Verfahren zur Herstellung von Thallium- bzw. Organothalliumsalzen von N-Carboxy- bzw. N-Thiocarboxypeptiden
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein neues Verfahren zur gesteuerten stufenweisen Herstellung von Thallium- bzw. Organothalliumsalzen von N-Carboxy- bzw. N-Thiocarboxypeptiden, bei dem ein N-Carboxy-a-aminosäureanhydrid, oder ein N-Thiocarboxya-aminosäureanhydrid in einem wässrigen Milieu mit einer Aminosäure, einem Peptid oder einem funktionellen Derivat davon in Gegenwart eines Thallium-I-Ions oder eines Organothallium-III-Ions umgesetzt wird.
Die Peptide bzw. Polypeptide sind eine grosse Klasse von chemischen Verbindungen, welche Dipeptide, Tripeptide, Tetrapeptide und höhere Peptide umfasst, bei denen Aminosäuren durch Amid-Bindungen (Peptid-Bindungen) miteinander verbunden sind. Die gesteuerte stufenweise Synthese von Polypeptiden und insbesondere von Heteropeptiden ist ein Problem, das die Fachleute seit langem beschäftigt. Solche Produkte sind als Zwischenprodukte zur Synthese von Proteinen nützlich; gewisse sind therapeutisch wirksam; sie sind ebenfalls bei der Untersuchung und der Analyse von Proteinen nützlich, insbesondere bei Untersuchungen, die dazu dienen, die Wirkungsweise von Enzymen, Hormonen und andern Proteinen mit wichtigen Funktionen im Organismus zu erforschen.
In der vorliegenden Beschreibung und in den Ansprüchen wird der Ausdruck Peptid aus Gründen der Zweckmässigkeit im allgemein Sinn verwendet, so dass er nicht nur Dipeptide sondern auch Polypeptide und Proteine mit einem mittleren und hohen Molekulargewicht einschliesslich Tripeptide, Tetrapeptide und dergleichen umfasst. Zu den bei der vorliegenden Erfindung nützlichen Aminosäuren gehören sowohl natürliche als auch synthetische Aminosäuren in der Dextro- und Levo-Form und Gemische solcher Formen, einschliesslich razemischer Gemische. Der Ausdruck Derivate umfasst Aminosäuren, Peptide und deren N-Carboxy- und N-Thiocarboxy-Analoga, bei denen verschiedene funktionelle Gruppen durch eine leicht entfernbare Gruppe, wie z.
B. die im-Benzyl-Gruppe, die Trialkylsilylgruppe, die Carbobenzoxygruppe, die tert-Butyloxycarbonyigruppe und dergleichen, blockiert werden.
Der Ausdruck Derivate umfasst auch Amide, Ester und andere funktionelle Modifikationen der Carboxylgruppe der Aminosäure oder des Peptids sowie Homologa und Analoga natürlicher Aminosäuren, bei denen ein oder mehrere Wasserstoffatome z. B. durch eine Niederalkylgruppe, wie z.B. a-Methylleucin oder a Fluorglycin, substituiert sind.
Es wurde kürzlich gefunden, dass Peptide und deren Derivate so erzeugt werden können, indem als Ausgangsmaterial eine Aminoverbindung aus der aus Aminosäuren, Peptiden und Derivaten davon, die eine freie Aminogruppe enthalten, gebildeten Gruppe in einem wässrigen Milieu unter solchen gesteuerten Bedingungen, dass die einzige Aminogruppe, die im Verlauf der Umsetzung in reaktionsfähiger Form und beträchtlicher Konzentration vorliegt, die Aminogruppe des Aminosäurepeptides oder Derivats davon ist, die sich zur Bildung des gewünschten Produkts umsetzen soll, mit einem N-Carboxyaminosäureanhydrid, einem N-Thiocarboxyaminosäureanhydrid oder einem Derivat dieser Anhydrid-Reagenzien umgesetzt wird.
Unter sorgfältig gesteuerten pH-, Temperatur-, Vermischungsgeschwindigkeits- und Reagenzienkonzentrationsbedingungen geht die Umsetzung des Anhydrids, Thioanhydrids oder Derivats davon mit der Aminosäure, dem Peptid oder dem Derivat davon unter minimaler Bildung von Nebenprodukten vor sich.
