PL94983B1 - - Google Patents

Description

Opis patentowy opublikowano: 31.12.1977 94983 MKP GO In 33/16 Int. Cl2.

G01N 33/16 CZYTELNIA Urzedu Potewtewego PuUuj Szeczypospoliiej LiKfewti Twórcawynalazku: Uprawniony z patentu: VEB Arzneimittelwerk Dresden, Radebeul (Niemiecka Republika Demokratyczna) Sposób oznaczania aktywnosci fosforylaz glikogenu we krwi Wynalazek dotyczy sposobu oznaczania aktywnosci fosforylaz glikogenu w zwenatrzkomórkowych ply¬ nach ustrojowych ludzi i zwierzat, a zwlaszcza w surowicy krwi.

Sposób ten umozliwiajacy zwlaszcza wykrywanie uszkodzen miesnia sercowego dotychczas nie byl znany.

Sposoby ilosciowego oznaczania fosforylazy glikogenu sa znane i polegaja one na wykrywaniu najrozmaitszych produktów reakcji katalizowanej przez enzym, jak wydzielenie nieorganicznego fosforanu, przedluzenie glikozy- lowych lancuchów czasteczki glikogenu wzglednie wytworzenie 1-fosforanu glikozy, Istnieje wiele sposobów wykrywania kazdego z wyzej wymienionych produktów reakcji, jednak sposoby te pod wzgledem czulosci róznia sie bardzo nieznacznie. Te znane sposoby sa wiec mniej lub bardziej odpowiednie do jakosciowego okreslenia aktywnosci enzymu ale nie nadaja sie do przeprowadzenia ilosciowego rozróznienia najrozmaitszych izoenzymów tej fosforylazy.

Okreslenie aktywnosci fosforylazy, zwlaszcza specyficznej dla serca fosforylazy miesniowej; w surowicy krwi ludzkiej, ma duze znaczenie diagnostyczne, poniewaz w przypadku uszkodzenia komórek (np. zawalu serca) enzym ten ukazuje sie w surowicy krwi.

Celem wyYialazkujest wiec ulepszenie dotychczasowych sposobów oznaczania fosforylazy glikogenu i uzys¬ kanie mozliwosci bardziej dokladnych okreslen ilosciowych aktywnosci tego enzymu, tj. uzyskanie takiej metody okreslenia aktywnosci fosforylazy glikogenu, aby mozna bylo oznaczyc zarówno calkowita ilosc fosforylaz jak i poszczególnych izofosforylaz.

Cel ten osiagnieto przez poddanie surowicy wstepnej obróbce, zastosowanie odpowiednich substratów i inhibitorów aktywnosci poszczególnych fosforylaz oraz metod rozdzialu.

Sposób wedlug wynalazku polega na tym, ze surowice krwi po wstepnej obróbce miesza sie z roztworem odpowiedniego substratu i efektora, poddaje inkubacji i w znany sposób oznacza ilosc produktu powstalego w wyniku enzymatycznej reakcji, takiego jak fosforan lub pochodne glikogenu o bocznych lancuchach typu amylozy.2 94983 Surowice krwi poddaje sie wstepnej obróbce za pomoca filtracji membranowej prowadzonej do zageszcze¬ nia w proporcji jak 2:1 do 3:1 lub za pomoca nierozpuszczalnej skrobii przez naniesienie surowicy w temperatu¬ rze 4°C na kolumne wypelniona skrobia i doprowadzona do stalej wartosci pH 6,1 za pomoca roztworu fluorku sodu, 0-glicerofosforanu sodu i merkaptoetanolu, przemycie kolumny tym roztworem ale o wartosci pH 6,8 i wyeluowanie fosforylazy w temperaturze 30°C przy Wartosci pH 6,8 za pomoca roztworu zlozonego z (3-glicero- fosforanu sodu, kwasu etylenodwuaminoczterooctowego i merkaptoetanolu.

W przypadku uzycia surowicy zageszczonej przez filtracje membranowa miesza sie te surowice z roztwo¬ rem zlozonym z glicyloglicyny, merkaptoetanolu i kwasu etylenodwuaminoczterooctowego, o wartosci pH 6,8.

