DE2150267A1

DE2150267A1 - Verbesserungen in der herstellung von peptiden

Info

Publication number: DE2150267A1
Application number: DE19712150267
Authority: DE
Inventors: Teruaki Mukaiyama; Manabu Suzuki; Masaaki Ueki
Original assignee: Sankyo Co Ltd
Current assignee: Sankyo Co Ltd
Priority date: 1971-06-29
Filing date: 1971-10-04
Publication date: 1973-01-11
Also published as: DE2150267B2; FR2144177A5; JPS5133884B1; GB1343089A; DE2150267C3; NL7113686A; CH562781A5; US3786038A

Description

Patentanwalt

1 Beriin 10, K&iserdamm 28

M-. Oktober 1971 P.5213

Sankyo Company, Limited in Tokyo (Japan).

Verbesserungen in der Herstellung von Peptiden.

Die Erfindung "bezieht sich auf Verbesserungen in der Herstellung von Peptiden.

Sie bezieht sich insbesondere auf ein verbessertes und neues Verfahren zur Herstellung von Peptiden, welches umfaßt die Reaktion einer Carboxylkomponente mit einer Aminokomponente in Gegenwart eines Triarylphosphits und eines Disulfide einer mercaptoheterocyclischen Verbindung, enthaltend eine Stickstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung, mit der die Disulfidbindung konjugiert.

Der Ausdruck "Carboxylkomponente" in dem hier gemeinten Sinne bedeutet eine Aminosäure oder Peptid, worin andere aktive funktionelie Gruppen, die zur Bewirkung der vorliegenden Reaktion fähig sind, als die Carboxylgruppe, welche für die vorliegende Reaktion erforderlich ist, mit Schutzgruppen, welche allgemein in einer Peptidsynthese verwendet werden, geschützt sind. Der Ausdruck "Aminokomponente" in dem hier gemeinten Sinne bedeutet eine Aminosäure oder Peptid, worin andere aktive funktioneile

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Gruppen, welche fähig sind, die vorliegende Reaktion zu bewirken, als die Aminogruppe, welche für die. vorliegende Reaktion benötigt wird, mit Schutzgruppen, welche . allgemein in einer Peptidsynthese verwendet werden, geschützt sind.

Es sind bereits zahlreiche Versuche unternommen worden, um neue Verfahren für die Herstellung von Carbonsäureamiden, besonders solche für die Herstellung von Carbonsäureamiden, wie Peptide, ohne irgend eine Racemisierung als eine Seitenreaktion, aufzuzeigen. Als ein Ergebnis eigener früherer Studien wurde gefunden, daß ein k Carbonsäureamid hergestellt werden kann durch Reaktion einer Carbonsäure mit einem organischen Amin oder einem SuIfensäureamid davon, in Gegenwart eines tertiären Phosphine und eines Disulfids einer mercaptoheterocyclischen Verbindung, enthaltend eine Stickstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung, mit der die Disulfidbindung konjugiert,

was in der JWiH$/fl4ty· Patentanmeldung No.

r/i^.yyfwvitf.... beschrieben und beansprucht ist.

Dieses ältere Verfahren hat aber ein zu verbesserndes Problem insofern, als das tertiäre Phosphin, welches verhältnismäßig teuer ist, als ein Reagenz verwendet werden sollte.

Als ein Ergebnis weiterer Studien zum Auffinden eines billigen Reagenz, welches für die Herstellung der oben genannten Carbonsäureamide, wie Peptide, geeignet ist, wurde nun gefunden, daß das obige Problem vorteilhaft gelöst werden kann durch Verwendung eines Triarylphosphits anstelle des tertiären Phosphins, und durch Reaktion der Carboxylkomponente mit der Aminokomponente in Gegenwart des neu entwickelten Reagenz, nämlich des Triarylphosphits und des Disulfids.

Es ist daher ein hauptsächliches Ziel der Erfindung, ein verbessertes und wirtschaftlich vorteilhaftes Verfahren für die Herstellung eines Peptids durch die Ver-

geändert gemäö Eingabe - 3 -

^ ^fe

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wendung des billigen Triarylphosphitreagenz aufzuzeigen.

Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich für den Fachmann aus der folgenden spezielleren Be sehre ibung.

