DE2205169C3

DE2205169C3 - Verfahren zur Reinigung von 6-[D-α-(3-Guanyl-1-ureido)-phenylacetamido]-penicillansäure

Info

Publication number: DE2205169C3
Application number: DE2205169A
Authority: DE
Inventors: Alphonse Peter Baldwinsville N.Y. Granatek
Original assignee: Bristol Myers Co
Current assignee: Bristol Myers Co
Priority date: 1971-02-03
Filing date: 1972-02-03
Publication date: 1981-05-07
Also published as: ZA72609B; DE2205169B2; FR2124411A1; GB1382276A; FR2124411B1; CA986505A; AU3829072A; JPS5231880B1; US3711471A; AU459026B2; DE2205169A1; BE778944A

Description

Die Herstellung und die Eigenschaften von 6-[D-a- 22. August 1969, sowie in der BE 7 42 423 (Farmdoc

(3-Guanyl-l-ureido)-phenylacetamido]-penicillansäure is 39 705 R)beschrieben, und ihrer Salze sind in der DE-OS 19 59 9203 und in Diese Verbindung hat die Strukturformel

der US-Patentanmeldung Serial No. 8 52 457 vom

CH — C—NH —CH-CH

CH₃

/
C-CH₃

CH-CO₂H

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung unreiner, amorpher 6-[D-«-(3-GuanyI-l-ureido)-phenylacetamidoj-penicillansäure.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Reinigung unreiner, amorpher 6-[D-«-(3-Guanyl-l-ureido)-phenylacetamidoj-penicillansäure ist dadurch gekennzeichnet, daß man diese in 90%igem (Vol/Vol.) wäßrigem Isopropylalkohol bei einem pH im Bereich von 1,3 bis 1,9 mit Salpetersäure mischt, das so ausgefällte kristalline 6-[D-«-(3-Guanyl-1 -ureido)-phenylacetamido]-penicillansäurenitratmonohydrat gewinnt und dieses Nitrat dann in 50%igem (Vol/Vol.) wäßrigem Isopropylalkohol aufschlämmt und dann den pH dieser Aufschlämmung mit einer Base in den Bereich von 4,5 bis 6,0 einstellt, wobei sich eine Lösung ergibt, aus der das gereinigte kristalline 6-[D-«-(3-Guanyl-l-ureido)-phenylacetamido]-penicillansäurehemihydrat bald spontan ausfällt und dann gesammelt wird.

Das in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Ausgangsmaterial wird wie in obigen Anmeldungen beschrieben wie folgt hergestellt:

N-Guanyl-N'-nitroharnstoff (I)

Zu einer gerührten, eisgekühlten Mischung von 100 ml konz. Schwefelsäure und 40 ml konz. Salpetersäure werden vorsichtig in kleinen Anteilen während 40 Minuten 25 g (0,3 Mol) Cyanoguanidin gegeben. Nach beendeter Zugabe wird die Reaktionsmischung etwa 1,5 Stunden unter gelegentlichem Aufwirbeln bei etwa 0° gehalten und wird dann in 1000 g Eis gegossen. Der Niederschlag wird durch Filtrieren entfernt und mit Wasser gewaschen. Ohne Trocknen wird der Niederschlag in 200 ml Wasser suspendiert und durch Zugabe von 10%iger wäßriger NaOH gelöst. Die sich ergebende Lösung wird filtriert, dann wird das Produkt ausgefällt, indem man 1 Stunde lang CO₂-GaS durch die Lösung perlt. Der Feststoff wird durch Filtrieren entfernt, mit H₂O gewaschen und getrocknet, wobei man 38,6 g(88°/o) erhält. F = > 250°.

4-Guanylsemicarbazid-dihydrochloriü(II)

Eine Suspension von 5,88 g (0,04 Mol) N-Guanyl-N'-nitroharnstoff in 31,8 ml konz. HCl wird durch Zugeben von etwa 15 g Eis und Lagern in einem Eisbad gekühlt. Die Suspension wird während 45 Minuten zu einer heftig gerührten eisgekühlten Mischung von 12,96 g (0,18 Mol) Zinkstaub und etwa 300 g Eis gegeben. Nach beendeter Zugabe wird die Mischung 10 Minuten ohne Kühlung von außen gelagert, dann wird abfiltriert Das Filtrat wird kräftig mit 5 ml (0,05 Mol) Benzaldehyd geschüttelt und der farblose Niederschlag, der sich abtrennt wird rasch durch Filtrieren entfernt und unter verringertem Druck getrocknet, wobei man 3,0 g des

so Benzalderivats von II erhält F = 237°.