Am Ende der Reaktionsperiode wird die Peptidcarbamat- oder Peptidthiocarbamat-Zwischenverbindung durch die Beigabe von Säure zur Bildung des gewünschten Peptids unter Entwicklung von Kohlendioxyd oder Carbonylsulfid zersetzt. Normalerweise wird dies durch die Beigabe von genügend Säure zur Herabsetzung des pH-Wertes auf etwa 3-5 erzielt. Es können verschiedene Säuren verwendet werden. Bevorzugt werden Mineralsäuren, wie z. B. Schwefelsäure oder Salzsäure, doch können auch organische Säuren und insbesondere star ke.organische Säuren, wie z. B. Sulfosäuren, verwendet werden.
Die Umsetzung eines N-Carboxyaminosäureanhydrids oder eines Derivats davon mit einer Aminosäure, einem Peptid oder einem Derivat davon wird normalerweise in einem wässrigen Milieu, das ein organisches Lösungsmittel, vorzugsweise ein mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel, enthalten kann, um die Löslichkeit der Reagenzien zu erhöhen, durchgeführt. Die Umsetzung wird bei einer Temperatur von etwa 0 bis etwa 100 C bei einem pH von etwa 4 bis etwa 11 und vorzugsweise 9 bis 11 in einem Zeitraum von etwa 5 Minuten ausgeführt. Die Reagenzien werden durch Rühren oder eine andere Bewegungsform innig vermischt. Normalerweise wird ein Überschuss an Anhydrid verwendet.
Die Umsetzung eines N-Thiocarboxyaminosäureanhydrids oder eines Derivats davon mit einer Aminosäure, einem Peptid oder einem Derivat davon wird vorzugsweise in einem wässrigen Milieu, das zur Erhöhung der Löslichkeit der Reagenzien ein organisches Lösungsmittel und vorzugsweise ein mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel enthalten kann, durchgeführt.
Die Umsetzung wird bei einer Temperatur von etwa 0 bis etwa 600 C und einem pH von etwa 4 bis 10 und vorzugsweise 7,5 bis 10 in einem Zeitraum von etwa einer halben Stunde bis etwa 4 Stunden oder auch beträchtlich weniger ausgeführt. Wie bei der obigen Methode werden die Reagenzien durch Rühren oder eine andere Bewegungsform innig miteinander vermischt.
Auch wird es vorgezogen, überschüssiges Anhydrid zu verwenden.
Aus Gründen der Zweckmässigkeit wird die N-Carboxyanhydrid-Methode nachstehend als das NCA-Verfahren und die N-Thiocarboxyanhydrid-Methode als das TCA-Verfahren bezeichnet.
Sowohl das NCA- als auch das TCA-Verfahren sind bei der gesteuerten stufenweisen Synthese von Peptiden, einschliesslich Polypeptide und Proteine mit einem hohen Molekulargewicht, in einem wässrigen Milieu ohne Isolierung von Zwischenprodukten nützlich. Es wurde jedoch festgestellt, dass bei der Herstellung von ein niedriges Molekulargewicht aufweisenden Peptiden und insbesondere Di-, Tri- und Tetrapeptiden die Gefahr einer Ueberreaktion besteht, was zur Anhäufung unerwünschter Nebenprodukte im Reaktionsmilieu führt.
Dies rührt von einer Umsetzung von umgesetztem Carboxy- oder Thiocarboxyanhydrid mit dem sich bildenden Peptidcarbamat oder Peptidthiocarbamat her.
So kann z. B. eine Umsetzung zur Herstellung eines Dipeptids zur Bildung wahrnehmbarer Mengen von Tripeptid infolge der Umsetzung einer Carbamat- oder Thiocarbamat-Zwischenverbindung mit dem Anhydrid Reagens führen.
Bei der Herstellung von Peptiden mit einem hohen Molekulargewicht, z. B. von solchen, welche 7 oder mehr Aminosäuresegmente aufweisen, ist es oft wünschenswert. das von angehäuften Nebenprodukten im wesentlichen freie Peptid zu isolieren. Das isolierte Peptid kann dann zur Fortsetzung der Polypeptidsynthese in einem nicht kontaminierten Reaktionsgemisch in einem frischen wässrigen Milieu verwendet werden.
