DE2355094B2

DE2355094B2 - Verfahren zur Herstellung eines Tetanus-Impfstoffs

Info

Publication number: DE2355094B2
Application number: DE2355094A
Authority: DE
Inventors: Torsten B. Dr. 3550 Marbach Helting
Original assignee: Behringwerke AG
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Germany
Priority date: 1973-11-03
Filing date: 1973-11-03
Publication date: 1978-10-05
Also published as: AU7490974A; DE2355094A1; AU497398B2; DK143383C; GB1492596A; IE40098L; ATA876674A; NL7414114A; US4007265A; DK571574A; JPS5071820A; LU71223A1; DE2355094C3; IL45960A; CA1038293A; FR2249679B1; FR2249679A1; DK143383B; BE821833A; IE40098B1

Description

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Tetanus-Impfstoffs.

Es sind bereits Tetanus-Impfstoffe bekannt, die das inaktive Tetanustoxin — das sogenannte Tetanustoxoid — enthalten. Bei Verwendung solcher Impfstoffe konnten jedoch Impfreaktionen nicht ganz ausgeschlossen werden. Es ist auch schon versucht worden, das Tetanustoxin zu inaktivieren und in einer weiteren Verfahrensstufe das erhaltene Tetanustoxiod mit Pepsin zu spalten. Dieses Verfahren ist aber zeitraubend, da allein die Inaktivierung mehrere Wochen in Anspruch nimmt.

Es wurde nun ein Verfahren zur Herstellung eines Tetanus-Impfstoffs gefunden, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Tetanustoxin mit 0,5 bis 2 Einheiten Papain pro 1 mg Toxin bei 40—60⁰C und einem pH-Wert zwischen 5 und 8, gegebenenfalls in Gegenwart einer Sulfhydrylgruppen spaltenden Verbindung, behandelt, das atoxische und immunogene Produkt isoliert und gegebenenfalls unter Verwendung eines Adjuvans zu einem Impfstoff aufarbeitet. Gemäß der Erfindung wird die übliche Toxoidierung mittels Formaldehyd ersetzt durch die Toxoidierung mittels einer Protease, nämlich Papain. Das so gewonnene Toxoid zeichnet sich durch größere Verträglichkeit aus; es unterscheidet sich auch hinsichtlich der Molekiilgröße vom Formaldehyd-Toxoid und vom Toxin. Dabei läuft die Toxoidierung und die Verkleinerung des Antigens in einer Stufe ab, während beim entgegengehaltenen Stand der Technik gemäß der DT-OS 16 17 344 erst mittels Formaldehyd toxoidiert werden muß, bevor der proteolytische Abbau einsetzen kann. Daß die Toxoidierung durch das alleinige Einwirken von Papain möglich ist, war überraschend und nicht vorherzusehen.

Bevorzugte Ausführungsformen des Verfahrens sind dadurch gekennzeichnet, daß man bei einer Temperatur von 53—55°C arbeitet, daß man bei einem pH-Wert von 6,5 arbeitet und daß man die Papain-Behandlung in Gegenwart von Cysteinhj drochlorid ausführt.

Der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Tetanus-Impfstoff weist eine gute Verträglichkeit auf.

Als Ausgangsmaterial für die Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet man Tetanustoxin, das auf bekannte Weise durch Züchten von Tetanusbazillen und anschließende Isolierung als KuI-turfiltrat gewonnen wird. Es kann gewünschtenfalls vorgereinigt werden, wobei der Reinigungsprozeß zweckmäßig so geleitet wird, daß das gereinigte Toxin als Lösung in 0,15 molarem wäßrigem Natriumchlorid vorliegt. Solches Tetanustoxin besitzt eine Konzentration von 2200 bis 3000 Lf pro mg Stickstoff Toxin, wobei Lf. für Limes floculationis verwandt wird. Man versteht darunter diejenige Menge Antigen, die eine Intemationale Lf-Einheit Antiserum ausflockt.

Zur Gewinnung eines für die erfindungsgemäße Weiterverarbeitung besonders geeigneten Toxins kann man beispielsweise das vorgereinigte Tetanustoxin (gelöst in 0,15 molarer Natriumchloridlösung) mit dem

to gleichen Volumen eines Puffers, z. B. 0,1 molarem Phosphatpuffer pH 5—8, vorzugsweise pH 6,5, der noch 0,001 M eines Komplexbildners wie Äthylendiamintetraacetat (EDTA) enthält, vermischen und dieser Lösung eine Sulfhydrylverbindung, z. B. Cysteinhydrochlorid in einer Konzentration von 0,0005 bis 0,005, vorzugsweise 0,001 molar, zusetzen.