•Bei der Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann die Reaktion vorteilhaft bewirkt werden durch inniges Zusammenbringen der oben erwähnten vier Reaktionspartner, nämlich der Aminokomponente, der Carboxylkomponente, des Disulfide und des Phosphits in einem geeigneten Lösungsmittel. Die Reihenfolge des Hinzufügens der vier Reaktionspartner ist kein kritisches Merkmal, jedoch ist es zweckmäßig, die vier Reaktionspartner gleichzeitig in das Reaktionssystem zu inkorporieren, oder außer dem Phosphit die übrigen drei Reaktionspartner zu lösen und danach das Phosphit zu der erhaltenen Lösung hinzuzufügen.

Die Carboxyl- und Aminokomponenten, welche in dem erfindungsgemäßen Verfahren als Ausgangsstoffe verwendet werden können, können irgend welche derjenigen Aminosäuren und Peptide sein, welche allgemein in einer Peptidsynthese verwendet werden £ beispielsweise wird verwiesen auf "Chemistry of Proteins", Vol. 1, (1969), Ed. von S. Akabori, T. Kaneko & K. Narita, Kyoritsu Shuppan Co. Ltd., Japan^ . Wie hierin erläutert wird, sind die Amino- und Carboxy!komponenten, welche in dieser Erfindung zu verwenden sind, solche spezifisch geschützten Aminosäuren oder Peptide.

Repräsentativ für Schutzmittel für andere aktive funktioneile Gruppen, wie schon erwähnt, sind Schutzmittel für die Aminogruppe mit schützenden Gruppen, wie eine substituierte oder unsubstituierte Benzyloxycarbonylgruppe, eine tert.Alkoxycarbonylgruppe, 3?ormylgruppe, Trifluoracetylgruppe, eine Arylsulfonylgruppe, eine Triarylmethylgruppe, eine substituierte Thiocarbonylgruppe, o_-Nitrophenoxyacetylgruppe , eine Trialkylsilylgruppe , eine Arylidengruppe, Acetoacetylgruppe und dergleichen;

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Schutzmittel für die Carboxylgruppe mit Schutzgruppen, wie eine Alkylestergruppe, eine substituierte oder unsubstituierte Benzy!estergruppe, Phthalimidomethy1-estergruppe, Benzhydry!estergruppe, eine substituierte Hydrazinogruppe.und dergleichen; Schutzmittel für die Guanidylgruppe mit Schutzgruppen, wie Benzyloxycarbony1-gruppe, Mtrogruppe und dergleichen; und Schutzmittel für das Stickstoffatom im Imidazolteil und die· SuIfhydrylgruppe mit Schutzgruppen, wie Benzyloxycarbonylgruppe, Benzylgruppe und dergleichen, jedoch können auch andere Schutzgruppen, soweit sie für die Peptidsynthese verwendbar sind, in dem erfindungsgemäßen Verfahren vorteilhaft angewendet werden.

Die Triarylphosphite, welche in dem erfindungsgemäßen Verfahren angewendet werden können, sind solche, worin die Arylgruppe eine Phenyl- oder Naphthylgruppe ist, die mit einem Halogenatom, wie Chlor, Brom, Fluor oder Jod, substituiert sein können, eine Alkylgruppe, vorteilhaft mit 1 bis 4- Kohlenstoffatomen, wie Methyl, Äthyl, Propyl und Butyl, und eine Alkoxygruppe, vorteilhaft mit 1 bis 4-Kohlenstoffatomen, wie Methoxy, Äthoxy, Propoxy und Butoxy.

Im Hinblick auf die wirtschaftliche Erhältlichkeit schließen bevorzugte Beispiele der Triarylphosphite ein symmetrische Triphenylphosphite, worin die Phenylgruppe substituiert sein kann mit irgend einem der oben angegebenen Substituenten, wofür Triphenylphosphit, Tris-(chlorphenyl)-phosphit, Tris-(methoxyphenyl)-phosphit, Tritolylphosphit und dergleichen repräsentativ sind.

Das Disulfid, welches in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden kann, ist ein Disulfid einer mercaptoheterocyclischen Verbindung, enthaltend eine Stickstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung, mit der die Disulfidbindung konjugiert, und sie kann symmetrisch oder asymmetrisch sein. Repräsentative Beispiele dieser Disulfide schließen ein Disulfide einer 5- oder 6-gliedrigen

