DE2327133A1

DE2327133A1 - 2-subst.-thio-s-triazolo eckige klammer auf 1,5a eckige klammer zu -pyrimidine

Info

Publication number: DE2327133A1
Application number: DE19732327133
Authority: DE
Inventors: Thomas Novinson; Darell Eugene O'brien; Robert Henry Springer
Original assignee: ICN Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Valeant Pharmaceuticals International Inc USA
Priority date: 1972-06-07
Filing date: 1973-05-28
Publication date: 1974-01-03
Also published as: NL7307573A; AU5588273A; BE800550A; ES415389A1; FR2187295A1; CA1010863A; GB1423266A; FR2187295B1

Description

Wie von Sutherland et al "Cyclic AMP", Am. Rev. Biochem. 37, 149, (1968), angegeben wird, ist cyclisches Adenosinmonophosphat (C-AiMP) als intrazellularer "second messenger" anzusehen, wobei diese Verbindung viele der Wirkungen einer Vielzahl von verschiedenen Hormonen vermittelt. Nach dieser Theorie beeinflussen erste "messenger"-Hormone, und zwar Epinephrin und Norepinephrin, die Adenylcyclase, die sich auf oder in den Zellwänden befindet, unter Bildung von intrazellularem cyclischem AMP aus Adenosintriphosphat nach dem Empfang des extrazellularen Hormonsignals. Das gebildete cyclische AMP seinerseits wirkt als zweiter "messenger" und stimuliert intrazellulare Funktionen, insbesondere im Zusammenhang mit Zielzellen des Hormons. Cyclisches AMP "aktiviert" daher Proteinkinasen, die ihrerseits physiologische Wirkungen erzeugt, beispielsweise eine Muskelkontraktion, eine Glykogenolyse, eine Steriodogenese und eine Lipolyse.

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Cyclisches- AMP wird jedoch in vivo durch Phosphodiesteraseenzyme zersetzt, welche eine Hydrolyse des cyclischen Purinnukleotids zu 5'-Adenosinmonophosphat katalysieren, was einen Verlust der Funktion zur Folge hat. Es wurde daher vorgeschlagen, substituierte cyclische AMP Analoga, die gegenüber einem Phosphodiesteraseabbau widerstandsfähiger sind als das natürlich vorkommende cyclische Nukleotid, zu verabreichen, um ein Verzögern von Zellprozessen zu unterstützen. Eine synthetische Herstellung derartiger Verbindungen ist jedoch sehr kostspielig. Es wäre daher vorteilhaft, die günstigen Wirkungen von natürlich erzeugtem cyclischem AMP in der Weise zu erhöhen, daß Verbindungen verabreicht werden, welche dazu in der Lage sind, die unerwünschten Wirkungen von Phosphodiesteraseenzymen zu inhibieren.

Sutherland et al vermuten in "Circulation 37, 279 (1968), daß die pharmakologischen Wirkungen von Theophyllin, das die Struktur OH

besitzt, das Ergebnis seines Vermögens sind, die Wirkung von Phosphodiesteraseenzymen zu inhibieren. Theophyllin wurde daher anstelle der Adenylcyclase stimulierenden Hormone Epinephrin und Norepinephrin als Herzstimulanz anschließend an einen Herzstillstand sowie in hartnäckigen Asthmafällen als Bronchialdilatator verwendet. Theophyllin vermag jedoch nicht in selektiver Weise eine Phosphodiesterase zu inhibieren, sondern hat vielmehr eine allgemeine Stimulierung des zentralen Nervensystems zur Folge. Daher kann die Verwendung von Theophyllin den Empfänger nervös und reizbar machen, wobei ferner kardiovaskuläre Wirkungen, d.h. ein schnelles Herzschlagen, erzeugt werden können. Theophyllin ist daher nicht so wirksam als Phosphodiesteraseinhibitor so wie dies gewünscht wird und muß folglich in größeren Mengen eingesetzt werden, die natürlich die vorstehend geschilderten unerwünschten Wirkungen verstärken können.

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Wie in der DT-OS 22 57 547 angegeben ist, haben sich verschiedene 5 , 7-Dialkyl- und 5-Alkyl-3 , 7-disubst. -pyrazolo^T, 5a/-pyramidine als Verbindungen mit phdsphodiesteraseinhibierenden Eigenschaften erwiesen. Eine weitere Untersuchung dieser Verbindungen hat gezeigt, daß 3-Brom-5,7-dimethylpyrazolo/T,5a7-pyrimidin nicht nur signifikant aktiver als Theophyllin gegen verschiedene Phosphodiesteraseenzyme ist, sondern auch eine positive inotrope Wirkung in einem anästhesierten Hund zu erzeugen vermag. Dies hat zur Untersuchung von weiteren. Derivaten derartiger Pyrazolo^i,5a/-pyrimidinringsysteme einschließlich der 6-Carbäthoxypyrazolo^1,5a/-pyrimidine geführt (vgl. die genannte DT-OS 22 57 547) .

Durch die Erfindung werden nunmehr neue Verbindungen zur Verfügung gestellt, welche der nachstehend angegebenen Formel entsprechen und Enzymphosphodxesterase zu inhibieren vermögen.

In dieser Formel steht R für Alkyl oder einen aromatischen oder substituierten aromatischen Kern, beispielsweise Benzyl, subst,-Benzyl, wobei es sich auch um einen heteroaromatischen oder mehrkernigen aromatischen Kern handeln kann., R₁ ist CH.,, OH, Halogen, ein Amin, ein Aminsalz oder eine Merkaptogruppe, R₂ bedeutet Wasserstoff" oder Carbäthoxy, während R₃ CH₃ oder H' darstellt. Ist R₂ Carbäthoxy, dann steht R₃ für H.