Papain ist in löslicher Form oder an einen unlöslichen Träger gebunden im Handel erhältlich. Die Aktivität des Papains wird mit a-N-Benzoyl-L-Argininäthylester (BAEE) bestimmt. Eine Einheit Papain (1 E) hydrolysiert 1 μηιοί BAEE pro Minute bei pH 6,2 und 25°C.

Papain wird der Toxinlösung in einer Konzentration von 0,5 bis 2,0, vorzugsweise 1 E Papain pro mg Tetanustoxin, zugesetzt.

Ein Milligramm Tetanustoxin entspricht 320—400 Lf-Einheiten. Die Behandlung des Tetanus-Toxins mit Papain erfolgt zweckmäßig während mehrerer Stunden bei erhöhter Temperatur. Eine Vorbehandlung bei etwas niedrigerer Temperatur ist besonders vorteilhaft.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird nach einer einstündigen Vorinkubation bei 40⁰C bis 45°C — die Vorinkubation wird insbesondere bei kleinen Volumina vorgenommen — das Reaktionsgemisch 1 —5 Stunden, vorzugsweise 2 Stunden, bei einer Temperatur von 40—6O⁰C, vorzugsweise von 53-55°C, inkubiert.

Nach dem Abkühlen und — falls ein trägergebundenes Papain verwendet wird — nach dem Abtrennen des Papains, z. B. durch Zentrifugation, wird das Reaktionsgemisch durch ein Molekularsiebverfahren in verschiedene Komponenten aufgetrennt. Zweckmäßig wird dazu ein Verfahren mittels Molekularsieben mit einer Trennwirkung für Molekulargewichte zwischen etwa 20 000 und 60 000 angewendet. Besonders geeignet sind dafür vernetzte Dextrane, z. B. solche, die unter den geschützten Warenzeichen SephadexW G-IOO oder SephadexW G-200 sowie Bio-GelW P-i00 erhältlich sind. Sephadex ist ein mit Epichlorhydrin vernetztes Dextran in Kugelform. Sephadex G-100 hat einen Fraktionierungsbereich für globuläre Moleküle mit Molekulargewichten von 4000-150 000, für lineare Moleküle von Molekulargewichten 1000—100 000. Der Fraktionierungsbereich für Sephadex G-200 überstreicht Molekulargewichte von 5000—800 000 für globuläre Moleküle und 1000-200 000 für lineare Moleküle. Sephadex ist ein Produkt der Firma Parmacia, Uppsala.

Bio-Gel P ist ein Gelfiltrationsmedium, bestehend aus einem Copolymeren von Acrylamid und Methylenbisacrylamid. Bio-Gel P-100 weist einen Fraktionierungsbereich für globuläre Moleküle von 5000—100 000 auf. Es wird von Bio-Rad Laboratories, Richmond/Californien, hergestellt.

Vorzugsweise wird eine Sephadex G-100-Säule

b5 verwendet, z.B. mit den Maßen 10 χ 100cm. Zur Elution dienen die für diesen Zweck bekannten Elutionsmittel, insbesondere Pufferlösungen wie z. B. 0,10 molarer Tris(oxymethyl)amino-methan-Salzsäure-

puffer pH 8,0, der Natriumchlorid etwa in einer Konzentration von 0,1 — 1 Mol enthalten kann. Bei der Elution werden die Fraktionen, die eine Absorption bei 280 nm aufweisen, getrennt gesammelt. Es entstehen vier Fraktionen, die zweite stellt das Verfahrensprodukt dar. Nach der Ankonzentrierung der zweiten Fraktion, z. B. durch Lyophilisation, kann man durch eine nochmalige Chromatographie unter den gleichen Bedingungen eine weitere Reinigung erzielen. Dabei werden letzte Reste toxischer Substanzen entfernt. Zur weiteren Reinigung kann das Produkt gewünschtenfalis einer 10- bis 20-, vorzugsweise 15-stündigen Dialyse gegen 0,15 molares Natriumchlorid unterzogen und/ oder sterilfiltriert werden. Zweckmäßig wird das Produkt noch mit einem Adjuvans, z. B. Aluminiumhydroxid, gemischt. Durch Verdünnung mit 0,15 molarer Natriumchloridlösung wird die Konzentration auf den gewünschten Lf-Wert eingestellt. Diese Substanz stellt den neuen Impfstoff dar.