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mercaptoheterocyclischen Verbindung mit einem oder mehr Stickstoffatomen als ein Heteroatom und zweckmäßig mit einem Substituenten, wie Halogenatom, nämlich Brom, Chlor, Fluor und Jod, einer niederen Alkoxygruppe, wie Methoxyf Äthoxy, Propoxy und Butoxy und einer niederen Alkylgruppe, wie Methyl, Äthyl, Propyl und Butyl, und kondensierten Ringderivaten davon, beispielsweise 2,2'-Dipyridyldisulfid, 2,2·-Dipyrimidinyldisulfid, 4,4-' -Dipyridyldisulfid, 2,2'-Dichinolyldisulfid, 2,2'-Dipyrazinyldisulfid, 2,2·- Dichinoxalinyldisulfid, 4-,4'-Dichinazolinyldisulfid, 6,6'-Diacridinyldisulfid, 2,2'-Diimidazolyldisulfid, 2,2·-Dibenzimidazolyldisulfid, 2,2'-Dibenzothiazolyldisulfid, 2,2'-Dipurinyldisulfid und 2,2'-Bis-(1-azaazulenyl)-disulfid. Wegen ihrer wirtschaftlichen Beschaffungsmöglichkeit sind substituierte oder unsubstituierte Dipyridyldisulfide bevorzugt.

In dem erfindungsgemäßen Verfahren kann befriedigend irgend ein Lösungsmittel verwendet werden, welches die vorliegende Reaktion nicht nachteilig beeinflußt. Beispiele solcher Lösungsmittel, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, bilden in einem weiten Bereiche inerte organische Lösungsmittel, beispielsweise Ä'ther, wie Dioxan und Tetrahydrofuran; halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie Chloroform und Methylenchlorid; Ester von Carbonsäuren, wie Äthylacetat und Butylacetat; Amide, wie Dimethylformamid und Dimethylacetamid; und dergleichen. Unter dem Gesichtspunkt der Art des verwende-„«xx «uub-uö»^.,.^-,.., ~«-r „v^-l..—~~_β»,ν des Eosungsmittels und anderer Faktoren ist es aber erwünscht, irgend eines der oben angegebenen Amide als Lösungsmittel in der vorliegenden Reaktion zu verwenden.

Die Reaktion des erfindungsgemäßen Verfahrens kann auch in Gegenwart einer geringen Menge Wasser günstig bewirkt werden.

Die Reaktionstemperatur in dem erfindungsgemäßen Verfahren ist kein kritisches Merkmal, jedoch kann die

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Reaktion üblicherweise und bevorzugt bei Raumtemperatur oder darunter ausgeführt werden. Eine extrem hohe !Temperatur ist jedoch nicht vorteilhaft wegen der Möglichkeit des Auftretens von Nebenreaktionen.

Die Reaktionsdauer ist ebenfalls kein kritisches Merkmal, und sie kann variieren hauptsächlich in Abhängigkeit von den Ausgangsstoffen und den verwendeten Reagenzien sowie der Art des verwendeten Lösungsmittels und der angewandten Reaktionstemperatur; im allgemeinen ist die Reaktion innerhalb von etwa 2 bis etwa 16 Stunden bewirkt.

Nach Beendigung der Reaktion kann das gewünschte Produkt aus dem Reaktionsgemisch durch eine der üblichen Methoden gewonnen werden. Beispielsweise kann nach Beendigung der Reaktion ein geeignetes Lösungsmittel, in welchem das gewünschte Produkt nicht löslich ist, entweder zu dem Reaktionsgemisch oder zu dem Rückstand, welcher nach Entfernen des Lösungsmittels von dem Reaktionsgemisch erhalten wird, hinzugefügt werden, wodurch sich das gewünschte Produkt als kristalline Substanz in situ abscheidet, und dann können die so abgeschiedenen Substanzen durch Filtration gewonnen werden. Das so erhaltene gewünschte Produkt kann, falls gewünscht, weiter durch eine der üblichen Methoden, wie Umkristallisation und Säulenchromatographie, gereinigt werden, jedoch liegt das so gewonnene Produkt oft schon in der reinen Form vor.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie einzuschränken.

Beispiel 1 Benzoyl-L-leucylglycinäthy!ester

(1) In 5 ml Dimethylformamid wurden gelöst 467 mg Benzoyl-L-leucin, 206 mg Glycinäthylester und 485 mg 2,2 '-Dipyridyl-

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disulfid, und zu der erhaltenen Lösung wurden 910 mg Tris-(p_-chlorphenyl)-phosphit hinzugefügt. Das erhaltene Gemisch wurde 15 Stunden bei 30 ⁰C gerührt. Danach wurde das Lösungsmittel von dem Reaktionsgemisch abdestilliert und der Rückstand der Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von Silikagel unterworfen, wobei man 572 mg des gewünschten Produktes erhielt, das bei 154· 0 schmilzt.

