Verfahren zur Herstellung von a-Aminobenzylpenicallinen
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von α-Aminobenzylpenicillinen bei welchem 6-Aminopenicillansäure und Thioester des 2-Phenylglycins umgesetzt werden.
α-Aminobenzylpenicillin ist ein neues Penicillin, zu dessen Herstellung bisher folgender Weg eingeschlagen wurde : Herstellung von a-Aminophenyl- essigsäure, Umsetzung dieser Säure zum Schutz ihrer Aminogruppe, z. B. mit Benzoxycarbonylchlorid, wobei a-Carbobenzoxyaminophonylessigsäure entsteht, Bildung eines gemischten Anhydrids der letzteren Verbindung, Umsetzung des gemischten Anhy drids mit 6-Aminopenioillansäure, nachfolgende Entfernung der die Diaminogruppe schützenden Gruppe durch Abspaltung vermittels katalytischer Hydrierung und schliesslich Reinigung des Endproduktes.
Ein derartiges Verfahren lässt sich nur recht schwer im technischen Masstab durchführen und hat darüber hinaus den Nachteil ausserordentlich kostspielig zu sein, insbesondere wegen der katalytischen Hydrierung, welche beträchtliche Mengen an Hydrierungskatalysatoren erfordert.
Die vorliegende Erfindung hat ein verbessertes und diese Nachteile nicht aufweisendes Herstellungs- verfahren für a-Aminobonzylpenicillin und a-Alkyl- aminobenzylpenicilline zum Ziel. Sie ermöglicht auch die Herstellung von Stereoisomeren dieser Substanzen. Die Verfahrensprodukte werden danach mit hohen Ausbeuten in guter Reinheit und mit einem Minimum an durchzuführenden chemischen Operationen erhalten.
Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man 6-Aminopenicillansäure in einem wässrigen sauren Reaktionsmedium umsetzt mit Verbindungen oder mit Säureadditionssalzen von Verbindungen der Formeln
EMI1.1
worin R und R, Wasserstoff-, Brom-, Chlor-oder Jodatome oder Nitro-, Sulfamyl-, Cyclopentyl, Cyclohexyl-, Acylamino-, niedrige Alkylamino-, niedrige Dialkylamnio-, niedrige Alkylthio-, Benzyl-oder Trifluormethylreste sind, R2 Wassorstoff oder ein niederer Alkylrest ist und n eine ganze Zahl von 1 bis 6 bedeutet.
Als Säureadditionssalze der genannten Thioester können verwendet werden, das Hydrochlorid, Hydrojodid, Hydrobromid, Sulfat, Sulfamat und Phosphat, sowie die Additionssalze organischer r Säuren, wie das Maleat, das Acetat, das Citrat, das Malat, das Oxalat, das Sucoinat, das Benxoat, das Tartrat, das Fumarat, das Mandelat, das Ascorbat und dergleichen. Der Ausdruck niedriges Alkyl , wie er im vorstehenden verwendet worden ist, bedeutet gerade oder verzweigte gesättigte Kohlen wassersto±fradikale rnit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, wie z. B. Methyl, Athyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, t-Butyl usw.
Der Ausdruck CnH2n der im vorstehenden verwendet worden ist, bedeutet ein niederes Alkylenradikal, d. h. ein gesättigtes zweiwertiges gerades oder verzweigtes aliphatisches Koh lenwasserstoffradikal mit nicht mehr als 6 Kohlen- stoffatomen, wie z. B. Methylen, Athylen, Propylen, l-Methyläthylen, 2-Methylpropylen, etc.
Vorzugsweise Ausgangsprodukte für das erfindungsgemässe Verfahren, welche mit der 6-Amino- penicillansäure umgesetzt werden sollen, sind das S- (2-Phenylglycyl)-thiophenylhydroohlorid und das S- (a-Aminophenylacetyl)-thioessigsäure-hydrochlorid.
Mit diesen Ausgangssubstanzen entsteht das a-Amino benzylpenicillin. Wie unten noch ausgeführt wird, kann als Thioester des 2-Phenylglycins entweder das reine Diastereoisomere oder ein Gemisch der Diastereoisomeren des Thioesters verwendet werden.