Ohne Reinigung werden 3,5 g des Benzalderivats in 5 ml Äthanol suspendiert, dann werden 50 ml konz. HCl zugegeben und die Mischung wird 1 Stunde bei 40° gelagert Das unlösliche kristalline Produkt wird durch

Filtrieren gesammelt und das Wasser-Äthanol umkristallisiert, wobei sich 1,0 g Produkt II ergeben. F = 19Γ.

6-[D-(-)-«-(3-Guanyl-1 -ureidoj-phenylacetamidoj-penicillansäure

Zu einer gerührten, Eis-Salz-gekühlten Lösung von 1,0 g (5,25 mMol) 4-Guanylsemicarbaziddihydrochlorid in 6 ml H₂O wird eine Lösung von 0,366 g (5,25 mMol) NaMO₂ in 1,4 ml H₂O gegeben. Man rührt und kühlt weitere 10 Minuten. Diese Lösung des in situ hergestellten Guanylcarbamoylierungsmittels wird dann zu einer gerührten, eisgekühlten Lösung von 2,12 g (5,25 mMol) Ampicillintrihydrat in 7 ml H₂O, das genügend Triäthylamin enthält, um den pH auf 7,5 zu

bringen, gegeben. Nachdem die Lösungen vereinigt sind wird der pH mit Triäthylamin auf pH 7,2 eingestellt und man kühlt und rührt weitere 45 Minuten. Der Niederschlag, der ausfällt, wird durch Filtrieren gesammelt, mit H₂O gewaschen und getrocknet, wobei sich 1,2 g feste 6-[D-a-(3-Guanyl-l-ureido)-phenylacetamido]-penicillansäure ergeben. Diese wird noch zweimal durch Lösen in 10 ml H₂O mit Triäthylamin bei einem pH 9,5 und anschließendes Ansäuern auf pH 5 (Ansäuern auf pH 6,5 ist ausreichend) mit 42%iger H₃PO₄ ausgefällt, wobei man 0,425 g 6-[D-«-(3-Guanyll-ureidoj-phenylacetamidoj-penicillansäure mit einem F = 198 bis 200⁰C, Zers. erhält
AjIaIySeCi₈H₂₂N₆O₅S · H₂O

Berechnet: C 45,95, H 5,57, N 17,86<>/o;
gefunden: C 46,65, H 5,67, N 17,51%.

Dieses Material ist amorph und unrein. Hohe Reinheit und Kristallinität sind höchst wünschenswerte, wenn nicht wesentliche Attribute kommerzieller Penicilline, und es ist daher das Ziel der Erfindung, ein Verfahren zur Reinigung von (3-Guanyl-l-ureido)-phenylacetamido]-penicillansäure zu schaffen.

Erfindungsgemäß wird rohe amorphe 6-[D-«-(3-guanyl-l-ureido)-phenylacetamido]-penicillansäure in ihr gereinigtes kristallines Nitratsalz mit einer Bio-Ausbeute von etwa 75% umgewandelt Das Nitrat wird in das reine (oder nahezu reine) kristalline Zwitterion mit einer Stufenausbeute von etwa 86% umgewandelt. Man erhält eine Änderung der Bio-Aktivität von 900 auf 1250 Einheiten/mg und der chemischen Aktivität von 600 auf 835 Einheiten/mg.

Das erfindungsgemäß erhaltene kristalline gereinigte e-fD-Ä-p-Guanyl-l-ureidoJ-phenylacetamidoJ-penicillansäurehemihydrat läßt sich in einer Aufschlämmung in Aceton in an sich bekannter Weise in kristallines

KaIium-6-[D-«-(3-guanyl-1 -ureido)-phenylacetamido]-penicillanatdihydrat umwandeln. Dieses Salz ist in Wasser sehr löslich. Verdünnte Wasserlösungen (10 mg/ml) haben einen pH 8,5 und sind innerhalb 10% bei Raumtemperatur mindestens 12 Stunden stabil. Konzentrierte Wasserlösungen (250 mg/ml) haben einen pH von 9,8 bis 9,9 und sind innerhalb 10% mindestens 1 Stunde bei Raumtemperatur stabil. Dieses Salz ist auch bei 500 mg/ml leicht in Wasser (pH 9,9) löslich. So wird ein kristallines und hochreines Kalium-6-[D-«-(3-GuanyI-1 -ureido)-phenylacetamido]-penicillanatdihydrat in guter Ausbeute durch ein Wasser-KOH-Aceton oder Wasser-Kalium-2-äthyl-hexanoat-Triäthylamin-Aceton-Verfahren aus der kristallinen »freien Säure« 6-[D-«-(3-Guanyl-l-ureido)-phenylacetamido]-penicillansäurehemihydrat hergestellt.