Wie aus den nachstehenden Ausführungen und Beispielen hervorgeht, kann R eineAlky!gruppe sein, und zwar eine verzweigte oder substituierte Alkylgruppe, wie anhand der Verbindungen 8, 10, 17, 21 und 22 gezeigt wird. Vorzugsweise enthält die Alkylgruppe 1 bis 6 Kohlenstoffatome. R kann ferner ein aromatischer Substituent oder ein substituierter aromatischer Kern sein, beispielsweise Benzyl, substituiertes Benzyl (Verbindungen 4, 12 bis 15), desgleichen kann es sich um einen heteroaromatischen

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Kern (Verbindung 16), einen mehrkernigen aromatischen Kern (Verbindung 17 und 20) sowie um eine Aralkylgruppe (Verbindung 23) handeln. R₁ kannOH, Halogen, ein NHR'-, N(R¹)-- oder N-N(R^I)₂~^{Amin sein} (vgl. die Verbindungen 26 bis 29, 33 und 39), wobei R¹ vorzugsweise eine C..- bis C_g-Alkyl oder ein substituiertes Alkyl oder eine Piperidinogruppe (Verbindung 30) oder eine Morpholinogruppe (Verbindungen 31 und 37), ein Aminsalz (Verbindung 32·, und zwar das Dihydrochloridsalz von Hydrazin) oder eine Merkaptogruppe (Verbindungen 34 und 40) sein kann.

Die zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen eingehaltene allgemeine Methode wird in Verbindung mit der nachfolgenden schematischen Darstellung näher erläutert. Die verschiedenen Verbindungen werden durch die Nummer 1 bis 41 gekennzeichnet. Die Kondensation von 3-Amino-5-benzylthio-s-triazol (Verbindung 1) oder S-Amino-S-p-chlorbenzylthio-s-triazol (Verbindung 2) mit Acetylazeton in Äthanol, das Piperidin enthält, liefert 2-Benzylthio-5,7-dimethyl-s-triazolo^i,5a7-pyrimidin (Verbindung 3) bzw. 2-p-Chlorbenzylthio-5,7-climethyl-s-triazolo^1 ,5a/-pyrimidin (Verbindung 4) Nach der von L.A. Williams in J.Chem.Soc, 1829 (1960) , beschriebenen Arbeitsweise wird 3-Amino-5-merkapto-s-triazol (Verbindung 5) mit Acetylazeton in Essigsäure zur Gewinnung von 5,7-Dimethyl-2-merkapto-s-triazolo/T,5a7-pyrimidin (Verbindung 6) kondensiert. Wirddiese Verbindung mit Benzylchlorid in einer alkalischen Lösung behandelt, dann erhält man auch die Verbindung 3, welche in jeder Beziehung mit dem Produkt identisch ist, das durch direkte Kondensation erhalten wird. Eine Alkylierung der Verbindung 6 mit Alkyl- und Aralky!halogeniden liefert die Alkylthio- und Aralkylthioderivate, d.h. die Verbindungen 7 bis einschließlich 23.

Eine Kondensation der Verbindung 1 mit Azetoessigester in Essigsäure liefert 2-Benzylthio-7-hydroxy-5-methyl-s-triazolo^T,5a/-pyrimidin (Verbindung 24). Eine Behandlung dieser Verbindung unter Rückfluß mit Phosphoroxychlorid liefert 2-Benzylthio-7-chlor-5-methyl-s-triazolo^T,5a7-pyrimidin (Verbindung 25). Ein nukleophiler Ersatz des Chloranteils der Verbindung 25 mit primären und sekundären Aminen in warmem Äthanol liefert die Verbindungen

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309881/1148

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26 bis 31. Eine Umsetzung der Verbindung 26 mit Hydrazin oder nichtsymmetrischem Dimethylhydrazin liefert 2-Benzylthio-6-hydrazino-5-methyl-s-triazolo/T,5a/-pyrimidin (Verbindung 32) bzw. das entsprechende 7-Dimethylhydrazinoanalogon (Verbindung 33) Die Wirkung von Natriumhydrosulfid auf die Verbindung 25 liefert 2-Benzylthip-7-merkapto-5-methyl-s-triazolo/T,5a7~pyrimidin (Verbindung 34).

Eine Kondensation von 3-Amino-5-benzylthio-s-triazol (Verbindung 1) mit Diäthyläthoxymethylenmalonat liefert 2-Benzylthio-6-carbäthoxy-7-hydroxy-s-triazolo/T,5a7pyrimidin (Verbindung 35). Eine Behandlung dieser Verbindung unter Rückflußbedingungen mit Phosphoroxychlorid liefert in guter Ausbeute 2-Benzylthio-6-carbäthoxy-7-chlor-s-triazolo/T,5a/-_£v/riinidin _v Vor bindung 36) . Der Chloranteil dieser Verbindung unterliegt einem nukleophilen Ersatz durch verschiedene Amine, wobei die entsprechenden aminosubstituierten Verbindungen 37 bis 39 erhalten werden. Eine Behandlung der Verbindung 36 mit Natriumhydrosulfid liefert 2-Benzylthio-6-carbäthoxy-7-merkapto-s-triazolo/T,5a7-pyrimidin (Verbindung 40) .

Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele näher erläutert. Diese Beispiele dienen nur Erläuterungszwecken, ohne die Erfindung zu beschränken. In allen Beispielen beziehen sich die Teil- und Prozentangaben auf das Gewicht und die Temperaturen auf Grad Celsius, sofern nicht anders angegeben. Die Schmelzpunkte wurden unter Verwendung eines Thomas-Hoover-Schmelzpunktapparats ermittelt und sind nicht korrigiert. Alle Proben zeigen bei der Dunnschichtchromatographie einen einzigen Flecken und wurden von der Heterocyclic Chemical Corporation, Harrisonville, Missouri analysiert. Werden die Analysenergebnisse nur durch die Symbole der Elemente oder durch Funktionen angegeben, dann liegen die Analysenwerte, die für diese Elemente oder Funktionen erhalten worden sind, innerhalb +0,4 % der theoretischen Werte.

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Beispiel 1

Herstellung von S-Ainino-S-p-chlorbenzylthio-s-triazol (Verbindung 2) .

Eine Mischung aus 4,64 g (40 Millimol) 3-Amino-5-raerkapto-striazol (Verbindung 5) in 40 ml 1η Natriumhydroxid wird bei Zimmertemperatur gerührt, während eine Lösung von 7,55 g (48 Miilimol) p-Chlorbenzylchlorid in 80 ml eines absoluten Äthanols zugesetzt wird. Die Mischung wird dann auf 70 bis 75°C erwärmt und während einer Zeitspanne von 30 Minuten gerührt. Die bernsteinfarbene Lösung wird dann unter vermindertem Druck auf 40 ml eingedampft, mit 50ml Wasser verdünnt und' über- Nacht gekühlt. Das Rohprodukt wird durch Filtration abgetrennt, an der Luft getrocknet und dann zweimal aus Chloroform umkristallisiert. Dabei erhält man 4,3 g (45 %) des analytisch reinen Produktes, das einen F. von 107 bis 1O8°C aufweist.

Analyse: berechnet für C₉H₉N₄SCl (C,H,N).

Beispiel 2

Herstellung von 2-Aralkylthio-5,7-dimethyl-s-triazolo/i_f5a7~ pyrimidinen (Verbindungen 3 und 4).

Eine Lösung von 10 Millimol 3-Amino-5-aralkylthio-s~triazol (Verbindung 1 oder 2) und 1,0g (10 Millimol) Acetylazeton in 50 ml Eisessig wird bei 90°C während einer Zeitspanne von 3 Stunden gerührt und erhitzt. Nach Beendigung dieser Zeitspanne wird die Mischung zur Trockene unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird mit Wasser gewaschen und aus wässrigem Äthanol umkristallisiert. Dabei erhält man die analytisch reinen Produkte, die in der Tabelle I zusammengefaßt sind. -

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Beispiel 3 ■

Herstellung von 2-Alkylthio- und 2-Aralkylthio-5,7-dimethyls-triazolo^T,5a7-pyrimidinen (Verbindungen 3, 7 bis 23).

Eine Lösung von 1,80 g (10 Millimol) 5,7-Dimethyl-2-merkaptos-triazolo^T,5a7-pyrimidin (Verbindung 6) in 25 ml einer 0,4 η Natriumhydroxidlösung wird bei Zimmertemperatur gerührt, während eine Lösung eines Alkylhalogenids oder Aralkylhalogenids (1O Millimol) in 10 ml Methanol tropfenweise zugesetzt wird. Nachdem die Zugabe beendet ist, wird die Mischung bei Zimmertemperatur während einer Zeitspanne von 3 Stunden gerührt. Die ausgefällten Produkte werden durch Filtration abgetrennt. Diese Produkte werden aus Methanol oder wässrigem Methanol umkristallisiert. Dabei erhält man die analytisch reinen Proben, welche in der Tabelle I zusammengefaßt sind. -

Beispiel 4

Herstellung von 2-Benzylthio-7-hydroxy-5-methyl-s-triazolo /T,5a/-pyrimidin (Verbindung 24).

Eine Mischung aus 10,3 g (0,05 Mol) S-Amino-S-benzylthio-s-triazol'(Verbindung 1) und 7,91 g (0,05 Mol) Äthylacetoazetat in Eisessig wird während einer Zeitspanne von 12 Stunden am Rück-■ fluß gekocht. Nach Beendigung dieser Zeitspanne wird die Lösung abkühlen gelassen, worauf das kristalline Produkt durch Filtration abgetrennt wird. Dieses Produkt wird *mit kaltem Äthanol gewaschen und bei 100 C getrocknet. Dabei erhält man das ana-, lytisch reine Produkt, das in der Tabelle II aufgeführt ist.

3 0 9 8 8 1 / 1 1 4 S

_ Q —

Beispiel 5

Herstellung von 2-Benzylthio-7-chlorⁱ-5-methyl-s-triazolo /T/Sa/—pyrimidin (Verbindung 25) .

Eine Mischung aus 5,4 g (20 Millimol) 2-Benzylthio-7-hydroxy-5-methyl-s-triazolo/T,5a/pyrimidin in 100 ml Phosphoroxychlorid wird unter Rückfluß unter leichtem Rühren erhitzt. Nach Beendigung von 1 Stunde wird der Überschuß an Phosphoroxychlorid unter vermindertem Druck entfernt, worauf der sirupartige Rückstand langsam zu 250 g eines zerstoßenen Eises unter gutem Rühren gegeben wird. Die erhaltene Mischung wird mit 5 χ 50 ml Methylenchlorid extrahiert. Die vereinigten Methylenchloridextrakte werden mit 2 χ 50 ml einer gesättigten Natriumcarbonatlösung und 2 χ 50 ml Wasser gewaschen. Der Methylenchloridextrakt wird über Natriumsulfat getrocknet und dann schnell durch 50 g eines basischen Aluminiumoxids filtriert. Das Aluminiumoxid wird mit weiteren 50 ml Methylenchlorid gewaschen. Die vereinigten Methylenchloridlösungen werden dann eingedampft. " Dann erhält man 4,1 g eines hellgelben kristallinen Produktes. Eine Umkristallisation aus Chloroform/Pentän liefert das analytisch reine Produkt, das in der Tabelle II angegeben ist.