Otrzymana mieszanine lub eluat z kolumny skrobiowej laczy sie z roztworem zawierajacym glikogen i z roztwo¬ rem 1-fosforanu glikozy i monofosforanu adenozyny jak i ewentualnie z innymi czynnikami hamujacymi aktyw- nosc fosforylaz odpowiednio w proporcji, jak 5:3:2, po czym poddaje sie inkubacji w ciagu 60 minut w tempera¬ turze 37°C, a nastepnie denaturacji kwasem trójchlorooctowym i oznacza zawartosci fosforanu w znany sposób.

Wprowadzenie specyficznych czynników hamujacych aktywnosc poszczególnych fosforylaz jak np. 6-fosfo- ranu glikozy i 6-fosforanu dezoksyglikozy moze spowodowac zahamowanie aktywnosci enzymu specyficznego dla serca co umozliwia zróznicowanie fosforylaz i rozróznienie izofosforylaz jak i oznaczenie aktywnosci poszcze¬ gólnych izofosforylaz. Rozdzielenie poszczególnych izofosforylaz mozna przeprowadzic metoda elektroforetycz- nego rozdzialu izofosforylaz wydzielonych za pomoca wyzej opisanej obróbki surowicy na kolumnie wypelnio¬ nej skrobia.

Eluat z kolumny rozciencza sie w proporcji 2:1 za pomoca 1,2 m roztworu sacharozy i rozdziela izofosfory- lazy metoda krazkowa na zelu zlozonym z 5% akryloamidu, 0,2% N^-metylodwuakryloamidu, zawierajacym 0,1% glikogenu i zbuforowanym roztworem o pH 8,2 zlozonym z tris-/hydroksymetylo/-aminometanu, kwasu etylenodwuaminoczterooctowego i kwasu borowego. Wymieniony roztwór równoczesnie spelnia role buforu elektrodowego. Zel z rozdzielonymi izofosforylazami inkubuje sie w roztworze o wartosci pH 6,8 zawierajacym 1-fosforan glikozy, monofosforan adenozyny, 0-glicerofosforan sodu, kwas etylenodwuaminoczterooctowy, mer¬ kaptoetanol i fluorek sodu, po czym okresla sie zawartosc pochodnych glikogenu o bocznych lancuchach typu arnylozy za pomoca reakcji barwnej z roztworem jodu w jodku potasu.

Sposób wedlug wynalazku stanowi szczególnie przydatna metode do bezblednej diagnozy zawalu miesnia sercowego, co dotychczas nie bylo mozliwe ze wzgledu na stosowanie metod polegajacych na oznaczaniu enzy- rpów niespecyficznych dla serca. W surowicy krwi osób zdrowych nie mozna stwierdzic aktywnosci fosforylaz w zakresie dajacym sie zmierzyc. Z powyzszego powodu mozliwosc stwierdzenia obecnosci fosforylazy w surowi¬ cy krwi osoby, u której podejrzewa sie wystapienie zawalu ma istotne znaczenie diagnostyczne.

Wynalazek ilustruja nizej podane przyklady, z których przyklad I objasnia sposób oznaczania fosforylazy, która pojawia sie we krwi przy zawale, przyklad II objasnia sposób oznaczania specyficznej dla serca izofosfory- lazy miesniowej.