Vorzugsweise führt man die Umsetzung in einer wässrigen Lösung von Essigsäure, die zwockmässig zwischen ungefähr 25 und 60 /oEssigsäure enthält, durch. Falls niedrigere Konzentrationen als 25% an Essigsäure angewendet werden, empfiehlt es sich, die Lösung z. B. mit Salzsäure anzusäuern derart, dass ihr pH-Wert zwischen ungefähr 1, 5 und 3, vorzugsweise in der Gegend von 2, liegt. Die Verwendung einer wässrigen Pufferlösung mit einem pH-Wert von unge fähr 5, 5 bis 6 führt zu Ausbeuten, die etwa niedriger liegen, als diejenigen welche man mit dem vorgenann- ten, vorzugsweise anzuwendenden Reaktionsmedium erhält. Die im letztgenannten Medium einzuhaltenden Reaktionszeiten können in weitem Rahmen von beispielsweise wenigen Minuten (3 bis 15 Minuten) bis zu mehreren Stunden, z.
B. 3 oder 4 Stunden, variieren. Ebenfalls kann die Reaktionstemperatur in weitem Ausmass von z. B. einigen Graden unter 0 C bis-zu ungefähr 500 C variiert werden. Die vorzugsweise einzuhaltende Reaktionstemperatur ist ungefähr 0 C. Falls die Reaktion in einer wässrigen Pufferlösung bei einem pH-Wert von ungefähr 5, 5 bis 6, 0 ausgeführt wird, beträgt die vorzugsweise einzuhaltende Reaktionszeit ungefähr 1 bis 4 Stunden. Falls in gepuffertem Medium gearbeitet werden soll, empfiehlt sich die Verwendung eines Citratpuffers, obgleich auch andere Puffer zur geeigneten pH-Kontrolle verwendet werden können, wie z. B.
Phosphat-, Succinat-und Acetatpuffer, etc. Weiterhin können geeignete bekannte Mittel zur Aufrechterhaltung eines gewünschten pH-Wertes des Reaktions- mediums Verwendung finden, wie z. B. der perio- dische oder kontinuierliche Zusatz von Säuren oder Basen. Eine Bewegung des Reaktionsgemisches emp fiehlt sich zur Erhöhung des Kontaktes zwischen der 6-Aminopenicillansäure und den Thioestern, von welchen einige nur spärlich im Reaktionsgemisch löslich sind. Die Abtrennung des gebildeten Penicillins aus dem Reaktionsmedium kann nach bekannten Aufarbeitungsmethoden durchgeführt werden.
Die Thioester des 2-Phenylglycins und der 2 Alkylamino-2-phenylessigsäure, welche nach bevor- zugten Durchfuhrungsmethoden des vorliegenden Herstellungsverfahrens mit der 6-Aminopenicilan- säure umgesetzt werden sollen, können leicht nach in der technischen Literatur beschriebenen Verfahren hergestellt werden, wie sie im übrigen unten in den Beispielen 1 und 2 näher angeführt sind. 2-Phenyl- glycin und viele Thiophonole und Mercaptoalkan- carbonsäuren sind handelsmässig erhältlich.
Das a-Kohlenstoffatom des 2-Phenylglycylradikals ist ein asymmetrisches Kohlenstoffatom, und die Thioester des 2-Phenylglycins können deswegen in zwei optisch aktiven isomeren Formen (den D- (-)und L- (+)-Diastereoisomeren) existieren. Ebenso existiert die optisch inaktive DL-Form als Gemisch der beiden optisch aktiven Formen. Beim erfindungs gemässen Herstellungsverfahren kann jeder dieser isomeren Formen der Thioester zur Herstellung der beiden Isomeren des a-Aminobenzylpenicillins verwendet werden, während das racemische Gemisch der Isomeren der Thioester zur Herstellung des DL a-AminobenzylpeniciLlins verwendet werden kann.