Beispiel 6

Herstellung von 2-Benzylthio-5^inethyl-7-s'ubst ,-amino-s-triazolo-/T,5a7-pyrimidinen (Verbindungen 26 bis 33).

Eine Lösung von 2,88 g (10 Millimol) ^-Benzylthio-T-chlor-S-methyl· s-triazolo/1,5a7-pyrimidin (Verbindung 25} und 12,5 Millimol eines substituierten Amins in 30 ml eines absoluten. Äthanols wird unter Rückfluß während-einer Zeitspanne von 3 Stunden erhitzt, worauf zur Trockene eingedampft wird. Der Rückstand wird mit Wasser gewaschen und dann aus wässrigem Äthanol umkristallfsiert. Dabei erhält man die analytisch reinen Produkte, die in der Tabelle II zusammengefaßt sind.

3 0 988Ί /1 US

Eine Lösung von 2-Benzylthio-7-τhydrazino-5-methyl-s-triazolo- l_\ ,5a/-pyrimidin (Verbindung 32) in warmer verdünnter Chlorwasserstoffsäure wird abkühlen gelassen. Dabei erhält man dann das Dihydrochloridsalz des Produktes, das in der Tabelle II aufgeführt ist.

Beispiel 7

Herstellung von 2-Benzylthio-7-merkapto-5-methyl-s-triazolo- £V,5a7-pyrimidin (Verbindung 34).

Eine Suspension von 2,88 g (10'Millimol) 2-Benzylthio-7-chlor-5-methyl-s-triazolo/T,5a/-pyrimidin (Verbindung 25) und 2,20 g (Formelgewicht 0,02) in 100 ml Äthylenglykol wird bei 80⁰C während einer Zeitspanne von 1 Stunde gerührt und erhitzt. Nach Beendigung dieser Zeitspanne wird die Lösung zu 250 ml Wasser gegeben, worauf der pH auf 1 durch Zugabe von konzentrierter Chlorwasserstoffsäure eingestellt wird. Der Niederschlag wird durch Filtration abgetrennt, mit heißem Wasser gewaschen und abschließend aus absolutem Äthanol umkristallisiert. Dabei erhält man das.analytisch reine Produkt, das in der Tabelle II angegeben ist.

Beispiel 8

Herstellung von 2-Benzylthio-G-carbathoxy-?-hydroxy-s-triazolo-YT,5a/-pyrimidin (Verbindung 35).

Eine Lösung von Natriumäthylat in Äthanol (hergestellt durch Auflösen von 3 g Natrium (Formelgewicht 0,13) in 250 ml eines absoluten Äthanols) wird bei Zimmertemperatur gerührt, während 25,0 g (0,121 Mol) 3-Amino-5-benzylthiö-s-triazol (Verbindung 1) sowie 28,1 g (0,130 Mol) Diäthyläthoxymethylenmalonat zugesetzt werden. Die erhaltene· Lösung wird unter Rückfluß während einer Zeitspanne von 12 Stunden erhitzt und dann zur Trockene einge-

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aufgelost,

dampft. Der Rückstand wird in 200 ml kaltem Wasser worauf der pH-Wert auf 1 durch die Zugabe- einer verdünnten Chlorwasserstoff säure eingestellt wird. Der Niederschlag wird durch Filtration abgetrennt, mit Wasser gewaschen und dann aus wässrigem Äthanol umkristallisiert. Dabei erhält man dann das analytisch reine Produkt, das in der Tabelle ITI zusammengefaßt ist.

Beispiel 9

Herstellung von 2-Benzylthio-6-carbäthΌxy-7-chlor-s-triazolo- ^T,5a7~pyrimidin (Verbindung 36). ■

Eine Lösung von 20,1 g (0,06 Mol) 2-Benzylthio-6-carbäthoxy-7-hydroxy-s-triazolo^T,5a/-pyrimidin (Verbindung 35) in 250 ml Phosphoroxychlorid wird während einer Zeitspanne von 2 Stunden unter Rückfluß gehalten. Nach Beendigung dieser Zeitspanne wird der Überschuß an Phosphoroxychlorid unter vermindertem Druck entfernt, worauf der zurückbleibende Sirup zu 250 g eines zerstoßenen Eises zugesetzt wird. Die erhaltene Lösung wird mit 3 χ 200 ml Äther extrahiert, worauf die vereinigten Ätherextrakte mit 100 ml einer gesättigten Natriumbicarbonatlösung gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet werden. Eine Verdampfung des Ätherextraktes liefert das rohe Chlorderivat, das durch Umkristallisation aus n-IIeptan gereinigt wird. Man erhält das analytisch reine Produkt, das in der Tabelle III angegeben ist.

Beispiel 10 · - . .

Herstellung von 2-Benzylthio-6-carbäthoxy-7-sübst.-amino-striazolo/1,5a/-pyrimidinen (Verbindungen 37 bis 40).