Die biologische Stabilität dieses Kaliumsalzes in Wasser ist ungefähr gleich oder äquivalent der entsprechender wäßriger Lösungen von Kaliumampicillin.

Weiterhin läßt sich erfindungsgemäß erhaltenes kristallines gereinigtes 6-[D-a-(3-Guanyl-l-ureido)-phenylacetamido]-penici!lansäurehemihydrat (Zwitterion) in an sich bekannter Weise in einer Aufschlämmung in Aceton umgewandein in kristallines Natrium-6-[D-Ä-(3-Guanyl-1 -ureidoj-phenylacetamidoj-penicillanatmonohydrat Dieses Salz ist sehr wasserlöslich. Verdünnte wäßrige Lösungen (10 mg/ml) zeigen einen pH 8,3 und sind innerhalb 10% bei Raumtemperatur mindestens 24 Stunden stabiL Konzentrierte wäßrige Lösungen (250 mg/ml) haben einen pH 9,8 bis 9,9 und sind

ι s innerhalb 10% mindestens 2 Stunden bei Raumtemperatur stabiL Dieses Salz ist auch bei 500 mg/ml (pH 9,9) leicht löslich. So wird ein kristallines und hoch gereinigtes Natrium-6-[D-<x-(3-Guanyl-1 -ureido)-phenylacetamido]-pemcillanatmonohydrat mit guter Ausbeute durch ein Aceton-Wasser-Natrium-äthyl-hexanoat-Triäthylamin-Verfahren aus kristallinem 6-[D-oc-(3-Guanyl-l-ureidoJ-phenylacetamidoJ-peniciHansäurehemihydrat hergestellt Die biologische Stabilität dieses

Natrium-6-[D-«-(3-Guanyl-1 -ureido)-phenylacetamido]-penicillanatmonohydrats in Wasser ist etwa äquivalent der entsprechender Natriumampicillinlösungen.

Beispiel

a) Kristallisation von 6-[D-<x-(3-Guanyll-ureido)-phenylacetamido]-penicillansäurenitrat

10 g amorphe, unreine 6-[D-<%-(3-Guanyl-l-ureido)-phenylacetamido]-penicillansäure mit einer Teilchengröße von 0,148 mm werden in 70 bis 100 ml 90%igem (VoL/Vol.) Isopropanol-Wasser aufgeschlämmt. 1,3 ml konz. Salpetersäure (oder das Volumen HNO3, das benötigt wird, um einen pH 1,3 bis 1,9 zu ergeben) werden unter sehr raschem Rühren zugegeben. Man erhält eine Lösung (pH 1,3 bis 1,9) oder nahezu eine Lösung. Die Kristallisation beginnt innerhalb 3 bis 5 Minuten nach dem Impfen. Die Mischung wird bei Umgebungstemperatur (21 bis 24° C) 1 bis 1,5 Stunden aufgeschlämmt Die kleinen Nadelkristalle werden durch Filtrieren gesammelt, mit 20 ml 90%igem Isopropanol und dann mit 30 ml Isopropanol gewaschen und dann bei 50⁰C über P₂Os 24 Stunden im Vakuum getrocknet. Die Ausbeute beträgt 6 g 6-[D-<x-(3-Guanyl-1 -ureidoj-phenylacetamidoj-penicillansäurenitratmonohydrat, das sich dadurch als kristallin erweist, daß es unter dem polarisierenden Mikroskop Extinktion zeigt Ein Vergleich dieses Produkts mit dem Ausgangsmaterial ergibt die folgenden Ergebnisse:

Ergebnisse

	Ausgangsmaterial	Produkt
	(roh, amorph)	(kristallines Nitratmonohydrat)
Geschätzter Ampicillingehalt	5-10%	<0,l %
Bio-Test*)	870-920 E/mg	1000-1050 E/mg
Chemischer Test in Ampicillineinheiten	590-630 E/mg	700-740 E/mg
Bio-Ausbeute	-	60-76 %
[a] "5 Dimethylacetamid	+ 117, +144	+ 180
% H₂O, KF (Theorie für Monohydrat = 3,5 %)	5,18 %	2,7 %
% NO₃ (Theorie = 12,5 %)	-	Trockenbasis = 12,2%

Fortsetzung

Ausgangsmaterial
(roh, amorph)

Produkt

(kristallines Nitralmonohydrat)

%N (Theorie = 19,7%)
% S (Theorie = 6,42%)
F (Kapillare)

Trockenbasis = 19,3 % Trockenbasis = 6,0 % 205-209C (Zers.)