Gemäss der vorliegenden Erfindung wurde nun gefunden, dass diese beiden Ziele erreicht werden können, indem die Kupplungsumsetzung zwischen dem Anhydridreagenz oder einem Derivat davon und der Aminosäure, dem Peptid oder dem Derivat davon, das als Ausgangsverbindung verwendet wird, unter den oben beschriebenen Bedingungen durchgeführt wird, indem jedoch als Verbesserung dem Reaktionsmilieu eine genügend hohe Konzentration an Thallium-I-Ion oder Organothallium-III-Ion zur Bildung eines unlöslichen Salzes mit dem Peptidcarbamat oder Peptidthiocarbamat einverleibt wird. Die Quelle dieser Ionen kann bei der Umsetzung vorhanden sein oder dann beigefügt werden, wenn die Umsetzung im wesentlichen zu Ende ist.
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung von Thallium- bzw. Organothalliumsalzen von N-Carboxy- bzw. N-Thiocarboxyaminoverbindungen ist nun dadurch gekennzeichnet, dass ein N-Carboxy-a-aminosäureanhydrid oder N-Thiocarboxy-a-aminosäureanhydrid in einem wässrigen Milieu, in welchem die erwähnten Salze unlöslich sind, in Gegenwart eines Thallium I-Salzes bzw. einer Organothallium-III-Verbindung, die zwei organische Reste mit je bis zu 10 Kohlenstoffatomen aufweist, mit einer Aminoausgangsverbindung, welche eine einzige freie Aminogruppe aufweist und welche aus einer Aminosäure, einem Peptid oder aus einem funktionellen Derivat dieser Verbindungen besteht, unter solchen gesteuerten Bedingungen umgesetzt wird, dass die freie Aminogruppe der genannten Aminoausgangsverbindung unter Bildung einer Peptidbindung mit dem Anhydrid reagiert, wobei gleichzeitig das genannte Thallium- bzw.
Organothalliumsalz gebildet wird, oder dass man zuerst die genannten Ausgangssubstanzen zu N-Carboxy- bzw. N-Thiocarboxy-aminoverbindungen reagieren lässt und dann das Thallium-I-Salz bzw. eine Organothallium-III-Verbindung zur Bildung des unlöslichen Thallium- bzw. Organothalliumsalzes zusetzt.
Bei der Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens muss zweckmässigerweise die Wahl der Quelle des Thallium-I-Ions oder das Organothallium-III-Ions besonders beachtet werden. Die Quelle sollte ein Salz sein, das im Reaktionsmilieu genügend löslich ist, um eine wirksame Kationenkonzentration zu erzeugen. Bei der Wahl werden in der Regel auch die jeweiligen Reaktionsteilnehmer und die gewünschte Methode zur Ausführung der Synthese berücksichtigt. Gewisse Thallium Salze, insbesondere diejenigen, die aus ein niedriges Molekulargewicht aufweisenden N-Carboxy- bzw.
N-Thiocarboxyaminoverbindungen gebildet werden, sind in wässrigen Milieus recht löslich. Darüberhinaus neigen Thallium-I-N-Carboxy- bzw. Thallium-I-Thiocarboxyaminoverbindungen zur Unbeständigkeit. So fällt das Thallium-I-Ion keine verhältnismässig grossen Mengen gewisser N-Carboxy- bzw. N-Thiocarboxyaminoverbindungen und selbst in den Fällen, wo sich verhältnismässig grosse Niederschlagsmengen bilden, bleibt eine beträchtliche Menge von gelösten Thallium I-N-Carboxy- bzw. Thallium-I-Thiocarboxyaminoverbindungen im Reaktionsmilieu zurück. Übrigens ist es häufig selbst in denjenigen Fällen, wo das im wesentlichen ganze Thallium-I-Salz gefällt wird, nicht zweckmässig, das Thallium-I-Ion als Ausfällmittel zu verwenden, da das gefällte Salz rasch verwendet werden sollte, um die Gefahr einer Zersetzung zu vermeiden.