Eine Lösung von 1,0g (2,88.Millimol) 2-Benzylthio-6-carbäthoxy-7-chlor-s-triazolo/T,5a7-pyrimidin (Verbindung 36) und 5,76 Millimol eines substituierten Amins in 30 ml Äthanol wird auf 55°C

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während einer Zeitspanne von 10; Minuten erwärmt und dann bei Zimmertemperatur während einer Zeitspanne von 1 Stunde gerührt. Diese Lösung wird dann mit 70 ml Wasser verdünnt und abgekühlt. Das ausgefällte Produkt wird durch Filtration abgetrennt und aus einem wässrigen Äthanol umkristallisiert. Dabei erhält man die analytisch reinen Produkte, die in der Tabelle ITI zusammengefaßt sind., ,

Beispiel 11 '

Herstellung von l-Benzylthio-ß-carbäthoxy-T-merkapto-s-triazolo-/T_r5a7-pyrimidin (Verbindung 41).

Eine Suspension von 1,O g (2,88 Millimol) ^-Benzylthio-e-carbäthoxy-7-chlor-s-triazolo/i,5a7-pyrimidin (Verbindung 36) und 1 ,.1Ό g (Formelgewicht 0,0t) Natriumhydrosulfid-trihydrat in 20 ml Äthanol wird während einer Zeitspanne von 10 Minuten auf 55 C erhitzt und gerührt. Nach Beendigung dieser Zeitspanne wird die Lösung bei Zimmertemperatur während einer Zeitspanne von 2 Stunden gerührt und dann mit 70 ml Wasser verdünnt. Der pH der erhaltenen Lösung wird auf 5 durch die Zugabe von Eisessig eingestellt. Das ausgefällte Produkt wird durch Filtration abgetrennt, mit Waser gewaschen und dann aus wässrigem Alkanol umkristallisiert, dabei erhält man das analytisch reine Produkt,

das in der Tabelle III aufgeführt ist.

Beispiel 12 _t .

Die erfindungsgemäßen Verbindungen wurden auf ihre Fähigkeit getestet, die Wirkung des Enzyms Phosphodiesterase zu inhibieren. Die Ergebnisse sind in den folgenden Tabellen zusammengefaßt.

3',5'-cyclische AMP-Phosphodiesterase (PDE) wurde aus zwei verschiedenen Geweben in der folgenden Weise isoliert und gereinigt. Homogenate von Kaninchenlungen und -nieren wurden in einem Rohrzucker-Tris-Magnesiumpμffer hergestellt und mit niedriger Ge-

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schwindigkeit zur Entfernung von Keimen und Zellresten zentrifugiert. Die überstehenden Flüssigkeiten werden dann bei 105 χ g während einer Zeitspanne von 30 Minuten zentrifugiert. Die nach diesem Zentrifugieren (105 000 χ g) erhaltenen überstehenden Flüssigkeiten werden dann fraktioniert, wobei (NH^)₂SO. verwendet wird. Der bei einer 0 bis 30 %igen Sättigung erhaltene Niederschlag wird durch Zentrifugieren mit 20 000 χ g gesammelt und in Tris-Magnesiumpuffer gelöst und über Nacht gegen den gleichen Puffer dialysiert. Eine zweite' (NH.)^SO.-Fraktion wird in der Weise erhalten, daß die Konzentration der ersten überstehenden Flüssigkeit auf 50 % erhöht wird. Diese (NH.)„SO.-Fraktionen sowie die überstehende Flüssigkeit aus der 30 bis 50 Sigen Fraktion werden dann auf· ihre'PDE-Aktivität unter Anwendung der Methode von Appleman (Biochemistry 10, 311 (1971)) untersucht. Die erste Fraktion, die aus Lungen- und Nierengeweben erhalten worden ist, enthält eine PDE mit geringer Affinität für 3',5'-cyclisches AMP (hoher Km-Wert). Die zweite Fraktion zeigt eine Biphasenkurve, wenn die Lineweaver-Burk-Analysenmethode angewendet wird. Dies-deutet entweder auf das Vorliegen von zwei ge-, trennten Enzymen, wobei eines eine hohe und das andere eine geringe Affinität für die Enzyme aufweist, oder auf ein Protein mit zwei getrennten Stellen hin. Von Appleman wird in der genannten Veröffentlichung angegeben, daß Hirnextrakte zwei getrennte Enzyme (mit hohem Km- und mit niederem Km-Wert) liefern, die durch Sepharosegelchromatographie getrennt werden können.

Alle angegebenen Untersuchungen zur Durchführung der inhibierenden Wirkungen wurden unter Verwendung des Enzyms mit hoher Affinität (Fraktion II, niederer Km-Wert) durchgeführt, das aus Kaninchenlungen und -nieren erhalten· worden ist. Die I_5Q-Werte wurden in einigen Fällen in der Weise berechnet, daß der Logarithmus I gegenüber dem Prozentsatz I für die Experimente aufgetragen wird, bei deren Durchführung die Inhibitorkonzentrationen innerhalb eines breiten Bereiches bei einer konstanten 3',5'-cyclischen AMP-Konzentration von ungefähr 1,7 χ 10 m variiert wurden. Die relative inhibierende Aktivität einer je-

