Verfahren zur Herstellung von Thallium- bzw. Organothalliumsalzen von N-Carboxy- bzw. N-Thiocarboxypeptiden
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein neues Verfahren zur gesteuerten stufenweisen Herstellung von Thallium- bzw. Organothalliumsalzen von N-Carboxy- bzw. N-Thiocarboxypeptiden, bei dem ein N-Carboxy-a-aminosäureanhydrid, oder ein N-Thiocarboxya-aminosäureanhydrid in einem wässrigen Milieu mit einer Aminosäure, einem Peptid oder einem funktionellen Derivat davon in Gegenwart eines Thallium-I-Ions oder eines Organothallium-III-Ions umgesetzt wird.
Die Peptide bzw. Polypeptide sind eine grosse Klasse von chemischen Verbindungen, welche Dipeptide, Tripeptide, Tetrapeptide und höhere Peptide umfasst, bei denen Aminosäuren durch Amid-Bindungen (Peptid-Bindungen) miteinander verbunden sind. Die gesteuerte stufenweise Synthese von Polypeptiden und insbesondere von Heteropeptiden ist ein Problem, das die Fachleute seit langem beschäftigt. Solche Produkte sind als Zwischenprodukte zur Synthese von Proteinen nützlich; gewisse sind therapeutisch wirksam; sie sind ebenfalls bei der Untersuchung und der Analyse von Proteinen nützlich, insbesondere bei Untersuchungen, die dazu dienen, die Wirkungsweise von Enzymen, Hormonen und andern Proteinen mit wichtigen Funktionen im Organismus zu erforschen.
In der vorliegenden Beschreibung und in den Ansprüchen wird der Ausdruck Peptid aus Gründen der Zweckmässigkeit im allgemein Sinn verwendet, so dass er nicht nur Dipeptide sondern auch Polypeptide und Proteine mit einem mittleren und hohen Molekulargewicht einschliesslich Tripeptide, Tetrapeptide und dergleichen umfasst. Zu den bei der vorliegenden Erfindung nützlichen Aminosäuren gehören sowohl natürliche als auch synthetische Aminosäuren in der Dextro- und Levo-Form und Gemische solcher Formen, einschliesslich razemischer Gemische. Der Ausdruck Derivate umfasst Aminosäuren, Peptide und deren N-Carboxy- und N-Thiocarboxy-Analoga, bei denen verschiedene funktionelle Gruppen durch eine leicht entfernbare Gruppe, wie z.
B. die im-Benzyl-Gruppe, die Trialkylsilylgruppe, die Carbobenzoxygruppe, die tert-Butyloxycarbonyigruppe und dergleichen, blockiert werden.
Der Ausdruck Derivate umfasst auch Amide, Ester und andere funktionelle Modifikationen der Carboxylgruppe der Aminosäure oder des Peptids sowie Homologa und Analoga natürlicher Aminosäuren, bei denen ein oder mehrere Wasserstoffatome z. B. durch eine Niederalkylgruppe, wie z.B. a-Methylleucin oder a Fluorglycin, substituiert sind.
Es wurde kürzlich gefunden, dass Peptide und deren Derivate so erzeugt werden können, indem als Ausgangsmaterial eine Aminoverbindung aus der aus Aminosäuren, Peptiden und Derivaten davon, die eine freie Aminogruppe enthalten, gebildeten Gruppe in einem wässrigen Milieu unter solchen gesteuerten Bedingungen, dass die einzige Aminogruppe, die im Verlauf der Umsetzung in reaktionsfähiger Form und beträchtlicher Konzentration vorliegt, die Aminogruppe des Aminosäurepeptides oder Derivats davon ist, die sich zur Bildung des gewünschten Produkts umsetzen soll, mit einem N-Carboxyaminosäureanhydrid, einem N-Thiocarboxyaminosäureanhydrid oder einem Derivat dieser Anhydrid-Reagenzien umgesetzt wird.
Unter sorgfältig gesteuerten pH-, Temperatur-, Vermischungsgeschwindigkeits- und Reagenzienkonzentrationsbedingungen geht die Umsetzung des Anhydrids, Thioanhydrids oder Derivats davon mit der Aminosäure, dem Peptid oder dem Derivat davon unter minimaler Bildung von Nebenprodukten vor sich.
Am Ende der Reaktionsperiode wird die Peptidcarbamat- oder Peptidthiocarbamat-Zwischenverbindung durch die Beigabe von Säure zur Bildung des gewünschten Peptids unter Entwicklung von Kohlendioxyd oder Carbonylsulfid zersetzt. Normalerweise wird dies durch die Beigabe von genügend Säure zur Herabsetzung des pH-Wertes auf etwa 3-5 erzielt. Es können verschiedene Säuren verwendet werden. Bevorzugt werden Mineralsäuren, wie z. B. Schwefelsäure oder Salzsäure, doch können auch organische Säuren und insbesondere star ke.organische Säuren, wie z. B. Sulfosäuren, verwendet werden.
