 7,5 dalším roztokem, který obsahuje 0,1 až 10 “4 molu/litr β-glycerofosfátu sodného, 1 až 10~4 molu/litr kyseliny ethylendiamintetraoctové a 0,1 až 10_4 molu/litr merkaptoethanolu.
Sérum, koncentrované membránovou filtrací, se smísí s roztokem, který obsahuje 1 až 103 molu/litr glycylglycinu, 0,1 až 104 molu/litr merkaptoethanolu a 1 až 104 molu/litr kyseliny ethylendiamintetraoctové při pH 6 až 7,5.
Tato směs, popřípadě eluát ze škrobového sloupce se přidá к roztoku, který obsahuje roztok glykogenu, glukózo-l-fosfátu a adenosinmonofosfátu v poměru 5:3:2 a výsledná směs se inkubuje 60 minut při teplotě 37 °C. Potom se směs denaturuje kyselinou trichloroctovou a obsah fosfátu se stanoví opticky.
Glykogenfosíoryláza se dělí na 3 isofosforylázy elektroforézou, aby bylo možno stanovit formu, typickou pro srdeční sval. Po inkubaci za přítomnosti substrátu se isoíosforylázy barví podle reakčního produktu směsí jodu a jodidu draselného.
Způsob podle vynálezu je vhodný jako vyšetřovací metoda к diagnóze srdečního infarktu, což při použití dosavadních způsobů nebylo možné. V krevním séru zdravých osob není možno naměřit žádnou účinnost fosforylázy. Z tohoto hlediska principiálně způsobuje jakékoli stanovení fosforylázy v krevním séru podezření na infarkt.
V následujících příkladech se popisuje stanovení fosforylázy i složení činidla, které se к provádění způsobu podle vynálezu používá.
Přikladl
Činidlo ke stanovení fosforylázy má následující složení:
roztok 1
0,1 m fluoridu sodného
0,001 m /J-glycerofosfátu sodného o pH 6,1 0,015 m merkaptoethanolu roztok 2
0,04 m jS-glycerofosfátu sodného o pH 6,8 0,001 m kyseliny ethylendiamintetraoctové 0,015 m merkaptoethanolu roztok 3
0,04 m glycylglycinu o pH 6,8
0,01 m merkaptoethanolu 0,008 m kyseliny ethylendiamintetraoctové roztok 4
3,3 o/o glykogenu roztok 5
0,083 m glukózo-l-fosfátu
0,005 m adenosínmonofosfátu
Sérum se koncentruje membránovou filtrací v poměru 2:1 až 3:1, popřípadě se předběžně zpracuje nerozpustným škrobem. V tomto případě se 3 až 4 ml séra nanesou při 4 °C na sloupec škrobu o rozměru 2X1 centimetrů, v. rovnovážném, stavu ,v...rozto.-. ku 1. Potom se sloupec promyje 3 X 3 ml roztoku 1 a vymývá se 2 ml roztoku 2 při 30 °C fosforylázou.
díl koncentrovaného séra se smísí s 1 dílem roztoku 3 а к 5 dílům směsi, popřípadě eluátu se přidají 3 díly roztoku 4 a 2 díly roztoku 5. Po 60 minutách inkubace při 37 °C se roztok denaturuje kyselinou trichloroctovou a známým způsobem [Wěií -Melherbe, H.: In: Handbuch der Physiologisch- und pathologisch-hemischen Analyse (Hrg. Hoppe-Seyler ů. Thierfelder), Springer Verlag, Berlin-Góttgen-Heidelberg, sv. III/l, str. 457 až 538 (1955)], se provede analýza fosforečnanu, který je reakčním produktem.
P ř í к 1 a d 2
Nyní se provádí stanovení enzymatické účinnosti za přítomnosti specifických inhibičních látek isofosforylázy, takže se na rozdíl od stanovení podle příkladu i zjistí podíl fosforylázy specifické pro· srdeční sval.