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den Verbindung, verglichen mit Theophyllin wird c«t<s — vjg*i - Cxu5 gedrückt. Dieser Wert wird in der Weise erhalten, üaü der i..-Wert für Theophyllin, der bei einem jeweiligen Experiment erhalten wird, durch den I₁. -Wert dividiert wird, der bei der,Untersuchung der jeweiligen Verbindung ermittelt wird. In den meisten Fällen werden die ö(-Werte aus Inhibierungsuntersuchungen berechnet, die unter Einhaltung einer einzigen Konzentration der Testverbindung durchgeführt wurden, so lange die durch diese Konzentration erzielte Inhibierung 20 bis 80 % beträgt. In diesem Falle wird der v^-Wert in der Weise berechnet, daß die Theophyllinkonzentration, weiche die gleiche Inhibierung liefert (X %) durch die Konzentration der Testsubstanz dividiert wird, welche X % Inhibierung ergibt. Die Gültigkeit dieser Methode wurde in der Weise überprüft, daß ^-Werte, die erstens durch Messungen bei einer einzigen Inhibitorkonzentration und zweitens Messungen bei vier Inhibitorkonzentrationen (I_ -Bestimmungen) erhalten worden sind, verglichen werden. Auf diese Weise verglichene iX-Werte stimmen bis auf 10 % miteinander überein,

Die Grundinkubationsmischung enthält folgende Substanzen (Mengen in Mikromol): ·H-cAMP (spezifische Aktivität ungefähr 2 180 cmp/ pMol), 0,00016; Tris pH 7,5, 40; MgCl₉, 0,5; Enzym (cAMP-Phospho-

A f

diesterase), 5-50 ,ug Protein; sowie 10 bis 10 molare Konzen-

ο tration des Inhibitors; Inkubationszeit 10 Minuten bei 3OC.

Nach Beendigung der Inkubation werden die Mischungen auf 9O C während einer Zeitspanne von 2 Minuten erhitzt, worauf 100 Mikrogramm Schlangengift Phosphodiesterase von Crotalus atrox zugesetzt werden. Die Reagenzgläser werden während einer Zeitspanne von 10 Minuten bei 30°C inkubiert. Die Mischung wird dann abgekühlt, worauf 1 ml Dowex 1-2X (200 bis 400 mesh) in Form einer Suspension, hergestellt durch Vermischen von 100 g des Harzes mit 200 g Wasser, zugesetzt wird. Die Mischung wird dann zentrifugiert. Ein Aliquot der überstehenden Flüssigkeit wird dazu verwendet, die Impulse pro Minute unter Verwendung eines Flüssigkeitsscintillationsspektrometers zu bestimmen. 0 Zeitwerte wurden unter Verwendung von Inkubationen erhalten, bei denen die cAMP-Phosphodiesterase aus der ersten Inkubation-weggelassen wird.

309881/1U 8 ORfQfNAU INSPECTED

Tabelle I

2-Hlkylthio- und 2-Arlalkylthio-5 , 7-dimethyl-s-triazolo/"1 , 5a/-pyrimidine als 3'. /5 ' -cyclische AMP-

phosphodxesteraseinhifciitoren

, ¹V ^R3 ■

Verbindung Nr.

-H₂C-

,-Cl

7	O	-CH	2-CH₂-CH₃
ö	1	-CH	(CH₃J₂
9	. -CH	3
.1	-CH	2-CH(CH₃)
1	-CH	(COOC₂H₅)

Herstel- % F,, C 'Empirische Analyse PuE PDE lungsme- Aus- Formel , . Lunge;(X Niere; 0(

thode beute ·

Beispiel '

2,

3 3 3 3

89 131-132

2,5Q

2,10

76	136-137	14 13 4	*c,n*	fN	/N, S	4 ,PP	4	/P
82	97-98	C_1nIi₁ /N/S	C₁Il	fN	,f.N	P,9P	1	,PP
60	95-96	^CiPⁱⁱ14^N4^S	■C,H,N		P/1P	1	,3P
76	154-155	C₈H₁₀N₄S	C^	0,50	P	,25**
72	119-121 Zersetzung	^Ciiⁿi6^N4^S	Cf H	P^ ilP	P
§5	109-1IP	C₁₄H₁₈N₄SP₄	C, II	P,5P	⁰

Tabelle I (Fortsetzung)

2-Älkylthio- und 2-Arlaikylthio-5j ^-dinethyl-s—Lriazclo/'I , 5a/-pyriir;idina als 3'./5'-cyclische· AM?-

phosphodiestsrciScir.hibitcren ' ,

Verbindung Nr.

thode Beisoiel

C Empirische
Formel

Analyse PDS -

Lunge ;-■<

Niere;

V-^CG0!I 93 190-193 ■ C₁₅H₁₄N₄O₂S ' C,H₇N

• 1.20 0.70

O CO OO OO

13

₁₄ -H,C-O

HjC

95 - 124-125 'C₁

.10-111

c H N
15 16 4

C,H,N

G,H,N,S

6.2-0 ' 1.00

2.00 0.70

C,H,N,S 3.50· 4.00

16

Io

/~V ο

LV

3 3

C,

99-100

75' · 145-145 CKNS

JL -J XO ^

UHS Cl unlöslich

C₁₉H₁₈N₄S C,H,N ' unlöslich

C,H,N,S CSO 0.70

NJ CO NJ

IS

-K_nC

7 W ■></.1.<i; , ' Γ Η Ν

C, K₇N

1.17 G.CO

Tabelle I (Fortsetzung)

2-Alkylthio- und 2-Arlalkylthio-5 , 7-dimethyl-s-triazolo/'1 , 5a/-pyrimidine als 3 '., 5 ' -cyclische AMP-

' · · phosphodiesteraseinhibitoren

Verbinidung Nr,

co 20

Herstel	%	F. ,C	Empirische
lung sitie-	Aus		Formel
thode	beute
Beispiel
• Nr.