Die Umsetzung eines N-Carboxyaminosäureanhydrids oder eines Derivats davon mit einer Aminosäure, einem Peptid oder einem Derivat davon wird normalerweise in einem wässrigen Milieu, das ein organisches Lösungsmittel, vorzugsweise ein mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel, enthalten kann, um die Löslichkeit der Reagenzien zu erhöhen, durchgeführt. Die Umsetzung wird bei einer Temperatur von etwa 0 bis etwa 100 C bei einem pH von etwa 4 bis etwa 11 und vorzugsweise 9 bis 11 in einem Zeitraum von etwa 5 Minuten ausgeführt. Die Reagenzien werden durch Rühren oder eine andere Bewegungsform innig vermischt. Normalerweise wird ein Überschuss an Anhydrid verwendet.
Die Umsetzung eines N-Thiocarboxyaminosäureanhydrids oder eines Derivats davon mit einer Aminosäure, einem Peptid oder einem Derivat davon wird vorzugsweise in einem wässrigen Milieu, das zur Erhöhung der Löslichkeit der Reagenzien ein organisches Lösungsmittel und vorzugsweise ein mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel enthalten kann, durchgeführt.
Die Umsetzung wird bei einer Temperatur von etwa 0 bis etwa 600 C und einem pH von etwa 4 bis 10 und vorzugsweise 7,5 bis 10 in einem Zeitraum von etwa einer halben Stunde bis etwa 4 Stunden oder auch beträchtlich weniger ausgeführt. Wie bei der obigen Methode werden die Reagenzien durch Rühren oder eine andere Bewegungsform innig miteinander vermischt.
Auch wird es vorgezogen, überschüssiges Anhydrid zu verwenden.
Aus Gründen der Zweckmässigkeit wird die N-Carboxyanhydrid-Methode nachstehend als das NCA-Verfahren und die N-Thiocarboxyanhydrid-Methode als das TCA-Verfahren bezeichnet.
Sowohl das NCA- als auch das TCA-Verfahren sind bei der gesteuerten stufenweisen Synthese von Peptiden, einschliesslich Polypeptide und Proteine mit einem hohen Molekulargewicht, in einem wässrigen Milieu ohne Isolierung von Zwischenprodukten nützlich. Es wurde jedoch festgestellt, dass bei der Herstellung von ein niedriges Molekulargewicht aufweisenden Peptiden und insbesondere Di-, Tri- und Tetrapeptiden die Gefahr einer Ueberreaktion besteht, was zur Anhäufung unerwünschter Nebenprodukte im Reaktionsmilieu führt.
Dies rührt von einer Umsetzung von umgesetztem Carboxy- oder Thiocarboxyanhydrid mit dem sich bildenden Peptidcarbamat oder Peptidthiocarbamat her.
So kann z. B. eine Umsetzung zur Herstellung eines Dipeptids zur Bildung wahrnehmbarer Mengen von Tripeptid infolge der Umsetzung einer Carbamat- oder Thiocarbamat-Zwischenverbindung mit dem Anhydrid Reagens führen.
Bei der Herstellung von Peptiden mit einem hohen Molekulargewicht, z. B. von solchen, welche 7 oder mehr Aminosäuresegmente aufweisen, ist es oft wünschenswert. das von angehäuften Nebenprodukten im wesentlichen freie Peptid zu isolieren. Das isolierte Peptid kann dann zur Fortsetzung der Polypeptidsynthese in einem nicht kontaminierten Reaktionsgemisch in einem frischen wässrigen Milieu verwendet werden.
Gemäss der vorliegenden Erfindung wurde nun gefunden, dass diese beiden Ziele erreicht werden können, indem die Kupplungsumsetzung zwischen dem Anhydridreagenz oder einem Derivat davon und der Aminosäure, dem Peptid oder dem Derivat davon, das als Ausgangsverbindung verwendet wird, unter den oben beschriebenen Bedingungen durchgeführt wird, indem jedoch als Verbesserung dem Reaktionsmilieu eine genügend hohe Konzentration an Thallium-I-Ion oder Organothallium-III-Ion zur Bildung eines unlöslichen Salzes mit dem Peptidcarbamat oder Peptidthiocarbamat einverleibt wird. Die Quelle dieser Ionen kann bei der Umsetzung vorhanden sein oder dann beigefügt werden, wenn die Umsetzung im wesentlichen zu Ende ist.