Činidlo к oddělení isofosforylázy a stanovení enzymatické účinnosti má následující složení:
roztok 1
0,042 m tris(hydroxymethyl)aminoethanu 0,001 m kyseliny ethylendiamintetraoctové 0,049 m kyseliny borité o pH 8,2 roztok 2
0,03 m glukózo-l-fosfátu
0,002 m adenosínmonofosfátu
0,002 m /?-glycerofosfátu sodného o pH 6,8
0,002 m kyseliny ethylendiaminotetraoctové
0,001 m merkaptoethanolu
0,1 m fluoridu sodného roztok 3
0,01 m jodu
0,014 m jodidu draselného
Alikvotní část eluátu ze šroubového sloupce s obsahem fosforylázy se zředí roztokem 1 v poměru 2:1 2. m sacharózy a diskovou elektroforetickou technikou se oddělí iso fosforyláza. K dělení se užije gelu ve složení 5 % akrylamidu a 0,2 % N,N‘-methylbisakrylamidu s obsahem 0,1 % glykogenu a roztoku 1 jako · pufru, který je zároveň elektrodovým . pufrem. Po inkubaci tohoto · gelu v roztok 2 se nanese roztok 3, čímž se zbarví amylózové postranní řetězce vzniklé polymeraci glykogenu.
Claims (4)
1. Způsob stanovení účinnosti glykogenfosfoirylázy · v krvi, vyznačující se tím, že se krevní . sérum po předběžném zpracování smísí se substrátem pro enzym a roztokem, obsahujícím efektor a po· inkubaci se měří enzymatická účinnost podle vzniklých reakčních produktů.
2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že . se krevní sérum koncentruje membránovou filtrací v poměru 2:1 až 3:1 a popřípadě se· předběžně zpracovává nerozpustným škrobem.
3. Způsob podle bodu 2, vyznačující . se tím, že se při předběžném zpracování škrobem krevní sérum ' nanese při teplotě 4 °C na sloupec škrobu, uvedený do· rovnovážného stavu v roztoku, který obsahuje . 1 až 10-3 molu/litr chloridu sodného, 0,1 až 10“4 mohi/Mte Jglycerofosfátu sodného· a 0,1 až 10-4 molu/litr· merkaptoethanolu při pH 6,1, potom se sloupec promyje tímtéž roztokem a nakonec se vymývá při teplotě 30 °C a pH 6,8 roztokem, který obsahuje 0,1 až 10“4 molu/litr.· β-glycerofosfátu sodíku, 1 až 10“4 molu/litr kyseliny ethylendiamintetraoctové a 0,1 až 10“ molu/litr merkaptoethanolu k získání fosforylázy.
4. Způsob podle bodů 1 a· 2, vyznačující se tím, že se koncentrované sérum mísí s roztokem, který obsahuje 1 až 10“3 molu/ /litr glycylglycinu, 0,1 až 10“4 molu/litr merkaptoethanolu a 1 až 10 4 molu/litr kyseliny ethylendiamintetraoctové při pH 6,8, získaná směs, popřípadě eluát ze škrobového sloupce se přidá k roztoku glykogenu · a k roztoku glukózo1- 1-fosfátu a ' adenosinmono1fosfátu v poměru 5:3:2, výsledná směs se inkubuje 60 minut při teplotě 37 °C, denaturuje se · kyselinou trichloroctovou a obsah fosfátu se stanoví opticky po· redukci fosfomolybdenanového komplexu.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD16876573A DD101986A1 (cs) | 1973-02-07 | 1973-02-07 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS195756B1 true CS195756B1 (en) | 1980-02-29 |
Family
ID=5490033
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS85674A CS195756B1 (en) | 1973-02-07 | 1974-02-07 | Method of determination of the efficacy of the glycogenphosphorylasis in the blood |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| BG (1) | BG20730A1 (cs) |
| CS (1) | CS195756B1 (cs) |
| DD (1) | DD101986A1 (cs) |
| DE (1) | DE2401484A1 (cs) |
| FR (1) | FR2327545A1 (cs) |
| GB (1) | GB1451004A (cs) |
| HU (1) | HU169957B (cs) |
| PL (1) | PL94983B1 (cs) |
| SU (1) | SU976958A1 (cs) |
-
1973
- 1973-02-07 DD DD16876573A patent/DD101986A1/xx unknown
-
1974
- 1974-01-12 DE DE19742401484 patent/DE2401484A1/de not_active Withdrawn