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung der beiden Diastereoisomeren des a-Aminobenzyl penicillins kann derart durchgeführt werden, dass zuerst ein optisch reines Isomeres des 2-Phenyl- glycins hergestellt wird, z. B. indem die optisch aktiven Formen aus DL-2-Phenylglycin vermittols Salzbildung mit optisch aktiven Basen, wie Chinin oder Brucin oder dergleichen, hergestellt werden, wonach aus den optisch aktiven Formen des 2-Phenylglycins die Thioester hergestellt und letztere bei der Acylierung der 6-Aminopenicillansäure verwendet werden.
In dieser Weise kann DL-2-Phenylglycin getrennt werden in D-2-Phenylglycin und L-2-Phenylglycin, welches jedes für sich zur Bildung eines geeigneten Thioestersverwendetwerden kann, wonach jeder dleser Thioeste, r mit 6-Aminopenicillansäure zum D-(-)-a-Aminobenzylpenicilllin und L- (+)-a-Amino- benzylpenicillin umgesetzt werden kann.
Beispiel 1
Herstellung von S- (DL-2-Phenylglycyl)- thiophenol-hydrochlorid
Eine Suspension von 40, 0 g = 0, 264 Mol DL-2 Phenylglycin in einem Liter Dichlormethan und 4 ml Dimethylfonnamid wird auf-50 C abgekühlt, wonach 80, 0 g = 0, 384 Mol Phosphorpentachlorid zugegeben worden. Hiernach wird 15 Minuten lang in einem Eisbad und schliesslich 1 Stunde lang bei Zimmertemperatur gerührt, Die ausgefallene feste Substanz wird abfiltriert und 2 mal mit Dichlormethan und hernach 1 mal mit trockenem Ather gewaschen. Anschliessend wird im Vakuum über Phosphorpentoxyd getrocknet. Man erhält 30 g.
Das getrocknete Produkt wird zu 44, 1 g = 0, 4 Mol Thiophenol und 100 ml Dimethylformamid hinzugegeben, wobei das Gemisch mit Eis gekühlt wird. Das Reak, tionsgemenge wird unter Kühlen 10 Minuten lang geschüttelt, bis sich seine Auflösung vervoll ständigt hat, worauf es 1 1/2 Stunden lang bei Zim mertelmperahlr gehalten wird. Das Reaktionsgemisch wird hierauf auf ungefähr 1 Va Liter mit Ather ver dünnt, dekantiert und das verbleibende harzige Produkt mit trockenem Äther gewaschen, wonach Kri stallisation einsetzt. Der Äther wird abdekantiert und das Produkt mit 200 ml Aceton überschichtet, wobei die Kristallisation sich vervollständigt.
Das kristalline S- (DL-2-Phenylglycyl)-thiopheno, l-hydrochlo, rid wird abfiltriert, mit Aceton und Äther gewaschen, im Vakuum m über Phosphorpentoxyd getrocknet und wiegt dann 19, 2 g. Smp. = 212 bis 214"C (unter Zersetzung).
Elementaranalyse : berechnet für CHCINOS :
C = 60, 01 /o, H = 5, 05 /o gefunden : C = 58, 71 %, H = 5, 73 /o.
Beispiel 2 Herstellung von S- (DL-a-Aminophenylacetyl)- thioessigsäure-hydrochlorid
Zu einer Suspension von 10 g = 0, 066 Mol DL2-Phenylglycin in 250 ml Dichlormethan werden unter Eiskühlung 1 ml Dimethylformamid und 20 g = 0, 096 Mol Phosphorpentachlorid hinzugefügt. Die Suspension wird auf dem Eisbad 20 Minuten lang und hernach 35 Minuten lang bei Zimmertemperatur gerührt, Die entstandene weisse Fällung wird rasch abfiltriert und 2 mal mit Dichlormethan und hernach mit trockenem Ather gewaschen, worauf sie 2 Stunden lang iiber Phosphorpentoxyd im Vakuum getrocknet wird.