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung von Thallium- bzw. Organothalliumsalzen von N-Carboxy- bzw. N-Thiocarboxyaminoverbindungen ist nun dadurch gekennzeichnet, dass ein N-Carboxy-a-aminosäureanhydrid oder N-Thiocarboxy-a-aminosäureanhydrid in einem wässrigen Milieu, in welchem die erwähnten Salze unlöslich sind, in Gegenwart eines Thallium I-Salzes bzw. einer Organothallium-III-Verbindung, die zwei organische Reste mit je bis zu 10 Kohlenstoffatomen aufweist, mit einer Aminoausgangsverbindung, welche eine einzige freie Aminogruppe aufweist und welche aus einer Aminosäure, einem Peptid oder aus einem funktionellen Derivat dieser Verbindungen besteht, unter solchen gesteuerten Bedingungen umgesetzt wird, dass die freie Aminogruppe der genannten Aminoausgangsverbindung unter Bildung einer Peptidbindung mit dem Anhydrid reagiert, wobei gleichzeitig das genannte Thallium- bzw.
Organothalliumsalz gebildet wird, oder dass man zuerst die genannten Ausgangssubstanzen zu N-Carboxy- bzw. N-Thiocarboxy-aminoverbindungen reagieren lässt und dann das Thallium-I-Salz bzw. eine Organothallium-III-Verbindung zur Bildung des unlöslichen Thallium- bzw. Organothalliumsalzes zusetzt.
Bei der Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens muss zweckmässigerweise die Wahl der Quelle des Thallium-I-Ions oder das Organothallium-III-Ions besonders beachtet werden. Die Quelle sollte ein Salz sein, das im Reaktionsmilieu genügend löslich ist, um eine wirksame Kationenkonzentration zu erzeugen. Bei der Wahl werden in der Regel auch die jeweiligen Reaktionsteilnehmer und die gewünschte Methode zur Ausführung der Synthese berücksichtigt. Gewisse Thallium Salze, insbesondere diejenigen, die aus ein niedriges Molekulargewicht aufweisenden N-Carboxy- bzw.
N-Thiocarboxyaminoverbindungen gebildet werden, sind in wässrigen Milieus recht löslich. Darüberhinaus neigen Thallium-I-N-Carboxy- bzw. Thallium-I-Thiocarboxyaminoverbindungen zur Unbeständigkeit. So fällt das Thallium-I-Ion keine verhältnismässig grossen Mengen gewisser N-Carboxy- bzw. N-Thiocarboxyaminoverbindungen und selbst in den Fällen, wo sich verhältnismässig grosse Niederschlagsmengen bilden, bleibt eine beträchtliche Menge von gelösten Thallium I-N-Carboxy- bzw. Thallium-I-Thiocarboxyaminoverbindungen im Reaktionsmilieu zurück. Übrigens ist es häufig selbst in denjenigen Fällen, wo das im wesentlichen ganze Thallium-I-Salz gefällt wird, nicht zweckmässig, das Thallium-I-Ion als Ausfällmittel zu verwenden, da das gefällte Salz rasch verwendet werden sollte, um die Gefahr einer Zersetzung zu vermeiden.
Die als Ausfällmittel verwendeten Organothalliumionen, und zwar gleichgültig, ob sie während der Umsetzung oder dann, wenn die Umsetzung im wesentlichen zu Ende, eingesetzt werden, geben bessere Ergebnisse. Die Wahl wünschenswerter organischer Radikale kann jedoch ein Problem sein. Gewisse Organothalliumsalze, die als Quelle des Organothallium-III-Ions betrachtet werden könnten, würden sich nicht eignen, da sie im ursprünglichen Reaktionsmilieu im wesentlichen unlöslich sind und keine genügende Organothalliumionkonzentration erzeugen würden, um nützliche Mengen von Organothallium-N-Carboxy- bzw. Organothalliumthiocarboxyaminoverbindungen zu fällen. Deshalb sollte das als Ausfällmittel verwendete ursprüngliche Organothalliumsalz im Reaktionsmilieu recht löslich und das im Reaktionsmilieu gebildete Organothalliumion eines sein, dass die N-Carboxy- bzw.
Thiocarboxyaminoverbindung ausfällt.
Gewisse Organothalliumsausfällmittel können zur Fällung spezifischer N-Carboxy- bzw. Thiocarboxyaminozwischenverbindungen, jedoch nicht zur Fällung anderer N-Carboxy- bzw. Thiocarboxyaminozwischenverbindungen nützlich sein. So ist es z. B. möglich, dass ein zur Fällung eines ein hohes Molekulargewicht aufweisenden N-Carboxy- bzw. Thiocarboxyaminozwischenprodukt nützliches Organothalliumausfällungsmittel zur Fällung von Produkten mit niedrigem Molekulargewicht ungeeignet sind.
Die meisten Thallium-I-Salze sind in wässrigen Milieus löslich; die bemerkenswerte Ausnahme bilden die Halogen-, Brom- und Jodsalze. Infolgedessen kann in den Fällen, wo das Thallium-I-Ion bei der Bildung von Peptidcarboxy- bzw. Thiopeptidcarboxyaminosalzen nützlich ist, fast jede Quelle mit Ausnahme der obenerwähnten Halogensalze verwendet werden. Dies ist besonders zweckmässig, da sowohl beim NCA- als auch beim TCA-Verfahren die Wasserstoffionenkonzentration unter Verwendung von Puffern und häufig von Borat-, Carbonat- oder Phosphatpuffern innerhalb der gewünschten Grenzen gehalten wird. Da die aus dem beim Puffer verwendeten Anion gebildeten Thalliumsalze löslich sind, besteht keine Gefahr, dass die Umsetzung durch die Tällung von Thallium-I-Salzen der Pufferreagenzien beeinträchtigt wird.