- 1974-01-29 GB GB406174A patent/GB1451004A/en not_active Expired
- 1974-02-05 BG BG2570174A patent/BG20730A1/xx unknown
- 1974-02-06 HU HUAE000406 patent/HU169957B/hu unknown
- 1974-02-06 SU SU741999385A patent/SU976958A1/ru active
- 1974-02-07 PL PL16863774A patent/PL94983B1/pl unknown
- 1974-02-07 FR FR7404148A patent/FR2327545A1/fr active Granted
- 1974-02-07 CS CS85674A patent/CS195756B1/cs unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| BG20730A1 (cs) | 1975-12-20 |
| GB1451004A (en) | 1976-09-29 |
| DE2401484A1 (de) | 1974-08-29 |
| FR2327545A1 (fr) | 1977-05-06 |
| FR2327545B1 (cs) | 1978-02-17 |
| PL94983B1 (cs) | 1977-09-30 |
| HU169957B (cs) | 1977-03-28 |
| DD101986A1 (cs) | 1973-11-20 |
| SU976958A1 (ru) | 1982-11-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Natowicz et al. | Enzymatic identification of mannose 6-phosphate on the recognition marker for receptor-mediated pinocytosis of beta-glucuronidase by human fibroblasts. | |
| Ghosh et al. | Adenosine diphosphate glucose pyrophosphorylase: a regulatory enzyme in the biosynthesis of starch in spinach leaf chloroplasts | |
| Maréchal et al. | Metabolism of trehalose in Euglena gracilis: I. partial purification and some properties of trehalose phosphorylase | |
| Fraenkel et al. | The specific fructose diphosphatase of Escherichia coli: properties and partial purification | |
| GB1512328A (en) | Method and reagent for determining the activity of creatinekinase-mb | |
| NZ224171A (en) | Determining potassium ion concentration in body fluids through the use of an enzyme | |
| JPH0417640B2 (cs) | ||
| Chappell et al. | Creatine phosphokinase: assay and application for the micro-determination of the adenine nucleotides | |
| JPS63152998A (ja) | 糖転移酵素の測定方法 | |
| Darrow et al. | Subunit association and catalytic activity of uridine diphosphate galactose-4-epimerase from yeast. | |
| US4237044A (en) | Antibodies against creatinekinase-M8 and process for the production thereof | |
| CS195756B1 (en) | Method of determination of the efficacy of the glycogenphosphorylasis in the blood | |
| Graves et al. | Pyridoxal phosphate-dependent conformational states of glycogen phosphorylase as probed by interconverting enzymes. | |
| CA1060765A (en) | Differential assay of creatine phosphokinase isoenzymes | |
| Rudick et al. | Uridine diphosphate glucose pyrophosphorylase of Acanthamoeba castellanii: purification, kinetic, and developmental studies | |
| Leloir et al. | [35] Galactokinase and galactowaldenase | |
| Keppler et al. | Enzymatic analysis of guanine nucleotides in tissues and cells | |
| Vanderheiden | ITP pyrophosphohydrolase and IDP phosphohydrolase in rat tissue | |
| Bernstein et al. | Adenylate kinase in human tissue: II. Serum adenylate kinase and myocardial infarction | |
| EP0071087B1 (en) | Improved determination of creatine phosphokinase in body fluids | |
| Kirchgesser et al. | A colorimetric assay for the determination of acid nucleoside triphosphatase activity | |
| Gonzalez et al. | Fish Liver Fructose 1, 6-Diphosphatase: I. PURIFICATION OF THE ENZYME FROM GENYPTERUS CHILENSIS AND STUDIES ON ADENOSINE 5′-MONOPHOSPHATE INHIBITION | |
| Klein et al. | Anion-exchange chromatography of erythrocytic and muscle adenylate kinase and its effect on the serum creatine kinase isoenzyme assays. | |
| Ronouist | Enzyme activities at the surface of intact human erythrocytes | |
| EP0134292B1 (en) | Determination of carbohydrate acceptors |