Die 6 g = 0, 029 Mol wiegende trokkene Fällung wird zu 5, 5 g = 0, 06 Mol Mercapto- essigsäure und 30ml trockenem Dimethylformamid hinzugegeben, wobei das Reaktionsgemenge gekühlt wird. Das Gemisch wird eine Stundelang bei Zim mertemperatur gehalten und hiernach bis zur be ginnenden Ausfällung mit trockenem Ather verdünnt, worauf es 3 Tage lang bei 50 C belassen wird. Das weisse kristalline S-(DL-α-Aminophenylacetyl)-thio- essigsäure-hydrochlorid wird hiernach abfiltriert, im Vakuum über Phosphorpe. ntoxyd getrocknet und wiegt 0, 5 g. Smp. = 170 bis 185 C.
Zersetzung bei 2100 C.
Elementaranalyse : berechnet für C10H12ClNO3S :
C = 46,0 5, H = 4,65%, S = 1,23 % gefunden : C = 48, 72 %, H = 6, 72 /o, S = 1, 26 /o.
Beispiel 3 Herstellung von c-Aminobenzylpenicillin
Ein Reaktionsgemisch, bestehend aus 25 mg S (DL-2-Phenylglycyl)-thiophenol-hydrochlorid und 25 mg 6-Aminopenicillansäure in 2, 5 ml Wasser und 2, 5 ml einer 0, 2 molaren Natriumsuccinat-Bernstein- säure-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 5, 5 (das Reaktionsgemisch hat einen pH-Wert von 5, 3), wird bei 370 C während 6 Stunden kräftig geschüttelt.
Nach 3 Stunden wird 1 ml des Gemisches, welches inzwischen einen pH-Wert von 5, 0 erreicht hat, abgezogen und nach 6 Stunden ein weiterer ml. Nach dieser Zeit hatte das Reaktionsgemisch einen pH Wert von 4, 8 erreicht. Jede dieser Proben wird unmittelbar nach ihrer Entnahme mit einer Dikaliumphosphat-Pufferlösung (0, 1 Mol, pH = 6, 2) verdünnt, wobei Proben von 500-facher und 3000- facher Verdünnung für den Biotest hergestellt wer- den. Unmittelbar nach ihrer Verdünnung werden diese Proben gekühlt, um weitere Reaktion anzu- halten.
Die beiden Proben werden hiemach getestet gegen Staph. aureus zur Bestimmung ihrer Konzentration an α-Aminopenicillansäure. Aus dem Test ergibt sich, dass jedes der nach 3 Stunden gezogenen Muster ungefähr 625 mcg/ml a-Aminobenzylpeni- cillin und jedes der nach 6 Stunden Reaktionsdauer gezogenen Muster 675 mcg/ml a-Aminobenzylpeni- cillin enthält.
Die vorgeschriebene Arbeitsweise wurde wiederholt mit einem Reaktionsgemisch, welches dieselben Mengen an Thiophenolestor und 6-Aminopenicillan- säure in 0, 5 ml des gleichen Puffers, zusammen mit 2, 5 ml Wasser und 2 ml mit Harnstoff gesättigtem Wasser enthielt, wobei der Harnstoff dazu diente, die Löslichkeit des Esters zu erhöhen. Mit der vorstehend erwähnten Testmethode ergab sich, dass das Reaktionsgemisch nach 3 Stunden bei einem pH-Wert von 4, 5 525 mcg/ml a-AminobenzylpenicilIm enthielt, während es nach 6 Stunden Reaktionsdauer, wonach der pH-Wert auf 4, 1 gefallen war, keine messbare Menge an Penicillin mehr enthielt.
Beispiel 4
Herstellung von a-Aminobenzylpenicillin
Ein Reaktionsgemisch, enthaltend 10 ml S- (DL-a- Aminophenylacetyl)-thioessigsäure-hydrochlorid und
10 ml 6-Aminopenicillansäure in 1, 0 ml Wasser und
1, 0 ml einer 0, 4 molaren Natriumcitrat-Zitronen- säure-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 5, 5 (das Reaktionsgemisch hatte ursprünglich einen pH-Wert von 6, 05), wird kräftig 6 1/4 Stunden lang bei 370 C geschüttelt, Nach 3 1/4 Stunden Reaktionsdauer wird dem Gemisch eine Probe von 1 ml entnommen, wobei nach dieser Zeit der pH-Wert von 5, 6 erreicht wurde.