Im allgemeinen weisen Organothalliumsalze die gleichen Löslichkeitsmerkmale wie die Thallium-I-Salze auf, doch wird die Löslichkeit durch die Gegenwart organischer Radikale am Salz beeinflusst. Wie bei den Thallium-I-Ionen sind die Organothalliumchloride, Organothalliumbromide und Organothalliumjodide unlöslich. Mit zunehmendem Molekulargewicht der organischen Radikale werden die Organothalliumsalze in zunehmendem Masse schwerer löslich. Im allgemeinen sind die bevorzugten Salze Sulfonate, z. B. Dimethylthalliumsulfonate. Besonders bevorzugt werden die von Methan- und Äthansulfonsäure hergeleiteten, da sie leicht erhältlich sind und sich aus ihnen eine weite Vielfalt von zur Fällung von Peptidcarbamaten und Peptidthiocarbamaten nützlichen Organothalliumverbindungen ohne weiteres erzeugen lässt.
Es werden Organothalliumverbindungen verwendet, bei denen die Organothallium-Gruppe aus einem Thalliumatom und zwei organischen Resten, die bis zu etwa 10 Kohlenstoffatomen enthalten, besteht. Zu diesen gehören z. B. Aryl, Alkyl, Cycloalkyl, Alkaryl, Aralkyl; andere zyklische Reste können entweder homocyclisch oder heterocyclisch sein. Reste, die beispielsweise erwähnt werden können, sind Methyl, Methyl, Propyl, Butyl, Phenyl, Tolyl, Naphthyl, Cyclohexyl, Furanyl, Pyridinyl, Chinolyl und Isochinolyl. Die Reste können durch der Reaktion gegen über inerte Substituenten, z. B. Halogenatome, Nitrogruppen, Dialkylaminogruppen, Phenoxygruppen und dergleichen, weiter substituiert sein.
Wie oben erwähnt, sind die zur Verwendung beim vorliegenden erfindungsgemässen Verfahren bevorzugten Organothallium-Salze die Sulfonate, und die von Methan- und Athansulfonsäuren werden besonders vorgezogen. Mono- und Dihydroxyphenylsulfonate und insbesondere Resorcinsulfonat und p-Hydroxyphenylsulfonat sind ebenfalls nutzvoll. a-Naphthylsulfonat und dessen Mono- und Dihydroxy-Derivate werden den entsprechenden ss-Naphthylsulfonaten vorgezogen, doch können je nach der Struktur der zu fällenden Peptidcarboxy- bzw. Peptidthiocarboxyaminoverbindung beide Klassen von Verbindungen vorteilhaft verwendet werden.
Die beim vorliegenden erfindungsgemässen Verfahren verwendeten neuartigen Organothalliumsulfonatsalze werden am zweckmässigsten nach folgendem Fliess Schema erzeugt:
EMI3.1
In diesen Gleichungen ist R ein organischer Rest der oben beschriebenen Klasse und R' der organische Rest einer Sulfosäure, wie z. B. Methyl, Äthyl, Monound Dihydroxyphenyl, a- oder ss-Naphthyl und Monound Dihydroxy-Derivate von a- und ss-Naphthyl. R' kann auch ein anderer bis zu 10 Kohlenstoffatomen aufweisender Alkyl- oder Aryl-Rest sein. X ist Chlor, Brom oder Jod und M ein ein in Wasser unlösliches Chlorid, Bromid oder Jodid bildendes Metall.
Das Fliess-Schema zeigt die Herstellung eines Diorganothallium-III-Halogenids durch Umsetzung eines Thallium-III-chlorids mit einem Grignard-Reagens. Zur Verwendung beim vorliegenden erfindungsgemässen Verfahren werden Dimethyl- und Dibutylth allium-III- Salze besonders bevorzugt, die ersteren, da sie aus wirtschaftlich erhältlichen Reagenzien leicht hergestellt werden können, die letzteren wegen ihrer breiten Anwendbarkeit hinsichtlich der Fällung einer Vielfalt von Peptidcarboxy- bzw. Peptidhiocarboxyamino-Salz-Zwi- schenverbindungen. Durch die Umsetzung des auf diese Weise gebildeten Diorganothallium-III-chlorids mit einem Salz der gewählten Sulfosäure, vorzugsweise mit dem Silbersalz, wird die gewünschte Verbindung erzielt.