Die Toxizität des erfindungsgemäßen Impfstoffs wurde an Meerschweinchen bestimmt. 5 Gruppen mit je zwei Meerschweinschen erhielten subcutan 0,5 ml einer Lösung des erfindungsgemäß hergestellten Produktes, wobei Verdünnungen mit 25; 50; 100; 200 und 400 Lf/ml verwendet wurden. Die Meerschweinchen die 4 Tage lang nach der Injektion kontrolliert wurden, blieben gesund und wiesen eine normale Gewichtszunahme auf. Die Wirksamkeit des Verfahrensproduktes wurde im Schutzversuch an Meerschweinchen ermittelt. 10 Tiere erhielhten jeweils 2 ml des Verfahrensproduktes mit 0,75 Lf/ml. Nach 4 Wochen bekamen sie eine Belastungsinjektion von 20 dim Tetanustoxin, wobei dim die dosis letalis minima bedeutet. Die Überlcbensrate der Meerschweinchen durch die Immunisierung mit dem Verfahrensprodukt war 100%.

Die Verträglichkeit wurde an Meerschweinchen geprüft. 5 Meerschweinchen erhielten jeweils subcutan an drei verschiedenen Körperstellen 0,1 ml eines Tetanus-Antiserums, das 1,0, 0,3 bzw. 0,1 Internationale Einheiten pro ml Tetanus-Antitoxin enthält (1 Inernationale Einheit (I.E.) eines Tetanus-Antiserums ist diejenige Menge, die in ihrer Wirksamkeit derjenigen von 0,03 384 mg des von der WHO (World Health Organization) abgegebenen Tetanus-Antitoxin-Standards entspricht (Biological Substances — WHO-Veröffentlichung Genf 1972, Seite 14). Dieses Antiserum wurde durch Immunisierung von Meerschweinchen mit einem bekannten Impfstoff gewonnen. Gleichzeitig erhielt jedes Tier an drei anderen Injektionsstellen 0,1 ml eines zweiten Tetanusserums, das ebenfalls 1,0,0,3 bzw. 0,1 I.E./ml Tetanus-Antioxin enthielt. Dieses zweite Tetanus-Antiserum wurde durch Immunisierung von Meerschweinchen mit dem erfindungsgemäßen Produkt gewonnen. Nach 2 Stunden wurde den Tieren intravenös 1 ml eines herkömmlichen Tetanus-Fluid-Impfstoffes mit 100 Lf/ml verabreicht, dem noch 0,5% des Farbstoffes »Evans Blue« zugemischt worden waren. Nach 30 Minuten wurden die Tiere getötet, und es wurde die durch die passive Haut-Anaphylaxie entstandene Blaufärbung gemessen. Dabei zeigte das mit dem bekannten Impfstoff, (Inaktivierung mit Formaldehyd) gewonnene Antiserum eine deutliche Anaphylaxie. Das mit dem Verfahrensprodukt erzeugte Antiserum war jedoch frei von Zeichen einer Anaphylaxie.

Der neue Impfstoff kann für sich allein, aber auch in Kombination mit anderen Impfstoffen angewandt werden. Zur Kombination eignen sich insbesondere Diphtherietoxoid, Pertussisimmunogen. Poliomyelitisvieren oder Masernviren.

Versuchsbericht

Parenteral mit einem Tetanustoxoid vorimmunisierte Hunde, in deren Serum kein Tetanus-Antitoxin nachzuweisen ist, erhalten 21 Tage nach der parenterakn Impfstoff-Applikation und an den folgenden beiden Tagen jeweils 1500 Lf des erfindungsgemäßen Produktes, verkapselt in einer säurefest lackierten Gelatinekapsel, oral verabreicht. Am 30. Tag nach Versuchsbeginn zeigen alle Tiere nachweisbare Tetanus-Antitoxin-Titer, deren Werte zwischen 1 — 10 IE Tetanus-Antitoxin pro ml Serum schwanken.