,O

-32,5" (G - 3,1; Äthanol)

(2) Das gleiche Verfahren wie oben unter (1) wurde wiederholt mit der Ausnahme, daß 683 mg Triphenylphosph.it anstelle von Tris-(p_-chlorphenyl)-phosphit verwendet wurden, wobei man das gewünschte Produkt erhielt.

(3) Das gleiche Verfahren wie oben unter (1) wurde wiederholt mit der Ausnahme, daß 874· mg Tris-(p_-methoxyphenyl)-phosphit anstelle von Tris-(p_-chlorphenyl)-phosphit verwendet wurden, und die Reaktion wurde 3 Stunden bei 15 ⁰G ausgeführt, wobei man das gewünschte Produkt erhielt.

(4) Das gleiche Verfahren wie oben unter (1) wurde wiederholt mit der Ausnahme, daß 874- mg Tris-(p_-methoxyphenyl)-phosphit und 683 mg 2,2'-Bis-(5-nitropyridyl)-disulfid anstelle von Tris-(p_-chlorphenyl)-phosphit und 2,2'-Dipyridyldisulfid verwendet wurden, und die Reaktion wurde 3 Stunden bei 30 ⁰C ausgeführt, wobei man das gewünschte Produkt erhielt.

(5) Das gleiche Verfahren wie oben unter (1) wurde wiederholt mit der Ausnahme, daß 547 mg 2,2'-Bis-(5-methylpyridyl)-disulfid anstelle von 2,2'-Dipyridyldisulfid verwendet wurden, und die Reaktion wurde während 3 Stunden bei 30 ⁰C durchgeführt, wobei man das gewünschte Produkt erhielt.

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Beispiel 2

Benzyloxyearbonyl-L-asparaginyl-S-benzyl-L-cysteinmethy!ester

In 5 ml Dimethylformamid wurden gelöst 533 mg Benzyloxycarbonyl-L-asparagin, 4-51 mg S-Benzyl-L-Cysteinmethylester und 485 mg 2,2'-Dipyridyldisulfid, und zu der erhaltenen Lösung wurden 910 mg Tris-(p_-chlorphenyl)-phosphit hinzugefügt. Das Gemisch wurde dann 2 Stunden bei 15 ⁰C gerührt. Danach wurden 50 ml Äther zu dem Reaktionsgemisch gegeben, um kristalline Substanzen auszuscheiden, die dann durch Filtration gewonnen wurden, wobei man 610 mg des gewünschten Produktes erhielt, welches bei 195 bis 196 ⁰C schmilzt.

= -31,7° (C - 2,4·; Pyridin).

Beispiel 3 Benzyloxycarbonyl-L-asparaginylglycinäthylester

In 5 ml Dimethylformamid wurden gelöst 533 mg Benzyloxycarbonyl-L-asparagin, 206 mg Glycinäthylester und 4-85 mg 2,2'-Dipyridyldisulfid, und zu der erhaltenen Lösung wurden 910 mg Tris-(p_-chlorphenyl)-phosphit hinzugefügt. Das Gemisch wurde 2 Stunden bei 40 ⁰G gerührt. Danach wurden 50 ml Äther zu dem Reaktionsgemisch hinzugefügt, um kristalline Substanzen auszuscheiden, welche dann durch Filtration gewonnen wurden, wobei man 680 mg des gewünschten Produktes erhielt, das bei 184 bis 185 ⁰C schmilzt.

[oc]_D « -5,5° (C « 1; Dimethylformamid).

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■freispiel 4

Benzyloaycarbonyl-Ii-glutaminyl-S-benzyl-L-cysteinmethy!ester

In 5 ml Dimethylformamid wurden gelöst 561 mg Benzyloxycarbonyl-L-glutamin, 451 mg S-Benzyl-Ir-cysteinmethylester und 485 mg 2,2'-Dipyridyldisulfid, und zu der erhaltenen Lösung wurden hinzugefügt 910 mg Q?ris-(p_-chlorphenyl)-phosphit. Das Gemisch wurde dann 2 Stunden "bei 15 ⁰O gerührt. Danach wurden 50 ml Äther zu dem erhaltenen Gemisch hinzugefügt, um kristalline Substanzen auszuscheiden, die dann durch Filtration gewonnen wurden, wobei man 562 mg des gewünschten Produktes erhielt, das bei 162 bis 163 ⁰C schmilzt.