Das zur Verwendung bei der Herstellung der bei der vorliegenden Erfindung verwendeten Organothallium Verbindungen bevorzugte Thalliumsalz ist Thallium III-chlorid, das nach den von Johnson und Walton in Inorg. Chem. 5, 49 (1966) beschriebenen Verfahren durch die Chlorierung von Thallium-I-chlorid in einem wasserfreien organischen Lösungsmittel, wie z. B. Acetonitril, erzeugt werden kann. Am Ende der Reaktionsperiode wird die Lösung bei etwa 25 C unter vermindertem Druck zur Trockene konzentriert. Das Acetonitril-Solvat vom Thallium-III-chlorid zersetzt sich bei fortgesetzter Anwendung von vermindertem Druck zur Bildung des gewünschten Produkts.
Thallium-III-chlorid ist in Lösungsmitteln der zur Grignard-Umsetzung verwendeten Klasse und insbesondere in Ather-Lösungsmitteln, wie z. B. Diäthyläther, Di-n-butyläther, Tetrahydrofuran, und Dioxan, leicht löslich. Die Grignard-Umsetzung wird im gewählten Lösungsmittel unter im wesentlichen wasserfreien Bedingungen normalerweise bei einer Temperatur von etwa 0 bis 400 C während einer Reaktionsperiode, die nicht wesentlich ist, sondern von der gewählten Temperatur und der Mengen der Reaktionsteilnehmer abhängt, ausgeführt.
Das bei der Grignard-Umsetzung erzeugte Organothallium-halogenid, gewöhnlich das Chlorid, wird isoliert (am zweckmässigsten, indem das Lösungsmittel bei vermindertem Druck entfernt wird) und bei Raumtemperatur, d. h. etwa 20 bis 350 C, mit dem gewählten Salz der Sulfosäure in einem wässrigen Milieu, vorzugsweise Wasser, behandelt. Das Metallhalogenid fällt aus und wird entfernt, was zweckmässig durch Filtrieren erfolgt. Das gewünschte Produkt kann rückgewonnen werden, indem das Lösungsmittel gewöhnlich unter vermindertem Druck entfernt wird. Es wird vorgezogen, obwohl dies nicht wesentlich ist, ein molares Aequivalent des Salzes der Sulfosäure zu verwenden, um eine möglichst vollständige Umsetzung zu erzielen, wobei das gewünschte Produkt doch nicht mit nicht umgesetztem Salz verunreinigt wird.
Zur Herstellung von Thalliumsaizen von Peptidcarboxy- bzw. Peptidthiocarboxy-a-aminoverbindungen werden die NCA- und TCA-Verfahren wie oben beschrieben ausgeführt, ausser dass das Thallium-I-Salz oder das Organothallium-III-Salz dem Reaktionsmilieu einverleibt wird. Die unlösliche Thallium- oder Organothallium-Peptidcaboxy- bzw. -thiocarboxy-a-aminoverbindung fällt bei seiner Bildung aus. Die als Ausfällmittel zu verwendende Menge löslichen Thalliumsalzes hängt im allgemeinen von der Anzahl der funktionellen Gruppen, die für die Umsetzung zur Verfügung stehen.
Z. B. ist bei der Herstellung der Thiocarboxy-a-aminoverbindung von Leucyl-arginin bei einem pH von etwa 9 die einzige funktionelle Gruppe, die für die Umsetzung mit Thallium zur Verfügung steht, die Carboxybzw. Thiocarboxy-a-amino-Gruppe, da die Guanidyl Gruppe des Arginins die Carboxylgruppe als Zwitterion neutralisiert. Andererseits sind bei der Bildung von Glycylalanylphenylalinin zwei Aequivalent Thallium erforderlich, da zur Umsetzung mit Thallium nicht nur die Thiocarbamyl-Gruppe oder Carbamylgruppe sondern auch die Carboxylgruppe des Phanylalinins zur Verfügung steht. Zur Herstellung von Glycylglutaminsäure sind drei Aequivalent Thallium erforderlich, um beide Carboxylgruppen der Glutaminsäure und die Carbamyloder Thiocarbamylgruppe zu neutralisieren.
Auf alle Fälle wird es im allgemeinen vorgezogen, einen molaren Überschuss am gewählten Thallium-Ausfällmittel zu verwenden, um eine möglichst vollständige Fällung zu bewirken. Im typischen Fall wird ein etwa 100/oiger molarer Überschuss, auf das theoretische Thallium-Bedürfnis bezogen, verwendet.
Die erfindungsgemäss erzeugten Thallium- bzw. Organothalliumsalze von N-Carboxy- bzw. N-Thiocarboxyaminoverbindungen können zur Herstellung entsprechender Peptide verwendet werden. Diese Herstellung ist dadurch gekennzeichnet, dass eines der erwähnten Salze entweder im ursprünglichen wässrigen Milieu mit einer Säure umgesetzt wird oder das Salz zuerst isoliert, in ein anderes flüssiges Milieu aufgenommen und dann mit einer Säure umgesetzt wird, wobei man das entsprechende Peptid und ein entsprechendes Thalliumsalz entweder beide in Lösung oder eines von beiden als Niederschlag erhält.