Beispiel 1

450 000 Lf Tetanustoxin in 15 ml einer 0,15 molaren Natriumchlorid-Lösung (mit 2200 Lf/mg Stickstoff) werden mit 15 ml 0,1 molarem Phosphatpuffer pH 6,5, der 0,001 molares EDTA enthält, verdünnt, mit 1500 U löslichem Papain in 5 ml 0,15 molarer Natriumchloridlösung versetzt und 3 mg Cysteinhydrochlorid zugegeben. Nach dem Durchmischen wird dieser Ansatz 1 Stunde bei 45°C, dann 2 Stunden bei 53°C gehalten, nach dem Abkühlen auf eine Sephadex G-100-Säule (10 χ 100 cm) aufgetragen und mit einer Pufferlösung aus 0,1 molarer Lösung von Tris (Oxymethyl)-aminomethan in 1-molarer Natriumchloridlösung, die mit Salzsäure auf den pH-Wert 8 eingestellt wurde

jo (»Tris-Salzsäure-Puffer pH 8«), unter kontinuierlicher Messung der Absorption im Bereich der Wellenlänge 280 nm Chromatographien. Die Fraktionen, die in diesem Bereich eine Absorption zeigen, werden getrennt aufgefangen. Es entstehen vier Fraktionen,

J5 wobei die erste Fraktion einen Doppelgipfel darstellt. Die zweite Fraktion wird einer nochmaligen Chromatographie unter denselben Bedingungen unterzogen und die daraus resultierende 2. Fraktion 15 Stunden gegen 0,15 molares Natriumchlorid dialysiert, sterilfiltriert, mit 0,15 molarem Natriumchlorid die Konzentration des Produkts auf 26 Lf/ml eingestellt und mit Aluminiumhydroxid bis zu einer Konzentration von 0,2% Al(OH)₃ vermischt.
Die Ausbeute, bezogen auf Lf-Einheiten, beträgt 90%.

Die spezifische Flockungsaktivität wurde mit 6800 Lf/mg Stickstoff bestimmt. Die Überlebensrate der Meerschweinchen im Schutzversuch beläuft sich auf 100%.

Die Sedimentationskonstante des Produkts ist 3 S gegenüber 6,4 S des Ausgangsproduktes und das Molekulargewicht etwa 40 000 gegenüber 140 000 des Ausgangsproduktes.

Beispiel 2

15 ml steriles Kulturfiltrat (100 000 Lf), das durch Züchten von Tetanusbazillen und anschließende Isolierung gewonnen wurde, werden mit 15 ml 0,1 molarem Phosphatpuffer, pH 6,5, der 0,001 M EDTA enthält, verdünnt, mit 300 U löslichem Papain in ImI 0,15 molarer Natriumchloridlösung versetzt und 3 mg Cysteinhydrochlorid zugegeben. Die Inkubation und Aufarbeitung wird gemäß Beispiel 1 durchgeführt. Die Ausbeute, bezogen auf Lf-Einheiten, beträgt 50%.

Beispiel 3

450 000 Lf Tetanustoxin in 15 ml einer 0,15 molaren Natriumchlorid-Lösung (mit 2200 Lf/mg Stickstoff) werden mit 15 ml 0,1 molarem Phosphatpuifer pH 6,5,

01 molares EDTA enthält, verdünnt, mit 1500 U ;ebundenem Papain in 5 ml 0,15 molarer Natriiridlösung versetzt und 3 mg Cysteinhydrochlorid

ι Inkubation, wie in Beispiel 1 beschrieben, wird ägergebundene Papain durch Zentrifugation it und der Überstand gemäß Beispiel 1 aufgear-

Ausbeute und Eigenschaften des Verfahrenspro-

duktes entsprechen denen des Beispiels 1.

Die gleichen atoxischen immunogenen Produkte werden erhalten, wenn die Verfahren der Beispiele 1 bis 3 ohne Zusatz von Cysteinhydrochlorid durchgeführt werden. Lediglich die Ausbeute ist in solchen Fällen um eiwa 10% geringer als bei dem Verfahren, bei dem Sulfhydrylgruppen enthaltende Verbindungen zur Aktivierung des Papains beitragen.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung eines Tetanus-Impfstoffes, dadurch gekennzeichnet, daß man Tetanus-Toxin mit 0,5 bis 2 Einheiten Papain pro 1 mg Toxin bei 40—6O⁰C und einem pH-Wert zwischen 5 und 8 behandelt, das atoxische und immunogene Produkt isoliere und gegebenenfalls unter Verwendung eines Adjuvans in üblicher Weise zu einem Impfstoff konfektioniert.

2. Verfahren nach Anspruch I₁ dadurch gekennzeichnet, daß die Behandlung in Gegenwart einer Sulfhydrylgruppen enthaltenden Verbindung erfolgt.