*) Wobei als Standard eine gewisse Charge rohe 6-[D-a-(3-Guanyl-l-ureido)-phenylacetamido]-penicillansäure verwendet wird, welche in diesem besonderen Test ungefähr 1/4 der Aktivität von Ampicillin zeigt (E/mg = Einheiten/mg. % HiO KP = % H₂O nach Karl Fischer).

b) Kristallisation von 6-[D-a-(3-Guanyll-ureidoj-phenylacetamidoj-penicillansäurehemihydrat (Zwitterion oder »freie Säure«)

15 g kristallines 6-[D-«-(3-Guanyl-l-ureido)-phenylacetamido]-penicillansäurenitratmonohydrat mit einer Teilchengröße von 0,148 mm werden 5 Minuten in 100 ml bis 150 ml 5O°/oigem (VoL/Vol.) Isopropanol-Wasser aufgeschlämmt 20 ml 4O°/oiges Natriumhydroxyd (kann durch Triäthylamin ersetzt werden) werden unter sehr kräftigem Rühren bis zu einem pH von 4,5 bis 6,0 zugegeben. Man erhält eine Lösung. (Gegebenenfalls kann 10 Minuten lang schnell unter Wirkung nur der Schwerkraft durch Papier filtriert werden.) Die Mischung wird beimpft und innerhalb etwa 15 bis 20 Minuten beginnt die Kristallisation. Die Mischung wird 2 Stunden bei Raumtemperatur (21 bis 24° C) gerührt. Die kleinen stabähnlichen Kristalle werden durch Abfiltrieren gesammelt, mit 25 ml 50%igem Isopropanol und dann mit 30 ml Isopropanol gewaschen und über P₂O₅ bei 5O⁰C 24 Stunden im Vakuum getrocknet. Die Ausbeute beträgt 11,5g 6-[D-«-(3-GuanyI-l-ureido)-phenylacetamido]-penicillansäurehemihydrat, das sich dadurch als kristallin erweist, daß es unter dem polarisierenden Mikroskop Extinktion zeigt. Bei einer Analyse dieses Produkts_; erhält man folgende Ergebnisse:

Geschätzter Ampicillin-Gehalt = <0,l% Bio-Test*) = 1150-1210 Einheiten/mg Chemischer Test in Ampicillineinheiten

= 800-835 E/mg
Bio-Ausbeute =

M "

% H₂O

Dimethylacetamid = + 171,6

KF [Theorie für Hemihydrat (· V₂ H₂O)

= 2,04%] = 2,3%
% N (Theorie, trocken = 19,3%)

= 19,3% (Trockenbasis) % S (Theorie, trocken 7,36%)

= 7,6% (Trockenbasis) F = 208 bis 214⁰C (Zers.)

_3ä NMR ergibt keine Anwesenheit von Isopropanol.

*) wie oben

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Reinigung von unreiner, amorpher e^D-a-ß-Guanyl-l-ureidoJ-phenylacetamidoj-penicillansäure, dadurch gekennzeichnet, daß man diese mit Salpetersäure in 90%igem (VoITVoL) wäßrigem Isopropylalkohol bei einem pH im Bereich von 13 bis 1,9 mischt, das so ausgefällte kristalline 6-[D-a-(3-Guanyl-1 -ureido)-phenylacetamido]-penicillansäurenitratmonohydrat gewinnt

10 und dieses Nitrat dann in 50%igem (VoL/Vol.) wäßrigem Isopropylalkohol aufschlämmt und dann den pH dieser Aufschlämmung mit einer Base in den Bereich von 4,5 bis 6,0 einstellt, wobei sich eine Lösung ergibt, aus der das gereinigte, kristalline 6-[D-«-(3-Guanyl-1 -ureido)-phenylaeetamido]-penicillansäurehemihydrat bald spontan ausfällt und dann gesammelt wird.