Diese erfindungsgemässe Verwendung kann auf folgende Weise näher erläutert werden.
Mit Thallium-I-acetat als Quelle des Thallium I-Ions bei derHerstellung eines Dipeptids in einem wässrigen Milieu nach dem erfindungsgemässen Verfahren fällt die Thalliumpeptidcarboxyaminoverbindung aus. Wird nun diese letztere Verbindung zur Herstellung des entsprechenden Peptids verwendet, so wird die ausgefällte Thalliumpeptidverbindung mit Essigsäure umgesetzt. Diese Verbindung zersetzt sich in das gewünschte Peptid und das Thallium-I-acetat. Dieses letztere ist in wässrigem Milieu löslich, so dass eine wirksame Konzentration an Thallium-I-Ion zur Umwandlung des erzeugten Dipeptids in ein Tripeptid durch die Umsetzung mitzusätzlichem N-Carboxyaminosäureanhydrid im Reaktionsgemisch verbleibt.
Wird die gleiche Umsetzung mit der Thalliumpeptidverbindung ausgeführt, ausser dass zur Zersetzung der pH mit Salzsäure eingestellt wird, so ist das sich bildende Thallium-I-Salz Thallium-I-chlorid, das im Reaktionsmilieu unlöslich ist. Daher wird sich das bei der Zersetzungsreaktion gebildete Dipeptid lösen und Thallium-I-chlorid ausfallen. Es kann durch Filtrieren rückgewonnen werden. Zur Umwandlung des Dipeptids in ein Tripeptid nach dem erfindungsgemässen Verfahren ist es dann nötig, dem Filtrat ein wasserlösliches Thallium-I-Salz beizufügen. Ähnliche Verfahren können mit andern Organothallium-Reagenzien befolgt werden.
Wie oben erwähnt, ist somit das erfindungsgemässe Verfahren zur Reinigung ein hohes Molekulargewicht aufweisender Peptide besonders nützlich. Z. B. konnte ein 10 Aminosäure-Reste aufweisendes Polypeptid durch eine Reihe von Umsetzungen erzeugt werden, wobei verschiedene N-Thiocarboxyaminosäureanhydride nacheinander in eine ursprüngliche Aminosäure in einer wässrigen Lösung gegeben und nacheinander ein Dipeptid, ein Tripeptid, ein Tetrapeptid und schliesslich ein Decapeptid gebildet wurden. Neun verschiedene Umsetzungen konnten ausgeführt werden, von denen jede die Beigabe von Säure oder Base erforderte, um die Wasserstoffionenkonzentration zur Kupplung oder Zersetzung einzustellen. Bei jeder Umsetzung besteht die Möglichkeit einer Überreaktion oder anderer Nebenreaktionen.
Es wird dann klar, dass eine unerwünscht hohe Konzentration an organischen und anorganischen Nebenprodukten sich im Verlauf der Umsetzungen im Reaktionsmilieu ansammeln könnte. Es wäre zweckmässig, das Decapeptid aus dem kontaminierten Milieu zu isolieren, bevor es zur Bildung eines Undecapeptids mit einem weiteren N-Carboxyaminosäureanhydrid umgesetzt wird.
Die gewünschte Isolierung lässt sich ohne weiteres im Einklang mit dem erfindungsgemässen Verfahren durchführen. Z. B. kann die letzte Kupplungsreaktion zur Bildung des Decapeptids in Gegenwart eines Organothalliumsulfonats, z. B. von Dibutylthalliumäthansulfonat, ausgeführt werden. In einer Alternative kann das Thalliumsalz beigefügt werden, wenn die Kupplungsreaktion im wesentlichen zu Ende ist. In beiden Fällen fällt das Thalliumsalz des Decapeptidcarbamats aus.
Das Salz kann dann in ein flüssiges Milieu, in welchem das Decapeptid unlöslich ist, aufgenommen werden.
Wird das Thalliumsalz des Decapeptidcarboxyamines zur Herstellung des Decapeptids verwendet und somit, wie oben angeführt mit einer Säure zersetzt, wobei ein im gewählten Milieu lösliches Thalliumsalz gebildet wird, so löst sich das Thalliumsalz, und Decapeptid, das sich nicht löst, kann durch Filtrieren isoliert werden.
Z. B. kann das Decapeptid in Isopropanol aufgenommen und mit Äthansulfonsäure zersetzt werden. Dibutylthalliumsulfonsäure ist in Isopropanol löslich und löst sich daher bei ihrer Bildung. Das Decapeptid löst sich nicht.
Folgende Beispiele dienen zur Veranschaulichung des erfindungsgemässen Verfahrens.