Nach 6 1/4 Stunden Reaktionsdauer wird ein weiteres Mus, ter von 1 ml aus dem Reaktionsgemenge entno, mmen und der pH-Wert zu dieser Zeit bei 5, 7 befunden. Jede der entnommenen Proben wird unmittelbar nach ihrer Entnahme mit einer Dikalium- phosphat-Pufferlösung (0, 1 Mol, pH= 6, 2) 500und 3000-fach verdünnt, wonach diese für den Biotest vorbereiteten Proben unmittelbar abgekühlt werden, um weitere Reaktion zu unterbinden. Jede der Proben wird hiernach gegen Staph. aureus getestet, um ihren Gehalt an α-Aminopenicillansäure zu bestimmen.
Die (unkorrigierten) Testresultate zeigen, dass nach 3 1/4 Stunden die Proben 650 mcg/ml a-Amino- benzylpenicillin und nach 6 //4 Stunden 700 mcg/ml DL-α-Aminobenzylpenicillin enthalten. Die korrigierten Werte der Penicillinkonzentration betragen ungefähr die Hälfte der unkorrigierten Werte.
Die Ausbeuten an DL-a-Aminobenzylpenicillin sind am grössten, wenn ein Natriumcitrat-Zitronen- säure-Puffer mit einem pH-Wert im Bereich von 5, 5 bis 6, 0 verwendet wird. Es ergab sich, dass die Aus beuten nicht gesteigert werden konnten, indem die verhältnismässigen Anteile an Thiophenolester oder an 6-Aminopenicillansäure erhöht, oder die Reaktionsdauer über 4¸ Stunden lang hinaus verlängert wurde.
Der Natriumcitrat-Zitronensäure-Puffer ist dem Phosphat-oder Succinat-Puffer überlegen, wobei die besten Resultate mit dem Citrat-Puffer unter Verwendung von 0, 1-0, 2 molaren Lösungen erhalten werden. Versuche, die bei 280, 370 und 450 C durchgeführt wurden, ergaben dass die Temperatur nur geringen Einfluss auf die Ausbeute hat. Weiterhin orwies sich, dass die Ausbeuten offensichtlich nach einer Reaktionsdauer von etwa 1 Stunde anzusteigen beginnen.
Das am besten geeignete Lösungsmittelsystem, mit welchem sich die höchsten Ausbeuten an a- Aminobenzylpenicilli erzielen lassen, ist eine 50"/oige wässrige Lösung von Essigsäure.
Beispiel 5
Herstellung von DL-α-Aminobenzylpenicillin
Es werden 4 Reaktionsmischungen (die unten verzeichneten Präparationen Nr. 1-4) hergestellt jede enthaltend 30 mg 6-Aminopenicillansäure, 30 mg S (DL-2-Phenylglycyl)-thiophenol-hydrochlorid und 3 ml 0, 2-molare wässrige Essigsäure, wobei die pH Werte dieser Präparationemnit 10 a/oiger Salzsäure auf 2, 2 eingestellt werden. In gleicher Weise wird eine fünfte Reaktionsmischung (die unten angegebene Präparation Nr. 5) hergestellt, bei welcher jedoch der Thiooster weggelassen ist. Jedes Reaktionsgemisch wird mit ungefähr 5-7 ml Diäthyläther überschichtet und kräftig während der in der unten stehenden Tabelle I angegebenen Zeitdauern geschüttelt.
Nach den in der Tabelle I angegebenen Zeiten wird eine Probe von je 1 ml aus jeder Reaktionsmischung abgezogen, der Ather daraus entfernt und verworfen und festes Natriumbikarbonat zur Probe hinzugegeben. Jede Probe wird unmittelbar nach ihrer Entnahme mit einer Dikaliumphosphat-Pufferlösung (0, 1-molare ; pH 6, 2) verdünnt derart, dass Proben 10-fachor und 100-facher Vordünnung für don Biotost orhalten werden. Unmittelbar nach ihrer Verdünnung werden diese Proben abgekühlt um weitere Reaktion zu verhindern. In jeder der Proben wird hierauf die Konzentration an DL-a-Aminobenzylpenicillin vermittels eines Biotestes gegen B. subtils nach der Scheiben-Methode bestimmt und die dabei erhaltenen Resultate in der Tabelle I unten angegeben.