Przyklad la. Sposób oznaczania fosforylazy. Stosuje sie nastepujace odczynniki w postaci pieciu roztworów: Roztwór1: 0,1 m fluorek sodu 0,001 m 0-glicerofosforan sodu, pH 6,1 0,015 m merkaptoetanol Roztwór2: 0,04 m Pglicerófosforan sodu, pH 6,8 0,001 m kwas etylenodwuaminoczterooctowy 0,015 m merkaptoetanol Roztwór 3: 0,04 m glicyloglycyna, pH 6,8 0,01 m merkaptoetanol 0,008 m kwas etylenodwuaminoczterooctowy Roztwór4: 3,3% glikogen Roztwór 5: 0,083 m fosforan glikozy 0,005 m monofosforan adenozyny Surowice zateza sie za pomoca filtracji przez membrane do stezenia jak 2:1 do 3:llub poddaje traktowa¬ niu nierozpuszczalna skrobia, tj. w tym drugim przypadku 3-4 ml surowicy, w temperaturze 4°C, przepuszcza sie przez kolumne skrobiowa (2X1 cm) uprzednio doprowadzona do stalej wartosci pH roztworem 1. Kolumne przemywa sie 3-krotnie 3 ml porcjami roztworu 1, a nastepnie w temperaturze 30°C eluuje fosforylaze 2 ml roztworu 2. 1 czesc zatezonej surowicy miesza sie z 1 czescia roztworu 3; do ^ czesci tej mieszaniny wzglednie eluatu z kolumny skrobiowej dodaje sie 3 czesci roztworu 4 i 2 czesci roztworu 5, po czym inkubuje w ciagu 60 minut w temperaturze 37°C, denaturuje kwasem trójchlorooctowym i oznacza fosforan wedlug znanych metod.94983 3 Przyklad Ib. Sposób oznaczania fosforylazy przez okreslenie zawartosci produktu reakcji 1-fosforanu glikozy powstajacego przy udziale enzymów pomocniczych fosfoglikomutazy i 6-fosforanodehydrogenazy gliko- zy oraz dwunukleotydodwufosforanu nikotynoamidoadeniny w'sprzezonej próbie enzymatycznej (Tes UV). Sto¬ suje sie nastepujace odczynniki: Roztwór6: 0,3 m octan magnezowy, pH 6,8 Roztwór7: 0,02 m monofosforan adenozyny Roztwór8: 0,04 m dwunukleotydodwufosforan nikotynoaminoadeniny, utleniony Roztwór 9: fosfoglikomutaza w 0,05 octanie sodowym (pH 5,3) 1,1 mg proteiny/ml; 100 jednostek/mg proteiny (oczyszczona przez Sephadex G 25) Roztwór 10: 6-fosforanodehydrogenaza glikozy w 0,001 m kwasie etylenodwuaminoczteroocto- wym, 0,01 mNH4OH(pH9), 1,4 mg proteiny/ml; 350 jednostek/mg proteiny (oczyszczona przez Sephadex G 25) Roztwór 11: 0,5 m kwasny fosforan potasowy, pH 6,8 Roztwór 12: 0,0004 m 1,6-dwufosforan glikozy Surowice nanosi sie na kolumne skrobiowa w sposób opisany w przykladzie la i po przemyciu roztworem 1, eluuje mieszanina skladajaca sie z 2 czesci roztworu 2 i 1 czesci roztworu 4. 2 ml eluatu umieszcza sie w kuwecie miarowej ze specjalnego szkla optycznego lub kwarcu i miesza sie z 0,05 ml roztworu 6, 0,15 ml roztworu 7, 0,05 ml roztworu 8, 0,03 ml roztworu 9, 0,02 ml roztworu 10 i 0,52 ml H20, po czym inkubuje w czasie 5-10 minut w temperaturze 37°C, a nastepnie mierzy sie gestosc optyczna przy 340 nm za pomoca odpowiedniego przyrzadu optycznego. Przez dodanie 0,15 ml roztworu 11 i 0,03 ml roztworu 12 stwierdza sie aktywnosc fosforylazy i na podstawie wyznaczonego podwyzszenia ekstynk¬ cji w czasie od 10 do 60 minut oznacza wytworzony 1-fosforan glikozy, a nastepnie znanym sposobem oblicza sie aktywnosc fosforylazy.

Przyklad Ic. Postepuje sie wedlug sposobu opisanego w przykladzie la, z tym, ze oznaczenie aktyw¬ nosci enzymu przeprowadza sie w obecnosci specyficznych substancji hamujacych aktywnosc jednej izofosforyla- zy, co pozwala z róznicy uzyskanej miedzy wynikami oznaczen wedlug przykladu la wyliczyc aktywnosc specyficznej dla serca fosforylazy miesniowej.