Beispiel 1
Dibutylthalliummethansulfonat
Insgesamt 4,65 g Dibutylthalliumchlorid werden in 50 ml eine kleine Menge Methanol enthaltendem Wasser suspendiert, und 2,67 g (durch Neutralisierung von Methansulfonsäure in wässriger Lösung mit Silberoxyd hergestelltes) Silbermethansulfonat werden unter Rühren beigefügt. Es wird weiter gerührt, während die Temperatur bei 60-700 C gehalten wird. Das Gemisch wird bei schwachem Licht bei dieser Temperatur gehalten, bis die Bildung und Fällung von Silberchlorid nicht mehr sichtbar ist. Die Suspension wird filtriert und der Niederschlag mit Wasser und mit Methanol gewaschen.
Das Filtrat und das zum Waschen verwendete Wasser und Methanol werden kombiniert und bei vermindertem Druck konzentriert, um die Kristallisation des gewünschten Produkts zu bewirken, das durch Filtrieren gesammelt wird.
Dieses Verfahren wird befolgt, um eine Vielfalt von Organothallium-III-alkansulfonaten herzustellen, einschliesslich spezifisch derjenigen, bei denen die Organo Reste bis zu 10 Kohlenstoffatomen aufweisen und der Alkan-Rest von Methansulfosäure, Äthansulfosäure, p-Hydroxyphenylsulfosäure, Resorcinsulfosäure, a- und ss-Naphthylsulfosäure, 4-Hydroxy-a-naphthylsulfosäure und 4-Hydroxy-ss-naphthylsulfosäure abgeleitet ist. Spezifische Organo-Reste in den erzeugten Verbindungen sind z. B. Methyl, Methyl, Propyl, Butyl, Phenyl, Tolyl, Naphthylcyclohexylfuranyl, Pyridinyl, Chinonyl, Isochinonyl, p-Chlorphenyl-4-phenoxytolyl und p-Nftronaph- thyl.
L-Valyl-L-Serin
1 Millimol L-Serin wird in 50 ml Wasser gelöst, und 2 Millimol Dibutylthalliummethansulfonat werden beigefügt. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur magnetisch gerührt und der pH mit 2,5 N Natriumhydroxyd auf 9,0 eingestellt. Ein Millimol pulverförmiges N-Thiocarboxyvalinanhydrid wird beigefügt, während der pH durch die Beigabe von 2,5 N Natriumhydroxyd aus einer Mikobürette in der Nähe von 9 gehalten wird. Man lässt die Umsetzung vor sich gehen, bis sich kein Niederschlag des Dibutylthallium-Salzes von L-Valyl-L-se rin-thiocarboxamino-Salz bildet (etwa 1 Stunde).
Verwendung der Peptidverbindung
Die wässrige Suspension des Dibutylthallium-Salzes von L-Valyl-L-serin-thiocarboxyamino wird mit Salzsäure angesäuert und mit Stickstoff gereinigt, um das Thiocarboxyamino-Salz zu zersetzen und das gewünschte Dipeptid zusammen mit Carbonylsulfid und Dibutylthalliumchlorid zu bilden. Dieses Salz fällt aus und wird durch Filtrieren entfernt. Das Peptid löst sich und wird chromatographisch zurückgewonnen.
Befolgt man dieses Verfahren mit Dimethylthalliumäthansulfonat, so erhält man das entsprechende Produkt.
Beispiel 2
L-Valyl-L-valyl-L-serin
Das Verfahren von Beispiel 1 wird wiederholt, ausser dass das Thalliumthiocarbamat mit Essigsäure zersetzt wird. In diesem Fall sind sowohl das Dipeptid als auch das sich bildende Dibutylthalliumacetat im Reaktionsmilieu löslich. Das Dipeptid wird im selben Milieu unter denselben Bedingungen mit einem zusätzlichen Millimol N-Thiocarboxy-L-valinahydrid umgesetzt. Das sich bildende Dibutylthallium-Salz des Thiocarboxyamins von L-Valyl-L-valyl-L-serin wird dann wie in Beispiel 1 beschrieben mit Salzsäure zersetzt, so dass Dibutylthalliumchlorid gefällt und L-Valyl-L-valyl-L-serin erzeugt wird. Das Chloridsalz wird durch Filtrieren entfernt und das Tripeptid chromatographisch rückgewonnen.
Befolgt man das Verfahren mit Dimethylthalliumäthansulfonat, so erhält man das entsprechende Produkt.
Beispiel 3
Leucyl-arginin
1 Millimol Arginin wird in 50 ml Wasser aufgenom men und magnetisch gerührt, während der pH mit 2,5 N Natriumhydroxyd auf 9,5 eingestellt wird. 1 Millimol N-Thiocarboxyleucin-anhydrid wird beigefügt und das Gemisch etwa 18 Minuten bei Raumtemperatur gerührt.
Dann wird ein Millimol Dibutylthalliummethansulfonat in einer konzentrierten wässrigen Lösung beigefügt, und es bildet sich ein reichlicher Niederschlag von Mo no-(Dibutylthallium)4eucylargininthiocarboxyamins.