Tabelle I
Konzentration ABP in mcg/ml Präpar. ation Nr. Reaktionszeit gemäss Biotest
1 15 Min. 1340
2 30 Min. 1550
3 60 Min. 2050
4 120 Min. 780
5 120 Min. 115
Der Test der Präparation Nr. 5 zeigt Bioaktivität, welche jedoch nicht umgesetzter 6-Aminopenicillan- säure in der Probe zuzuschreiben ist. Die Ergebnisse dieser Versuchsserie zeigen, dass die Ausbeuten bis zu 60 Minuten Reaktionsdauer ansteigen und hernach scharf abfallen. Die bei 60 Minuten Reaktionsdauer erhaltene Ausbeute ist äquivalent ungefähr 20 % des theoretischen Wertes.
Beispiel 6
In der nachfolgend beschriebenen Versuchsserie enthält jede Präparation 30 ml 6-Aminopenicillan- säure S- (DL-2-Phenylglycyl)-thiophenol-hydrochlorid gemäss den unten verzeichneten Angaban als Gesamtmenge und Konzentration pro ml, forner ein Lösungsmittel, all dies wie es in der untenstehenden Tabelle II angegeben ist. Folgendes sind die verwendeten Lösungsmittel : Lösungsmittel A ist eine 0, 2-molare wässrige Essigsäure, deren pH-Wert mit 10%iger Salzsäure auf 2, 2 eingestellt wurde, Lösungsmittel B ist 90%ige Essigsäure, Lösungsmittel C ist 75"/oige Essigsäure und Lösungsmittel D 50 /oige Essigsäure.
Jede Präparation wird bei 370 C kräftig während einer Stunde geschüttelt, wobei während der Reaktionsperiode nach Ablauf von 15, 30 und 60 Minuten je eine Probe von 1 ml aus jeder Präparation entnommen wird. Jede dieser Proben wird unmittelbar nach ihrer Entnahme mit einer Dikaliumphosphat-Pufferlösung (0, 1-molar ; pH 6, 2) auf das 10-und 100-fache ihres Volumes verdünnt, wonach diese für die Bioteste bestimmten Lösungen unmittelbar nach ihrer Verdünnung abgekühlt werden um weitere Reaktion zu verhindern.
Die Konzen tration dieser Proben an α-Aminobenzylpenicillin wird hernach durch einen Biatest gegenüber B. subtilis nach der Scheiben-Methode bei 280 C bestimmt.
Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in der unten stehanden Tabelle II verzeichnet.
Tabelle 11 Präparations Thiophenol Lösungsmittel Konzentration in mcg ABP/ml
Nr. (mg) (mg/ml) (15 Min.) (30 Min.) (60 Min.)
1 6 2 A 235 165 175
2 35 11. 7 A 280 235 325
3 95 31. 7 A 550 600 525
4 0 0 A 45 52. 5 32. 5
5 6 2 A 97. 5 97. 5 87. 5
6 35 11. 7 A 380 235 200
7 95 31. 7 A 490 150 435
8 0 0 A 120 20 20
9 6 2 B 430 40 340
10 35 11. 7 B 200 100 200
11 95 31. 7 B 290 560 480
12 0 0 B 500 255 325
13 6 2 C 470 235 290
14 35 11.7 C 200 360 200
15 95 31.7 C 550 650 280
16 0 0 C 320 245 330
17 6 2 D 275 410 325
18 35 11.7 D 1250 800 480 19 95 31.