= -23,5° (0-1; Methanol).

Beispiel 5 Benzyloxycarbonyl-L-valylglycinäthylester

In 5 ml Dimethylformamid wurden gelöst 503 Benzyloxycarbonyl-L-valin, 206 mg Glycinäthylester und 485 mg 2,2'-Dipyridyldisulfid, und zu der erhaltenen Lösung wurden 910 mg Tris-(p_-chlorphenyl)-phosphit hinzugefügt. Das Gemisch wurde dann 5 Stunden bei 40 ⁰O gerührt. Das Lösungsmittel wurde von dem Reaktionsgemisch unter vermindertem Druck abdestilliert, und zu dem Rückstand wurde Benzol hinzugefügt, um kristalline Substanzen abzuscheiden, die dann durch Filtration gewonnen wurden, wobei man 637 mg des gewünschten Produktes erhielt, das bei 166 ⁰O schmilzt.

- -31,8° (C - 1,0; Methanol).

- 10 -

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Beispiel 6 Benzyloacycarbonyl-Ii-seryl-Ir-tyrosinmettiylester

In 5 ml Dimethylformamid wurden gelöst 478 mg Benzyloxycarbonyl-L-serin, 390 mg L-Tyrosinmethy!ester, 485 mg 2,2^f-Dipyridyldisulfid und 681 mg Triphenylphosph.it, und das erhaltene Gemisch wurde 12 Stunden bei 20 ⁰C gerührt. Das Lösungsmittel wurde von dem Reaktionsgemisch unter vermindertem Druck abdestilliert, und der Rückstand wurde der Säulenchromatographie unter Verwendung von Silikagel unterworfen, wobei man 531 mg des gewünschten Produktes erhielt, das bei 115 "bis 116 ⁰G schmilzt. _D - +13,5° (0-2; Dimethylformamid).

Beispiel 7

N-Benzyloxycarbonyl-S-benzyl-L^cysteinyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-Klutaminyl-L-asparagin-tert.-buty!ester

In 5 ml Dimethylformamid wurden gelöst 501 mg N-Benzyloxycarbonyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-tyrosin, 429 mg L-Isoleucyl-L-glutaminyl-L-asparagin-tert.-butylester, 242 mg 2,2 »-Dipyridyldisulfid und 455 mg Tris<£-chlorphenyl)-phosphit, und das erhaltene Gemisch wurde dann 12 Stunden bei 15 ⁰O gerührt. Das Lösungsmittel wurde von dem Reaktionsgemisch unter vermindertem Druck abdestilliert, und zu dem Rückstand wurde ein Gemisch von Methylenchlorid mit Äther hinzugefügt, um kristalline Substanzen zu erhalten. Die Substanzen wurden dann durch Filtration gewonnen und nacheinander mit dem obigen Gemisch, 0,2 η Chlorwasserstoffsäure, Wasser, einer 5 %igen wäßrigen Lösung von Natriumbicarbonat und dann mit

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Wasser gewaschen und anschließend luftgetrocknet. Man erhielt 732 schmilzt.

hielt 732 mg des gewünschten Produktes, das "bei 230 ⁰C

-20,0° (C * 0,5; Dimethylformamid).

Patentansprüche:

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Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung eines Peptids, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Aminosäure oder Peptid, worin andere aktive funktionelle Gruppen als Carboxylgruppe

/einer mit Schutzgruppen geschützt sind, mii/ Aminosäure oder Peptid, worin andere aktive funktioneile Gruppen als ■äminogruppe mit Schutzgruppen geschützt sind, in Gegenwart eines Triarylphosphits und eines Disulfids einer mercaptoheterocyclischen Verbindung, enthaltend eine Stickstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung, mit welcher die Disulfidbindung konjugiert, zur Heaktion bringt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Triarylphosphit ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Triphenylphosphit, Tris-(chlorphenyl)-phosphiten, Tris-(methoxyphenyl)-phosphiten und Tritolylphosphiten.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Triarylphosph.it ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend ans Triphenylphospb.it, TrIs-(p_-chlorphenyl)-phosphit und Tris-(p_-methoxyphenyl)-phosphit.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Disulfid ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus substituierten oder unsubstituierten Dipyridyldisulfiden.

5· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Disulfid ausgewählt ist aus der Gruppe, -bestehend aus 2,2'-Dipyridyldisulfid, 2_J2^l-Bis-(5-nitropyridyl)-disulfid und 2,2'-Bis-(5-methy!pyridyl)-disulfid.*

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