Das gefällte Organothalliumthiocarboxyamins wird durch Filtrieren gesammelt, in Wasser aufgenommen und durch die tropfenweise Beigabe von genügender Bromwasserstoffsäure gemäss Verfahren von Beispiel 1, um den pH auf 3,0 herabzusetzen, zersetzt. Unlösliches Dibutylthalliumbromid bildet sich ziemlich langsam und fällt aus. Es wird durch Filtrieren rückgewonnen. Das Filtrat wird unter Verwendung von Stickstoff von Car bonylsulfid gereinigt und das gewünschte Produkt chromatographisch isoliert.
Unter Verwendung von Dibenzylthalliumäthansulfonat als Quelle des Organothallium-Rests wird das gleiche Produkt erzeugt.
Zur Herstellung von Glycylserin und Glycylarginin wird dasselbe Verfahren verwendet.
Beispiel 4
Glycylalanylphenylalanin
Insgesamt 0,47 g Alanylphenylalanin wird in 20 ml Wasser aufgenommen und der pH mit 2,5 N Natriumhydroxyd auf 9,5 eingestellt, während die Temperatur bei 3 C gehalten wird. In das Gemisch wird 0,206 g N-Thiocarboxyglycylanhydrid gegeben. Nach 10 Minuten werden 1,66 g Dibutylthalliummethansulfonat beigefügt. Ein schwerer Niederschlag von Di-(dibutylthallium) glycylalanylphenylalaninthiocarboxyamins bildet sich und wird durch Filtrieren gesammelt. Der Niederschlag wird in Wasser suspendiert und durch die Beigabe von Methansulfonsäure zersetzt. Die sich bildende Thalliummethansulfonsäure ist löslich. Sie wird durch die Beigabe von Natriumjodid als Dibutylthalliumjodid gefällt.
Das in Lösung verbleibende Tripeptid wird nach Entfernen des Jodid-Niederschlags durch Filtrieren chromatographisch gesammelt.
Beispiel 5
Alanylalanylphenylalanin
Insgesamt 0,472 g Alanyiphenylalanin werden unter magnetischem Rühren in eine kleine Menge Wasser aufgenommen. Die Temperatur wird durch äussere Kühlung und gelegentliche Beigabe von Eis bei etwa 3 C gehalten. Der pH wird mit 2,5 N Natriumhydroxyd auf 9,6 eingestellt, und 0,26 g N-Thiocarboxyalaninanhydrid werden beigefügt. Das Gemisch wird 10 Minuten gerührt, und 1,613 g Dibutylthalliummethansulfonat werden beigefügt, um eine rasche Fällung von Di-(dibutylthallium)alanylalanylph enylalaninthiocarboxyamins zu bewirken. Der Niederschlag wird durch Filtrieren gesammelt, in Wasser aufgenommen und durch die Beigabe von wässriger Bromwasserstoffsäure gemäss Verfahren vom Beispiel 1 zur Bildung des gewünschten Tripeptids zersetzt.
Das ausfallende Dibutylthalliumbromid wird durch Filtrieren entfernt und das gewünschte Tripeptid chromatographisch aus der Lösung rückgewonnen.
Beispiel 6
Die Verfahren der obigen Beispiele werden unter Verwendung von N-Carboxyaminosäureanhydrid anstelle des angegebenen N-Thiocarboxyaminosäureanhy- drids befolgt, wobei die gleichen Produkte erzielt werden. Die Reaktionsdauer der Kupplungsumsetzung wird in jedem Fall auf weniger als 1 Minute herabgesetzt, und die Temperatur der Kupplungsumsetzung beträgt etwa 10 C. Ein alkalischer pH wird unter Verwendung eines Natriumborat-Puffers anstelle von Natriumhydroxyd aufrechterhalten.
Beispiel 7 Phenylalanylphenylalanylarginin
Insgesamt 1 Millimol Phenylalanylarginin wird in eine kleine Menge Natriumborat-Pufferlösung bei pH 9,5 aufgenommen und 1 Millimol Thallium-I-acetat beigefügt. Die Lösung wird bei Raumtemperatur gehalten und 1 Millimol N-Thiocarboxyphenylalaninanhy drid beigefügt. Das Gemisch wird etwa 20 Minuten bei Raumtemperatur gerührt, während der pH durch die Beigabe von 2,5 N Natriumhydroxyd aus einer Mikrobürette bei etwa 9,5 gehalten wird. Am Ende dieser Periode wird das ausfallende Thallium-I-Salz des Thiocarboxyamins von Phenylalanylphenylalanylarginin durch die Beigabe von Salzsäure zersetzt, wie im Beispiel 1 beschrieben, während Stickstoff durch das Gemisch geperlt wird, um das Carbonylsulfid zu eliminieren.
Das gewünschte Tripeptid, das sich bei seiner Bildung löst, wird chromatographisch rückgewonnen.