Analyse PDE PDE

Lunge;<< Niere;

175-176 C₁₇H₁₅N₅S

C,H,N,S 2,00 0,70

I I

,,COOC₂H₅

3 72 130-131 C₁₅II₁₆N₄O₃S C,H,N 3,2 1,25

22

^H2^C

23

223-224 C₁₂H₁₆N₄SO C,H,N 0,60 0,00

91-92 C₁₅II₁₆N₄S C,H,N 2,50 2,50

Tabelle II

2-Benzylthio-5-methyl-7-subst.-s-triazolo₍/'i ,5a./-pyriinidine als 3 ' ,5'-cyclische AMP-

y7subst.striazolo_i/ Phosphodiesteraseinhibitoren

Verbindung Nr.

	24
ω
O	25
co
00
09 U	26
N.
■■*	27
■Τ
Ο»
	28

29

30

31

52
35

■34

/j

-Cl

.N¹K-CH₇-CH₂-CH₅
•N CC₂K₅) ₂
N(CH₃)₂

XCCiI₇-CH₉OH)₇

i* L· m

-NIi-NH₂*
-N-NCCII₅)

'--SH

Hersteliungsmethode Beispiel Kr.

4 5 6

6 6

Aus-

beute

50 252-253

^9S"⁹⁶'

65 · 250-252

83 249-250

92 140-142

174-175 )

89-90

118-120

220-223

1S1-1S3

224-225

, C Empirische Formel

Analyse pde PDE Lunge; öf Niere; 0(

0.75 ·0,75

13^Hil^N4?^C1.

^C16^Hi9^N5^S-

^C15^H17^NS^S

17

C, H, N

C,H,N,.S

C,H,N

^C1S^H21^N5^{S C}»^H'^N'^S

C₁₇II₁₉N₅OS -''C^_n.

^C13^H16^N6^SC12 C,H,N

C,H,N
C,H, N,S

4.00

2.00

. θ

1.40

0.90

4.20 2.30 SwOO 3.40

2.10 2.30

3.20

7.70 4. unlöslich

5.30 S. 1.37 0.60^C

CU

Tabelle III

2-Benzylthiq-6-Ciarbätboxy-7-sub3t,-s-triazolo/1 , 5qJ?-pyrimidine als 3 ' ,5 '-cyclische AMP Phosophodiesteraseinhibitoren

."JiT,' Λ Λ , .

3S·

'■39

40 41

QH

KH-CH₂-CH₂OH

XH-CK₂-Cf-I₂-Ca₃ ¹
-SU

	-	*o Aus beute	•	τ? °r	Smpirische Formel .	R₉ - EtOOC	PDS . PDS unge;^ Niere; C(	I —» vo
		" 63	246-247	■^C15^H14^N4°3^S	R₃-- H	0,00 0.00 ·	I
Horsfcel- ■ lungsiue- ' thcde ■.' Beispiel ¹ Nr,		73	127-129*	C₁₅IL₃ClN₄O₂	Analyse	;·;' unlöslich
8	' 70	9.2-94	C H NOS. 19 21 5·3	C, H, N	6.90 2.90
9	75	114-116	■^C22^H2A°2^S	S C,H,N	; unlöslich
10	. 65 '	168.-170	^CX7^H19^NS°3^S	. .ά,Η,Ν \·	unlöslich
10	SS	94-6	^CISH21^N5°2^S·	■ C,H,N	. 21.0 . 7.Ow
10	SO	133-136	^G1S,^H14^4°2^S2	C,H_?N	unlöslich*-;
. 10; ) ■				'. C,H,N	133
11			C, H ,N

.- 2O-

Bine Analyse der in den vorstehenden Tabellen zusammengefaßten Ergebnisse zeigen, daß einige der erfindungsgemäßen Verbindungen ein- Inhj.bierungsvermögen besitzen, das merklich besser ist als dasjenige von Theophyllin und in einigen Fällen, beispielsweise im Falle der Verbindungen 28, 30 und 33, in der Größenordnung liegt, die um das 8- bis 10-fache größer ist_% Darüber hinaus zeigen diese Ergebnisse deutlich, daß derartige Verbindungen eine selektive Phosphodiesteraseenzyminhibitorwirkung besitzen. Bezüglich der Verbindungen, die an den Tabellen I, II und III als unlöslich angegeben werden, obwohl diese Verbindungen nicht dem Inhibierungstest gemäß Beispiel 12 unterzogen worden sind, und zwar infolge der Ähnlichkeit in ihrer Struktur zu den Verbindungen, die getestet worden sind, steht zu erwarten, daß bei der Durchführung von in-vivo-Tests der Verbindungen in anderen Formen als in Form von Lösungen ohne weiteres eine Phosphodiesteraseenzyminhibitorwirkung festzustellen ist. Es ist ferner darauf hinzuweisen, daß die verschiedenen Substituenten R, die in den Beispielen in der Tabelle I angegeben sind, anstelle des ßenzylsubstituenten gemäß den Tabellen II und III eingesetzt werden können, wobei die erhaltenen Verbindungen dazu in der Lage sind, Phosphodiesteraseenzyme zu inhibieren.