Przyklad H. Sposób rozdzielania izofosforylaz i oznaczania aktywnosci enzymów. Stosuje sie naste¬ pujace odczynniki w postaci trzech roztworów: Roztwór 1: 0,042 m tris-/hydroksymetylo/-aminometan 0,001 m kwas etylenodwuaminoczterooctowy 0,049 m kwas borowy, pH 8,2 Roztwór2: 0,03 m 1-fosforan glikozy 0,002 m monofosforan adenozyny 0,002 m 0-glicerofosforan sodu, pH 6,8 0,002 m kwas etylenodwuaminoczterooctowy 0,001 m merkaptoetanol 0,1 m fluorek sodu Roztwór 3: 0,01 mjod 0,014 m jodek potasu Równe ilosci eluatu zawierajacego fosforylaze uzyskane wedlug przykladu la z kolumny skrobiowej roz¬ ciencza sie w proporcji 2:1 za pomoca 1,2 m roztworu sacharozy i rozdziela izofosforylazy za pomoca elektrofo¬ rezy krazkowej stosujac zel zlozony z 5% akryloamidu, 0,2% N^-metylodwuakryloamidu i zawierajacy 0,1% glikogenu, zbuforowany roztworem 1, stanowiacym równoczesnie bufor elektrodowy. Zel z rozdzielonymi izo- fosforylazami poddaje sie inkubacji w roztworze 2, przy czym otrzymuje sie pochodne glikogenu o bocznych lancuchach typu amylozy, które okresla sie za pomoca reakcji barwnej, wywolanej roztworem 3.

Claims (3)

Zastrzezenia patentowe

1. Sposób oznaczania aktywnosci fosforylaz glikogenu we krwi, znamienny tym, ze surowice za¬ geszczona w proporcji od 2:1 do 3:1 przez filtracje membranowa miesza sie z roztworem zlozonym z glicylogli- cyny, merkaptoetanolu i kwasu etylenodwuaminoczterooctowego, o wartosci pH 6,8 i otrzymana mieszanine laczy sie z roztworem glikogenu i roztworem 1-fosforanu glikozy i monofosforanu adenozyny, w proporcji 5:3:2,4 94983 po czym poddaje inkubacji w ciagu 60 minut w temperaturze 37°C, a nastepnie denaturacji kwasem trójchloro- octowym i oznacza zawartosc fosforanu w znany sposób.

2. Sposób oznaczania aktywnosci fosforylaz glikogenu we krwi, znamienny tym, ze surowice nanosi sie w temperaturze 4°C na kolumne wypelniona skrobia i doprowadzona do stalej wartosci pH 6,1 za pomoca roztworu zlozonego z fluorku sodu, (3-glicerofosforanu sodu i merkaptoetanolu, przemywa kolumne tym roztwo¬ rem, eluuje fosforylazy w temperaturze 30°C przy pH 6,8, za pomoca roztworu zlozonego z 0-glicerofosforanu sodu, kwasu etylenodwuaminoczterooctowego i merkaptoetanolu i otrzymany eluat laczy sie z roztworem gliko¬ genu i roztworem 1-fosforanu glikozy i monofosfcranu adenozyny, w proporcji 5:3:2, po czym poddaje inkubacji w ciagu 60 minut w temperaturze 37°C, a nastepnie denaturacji kwasem trójchlorooctowym i oznacza zawartosc fosforanu w znany sposób.

3. Sposób oznaczania aktywnosci fosforylaz glikogenu we krwi, znamienny tym, ze surowice nanosi sie w temperaturze 4°C na kolumne wypelniona skrobia i doprowadzona do stalej wartosci pH 6,1 za pomoca roztworu zlozonego z fluorku sodu,/3-glicerofosforanu sodii i merkaptoetanolu, przemywa kolumne tym roztwo¬ rem, eluuje fosforylazy w temperaturze 30°C przy pH 6,8 za pomoca roztworu zlozonego z (3-glicerofosfanu sodu, kwasu etylenodwuaminoczterooctowego i merkaptoetanolu i otrzymany eluat rozciencza 1,2 m roztworem sacharozy odpowiednio w proporcji 2:1 i rozdziela izofosforylazy metoda elektroforezy krazkowej na zelu akry¬ lowym, zawierajacym 0,1% glikogenu i zbuforowanym roztworem zawierajacym tris-/hydroksymetylo/-aminomc- tan, kwas etylenodwuaminoczterooctowy i kwas borowy, po czym zel z rozdzielonymi izofosforylazami inkbuje w roztworze wodnym zawierajacym 1-fosforan glikozy, monofosforan adenozyny, 0-glicerofosforan sodu, kwas etylenodwuaminoczterooctowy, merkaptoetanol i fluorek sodu, a otrzymany produkt, stanowiacy pochodna gli¬ kogenu o bocznych lancuchach typu amylozy, oznacza sie w znany sposób po zabarwieniu za pomoca odczynni¬ ka jod-jodek potasu. Prac. Poligraf. UP PRL naklad 120+18 Cena 10 zl