7 D 1800 1630 1100
20 0 0 D 230 215 150
Beispiel 7
In den nachstehend beschriebenen Versuchen enthält jede Präparation 30 mg 6-Aminopenicillan- säure S-(DL-2-Phenylglycyl)-thiophenol-hydrochlorid in Gesamtmengen und Konzentrationenundferner ein Lösungsmittel, wie dies in der unten stehenden Tabelle 3 angegeben ist Die Lösungsmittel sind die folgenden : Lösungsmittel A ist 0, 2 molare wässrige Essigsäure deren pH-Wert mit 10%iger Salzsäure auf 2, 2 eingesteNt ist, Lösungsmitteil B ist 50"/oigne Essigsäure, Lösungsmittel F und G sind wässrige Lösungen, welche 5, 10 und 25"/o Essigsäure enthalten.
Jede dieser Präparationen wird bei Oo C 60 Min. lang kraftig geschüttelt, wobei aus jeder Versuchspräparation während der Reaktionsperiode nach Reaktkmsdauem von 15, 30 und 60 Min. Proben n von je 1 ml abgezapft werden. Nach dieser ersten Reaktionsperiode von insgesamt 60 Min. bei 00 C werden alle diese Präparationon weiter währond einer zusätzlichen Reaktionszeit von 15 Min. bei 37O C geschüttelt, wobei nach dieser Zeit je eine weitere Probe aus den Präparationen entnommen wird (75 Min.-Proben).
Jede dieser oben erwähnten Proben von 1 ml wird unmittelbar nach ihrer Entnahme auf 10 ml mit einer gesättigton Lösung von Natriumbikarbonat verdünnt. Ein Anteil von 1 ml dieser auf das 10fache mit Natriumbikarbonat-Lösung verdünnten Proben wird hiernach auf das 10-fache mit einer Dikaliumphosphat-Pufferlysung (0, 1 molar ;
pH 6, 0) vordünnt. Bei den Präparationen 21 bis 24 wird ein Anteil von einem ml der 100-fachen Verdünnung erneut mit der Pufferlösung verdünnt derart, dass Proben mit 1000-facher Verdünnung entstehen, wonach die Konzentration an a-Aminobenzylpenicillin dieser Probon bestimmt wird. Die derart aus den Präparationen hergestellten Proben (1 von 10-facher Verdünnung und 1 von 100-facher Verdünnung für jede der genannten Reaktionsintervalle) werden hiernach gegen B.
subtilis vermittels der Scheiben- Methode getestet, wobei die in der unten stehendon Tabelle III angegebenen Konzentrationen an a- Aminobenzylpenicillin gefunden werden. Aus den Versuchsergebnissen ist ersichtlich, dass unter den angewandten Versuchsbedingungen die höchsten Aus beutenana-AminobenzylpenicilIin unter Verwen- dung einer 50 /0igen wässrigen Lösung von Essigsäure als Lösungsmittel erhalten werden.
Tabelle III Präparation Thiophenol Lösungsmittel Konzentration in mcg ABP/ml
Nr. (mg) (mg/ml) 15 Min. 30 Min. 60 Min. 75 Min.
1 0 0 A 26 25 10-20 20
2 30 10 A 290 223 200 275
3 60 20 A 312 275 290 650
4 120 40 A 390 550 400 660
5 0 0 E 20. 0 36. 0 10-20 20
6 30 10 E 700 320 485 380
7 60 20 E 425 455 550 800
8 120 40 E 675 900 800 1200
9 0 0 F 10.0 10.0 20.0 20
10 30 10 F 750 1200 600 650
11 60 20 F 975 625 950 1400
12 120 40 F 305 900 1850 1450
13 0 0 G 10-20 10-20 15 20
14 30 10 G 1100 1400 1450 1800
15 60 20 G 1800 1680 1500 2100
16 120 40 G 1900 1950 1750 3050
17 0 0 D 335 57. 5 10-20 47. 5 18 30 10 D 4300 3500-5000 1300 1250 19 60 20 D) 5000) 5000 # 5000 # 5000 20 120 40 D) 5000) 5000 5000) # 5000
21 0 0 D 34 28 52.
5 75
22 30 10 D 5250 3900 5500 3400
23 60 20 D 7500 4600 10000 4650
24 120 40 D 8000 8000 10500 8250