Vorläufige pharmakologische Untersuchungen haben ergeben, daß 2-Benzylthio-7-hydroxy-5-methyl-s-triazolo/T,5a7-pyrimidin (Verbindung 30), 2-Benzylthio-7-/bis(ß-hydroxyäthyl)amino7~5-methyl-s-triazolo/T-,5a/-pyrimidin (Verbindung 35) , 2-Benzylthio-7-diäthylamino-5-methyl-s-triazolo/T,5a7~pyrimidin (Verbindung 27) und 2-Benzylthio-6-carbäthoxy-7-n-propylamino-s-triazolo^T,5a/-pyrimidin (Verbindung 40) die Fähigkeit besitzen, eine Koronardilatation bei einer Konzentration von 10 Mikrogramm/ml in einem isolierten Meerschweinchenherzen zu bewirken. Ferner wurde festgestellt, daß 2-Benzylthio-7-/bis(ß-hydroxyäthyl)amino/-5-methyl-s-triazolo/T,5a7-pyrimidin (Verbindung 35) eine positive inotrope Wirkung in einer Konzentration von 10 Mikrogramm/ml in einem isolierten Meerschweinchenherzen ausübt.

309 881/1UB

Weitere pharmakologische Untersuchungen haben gezeigt, daß 2-Benzylthio-7-hydroxy-5-methyl-s-triazolo/T,5a7-pyrimidin (Verbindung 30), 2-Benzylthio-7-/bis(ß-hydroxyäthyl)aming?-5-methyl-s-triazolo/T,5a/-pyrimidin (Verbindung 35) und 2-Benzylthio-7-diäthylamino-5-methyl-s-triazolo/T,5a7~pyrimidin (Verbindung 27) gleichmäßig wirkende Muskelentspannungsmittel sind, wie aus ihrem Vermögen hervorgeht, isolierte Meerschweinchenuteri bei Konzentrationen von 2-10 Mikrogramm/ml zu entspannen. . .. .

Nach der Methode von C.A.Winter et al (siehe Proc. Exper. Biol.Med., 111, 544 (1962)) zur Bestimmung der antiinflammatorischen Eigenschaften von Verbindungen wurde festgestellt, daß 2-Benzylthio-7-hydroxy-5-methyl-s-triazolo^1,5a/-pyrimidin (Verbindung 30) eine signifikante Aktivität besitzt, wenn diese Verbindung oral an Ratten in einer Dosis von 100 mg/kg Körpergewicht verabreicht wird. Bei dieser Dosis wird eine 43 %ige Inhibierung des Fußvolumens erzielt. _v

Die Verbindung 38 (2-Benzylthio-7-hydrazino-5-methyl-s-triazolo/T,5a/-pyrimidin) besitzt eine signifikante hypotensive Aktivität, wie anhand der Methode von J.R.Weeks and J.A.Jones (Pharm. Exper. Therap., 104, 646 (196O)) bestimmt wird. Bei einer oralen Dosis von 50 mg/kg in Ratten wird eine mittlere Blutdruckabnahme in Prozent bei 1, 3 und 6 Stunden von 11, 13 bzw. 24 % festgestellt. Die gleiche Verbindung besitzt eine signifikante hypotensive Aktivität bei einer oralen Dosis von 25 mg/kg in der Ratte.

0 9 8 8 1/11/· B

Claims

Patentansprüche

worin R für Alkyl, verzweigtes Alkyl, substituiertes Alkyl oder einen aromatischen oder substituierten aromatischen Kern steht, R₁ CH-., OH, Halogen, ein Amin, ein Aminsalz oder Merkapto bedeutet, R₂ H oder Carbäthoxy darstellt und R₃ H oder CH₃ ist, unter der Voraussetzung, daß, falls R₂ Carbäthoxy ist, R₃ für H steht.
2. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R ein aromatischer oder substituierter aromatischer Kern ist,der aus Benzyl, substituiertem Benzyl, einem heteroaromatischen. Kern, einer mehrkernigen aromatischen Gruppe und einer Aralkylgruppe ausgewählt wird.
3. Verbindung nach Anspruch.2, dadurch gekennzeichnet, daß R und R₃ für CH₃ stehen.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß R für

-Cl

steht.

309881/1IiS
5. Verbindung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß R für

-Ch

steht.
6. Verbindung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß R für

steht.
7. Verbindung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß R für

-CH.

,C-O-C₂H₅

steht.
8. Verbindung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß R für Benzyl steht, und R. Cl bedeutet.
9. Verbindung nach ,Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß R für Benzyl steht, und R₁ ein Amin ist, das aus Aminen der Formeln NHR¹, N(R¹J₂ ^und N-N(R¹J₂ ausgewählt wird, wobei R¹ eine C₁- bis C ,--Alky !gruppe oder eine substituierte Alkylgruppe, Piperidinogruppe oder Morpholinogruppe bedeutet.

3 0 9881711
10. Verbindung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß R für Benzyl steht, R₂ Carbäthoxy bedeutet und R Morpholineist.
11. Verbindung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß R- für QH steht, R„ Carbäthoxy bedeutet und R^ H ist.
12. Verbindung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,'daß R₁ für NH-CH₂ steht, R₂ Carbäthoxy ist und R₃ für H steht.
13. Verbindung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß R₁ NH-C₃II₇ bedeutet, R₂ Carbäthoxy ist und R₃ für H steht.
14. 2-Benzylthio-6-carbäthoxy-7-n-propylamino-s-triazolo^1,5a/-pyrimidin.
15. 2-Benzylthio-7-hydroxy-5-methyl-s-triazolo_//T, 5a7-pyrimidin.
16. 2-Benzylthio-7-/bis(ß-hydroxyäthyl)amino7-5-methyl-striazolo/1,5a/-pyrimidin.
17. 2-Benzylthio-7-diäthylamino-5-methyl-s-triazolo/T,5a/-pyrimidin.
18. Z-Benzylthio^-hydrazino-S-methyl-s-triazolo/TjSa/-pyrimidin.

309881/1148 -