Die als Ausfällmittel verwendeten Organothalliumionen, und zwar gleichgültig, ob sie während der Umsetzung oder dann, wenn die Umsetzung im wesentlichen zu Ende, eingesetzt werden, geben bessere Ergebnisse. Die Wahl wünschenswerter organischer Radikale kann jedoch ein Problem sein. Gewisse Organothalliumsalze, die als Quelle des Organothallium-III-Ions betrachtet werden könnten, würden sich nicht eignen, da sie im ursprünglichen Reaktionsmilieu im wesentlichen unlöslich sind und keine genügende Organothalliumionkonzentration erzeugen würden, um nützliche Mengen von Organothallium-N-Carboxy- bzw. Organothalliumthiocarboxyaminoverbindungen zu fällen. Deshalb sollte das als Ausfällmittel verwendete ursprüngliche Organothalliumsalz im Reaktionsmilieu recht löslich und das im Reaktionsmilieu gebildete Organothalliumion eines sein, dass die N-Carboxy- bzw.
Thiocarboxyaminoverbindung ausfällt.
Gewisse Organothalliumsausfällmittel können zur Fällung spezifischer N-Carboxy- bzw. Thiocarboxyaminozwischenverbindungen, jedoch nicht zur Fällung anderer N-Carboxy- bzw. Thiocarboxyaminozwischenverbindungen nützlich sein. So ist es z. B. möglich, dass ein zur Fällung eines ein hohes Molekulargewicht aufweisenden N-Carboxy- bzw. Thiocarboxyaminozwischenprodukt nützliches Organothalliumausfällungsmittel zur Fällung von Produkten mit niedrigem Molekulargewicht ungeeignet sind.
Die meisten Thallium-I-Salze sind in wässrigen Milieus löslich; die bemerkenswerte Ausnahme bilden die Halogen-, Brom- und Jodsalze. Infolgedessen kann in den Fällen, wo das Thallium-I-Ion bei der Bildung von Peptidcarboxy- bzw. Thiopeptidcarboxyaminosalzen nützlich ist, fast jede Quelle mit Ausnahme der obenerwähnten Halogensalze verwendet werden. Dies ist besonders zweckmässig, da sowohl beim NCA- als auch beim TCA-Verfahren die Wasserstoffionenkonzentration unter Verwendung von Puffern und häufig von Borat-, Carbonat- oder Phosphatpuffern innerhalb der gewünschten Grenzen gehalten wird. Da die aus dem beim Puffer verwendeten Anion gebildeten Thalliumsalze löslich sind, besteht keine Gefahr, dass die Umsetzung durch die Tällung von Thallium-I-Salzen der Pufferreagenzien beeinträchtigt wird.
Im allgemeinen weisen Organothalliumsalze die gleichen Löslichkeitsmerkmale wie die Thallium-I-Salze auf, doch wird die Löslichkeit durch die Gegenwart organischer Radikale am Salz beeinflusst. Wie bei den Thallium-I-Ionen sind die Organothalliumchloride, Organothalliumbromide und Organothalliumjodide unlöslich. Mit zunehmendem Molekulargewicht der organischen Radikale werden die Organothalliumsalze in zunehmendem Masse schwerer löslich. Im allgemeinen sind die bevorzugten Salze Sulfonate, z. B. Dimethylthalliumsulfonate. Besonders bevorzugt werden die von Methan- und Äthansulfonsäure hergeleiteten, da sie leicht erhältlich sind und sich aus ihnen eine weite Vielfalt von zur Fällung von Peptidcarbamaten und Peptidthiocarbamaten nützlichen Organothalliumverbindungen ohne weiteres erzeugen lässt.
Es werden Organothalliumverbindungen verwendet, bei denen die Organothallium-Gruppe aus einem Thalliumatom und zwei organischen Resten, die bis zu etwa 10 Kohlenstoffatomen enthalten, besteht. Zu diesen gehören z. B. Aryl, Alkyl, Cycloalkyl, Alkaryl, Aralkyl; andere zyklische Reste können entweder homocyclisch oder heterocyclisch sein. Reste, die beispielsweise erwähnt werden können, sind Methyl, Methyl, Propyl, Butyl, Phenyl, Tolyl, Naphthyl, Cyclohexyl, Furanyl, Pyridinyl, Chinolyl und Isochinolyl. Die Reste können durch der Reaktion gegen über inerte Substituenten, z. B. Halogenatome, Nitrogruppen, Dialkylaminogruppen, Phenoxygruppen und dergleichen, weiter substituiert sein.
Wie oben erwähnt, sind die zur Verwendung beim vorliegenden erfindungsgemässen Verfahren bevorzugten Organothallium-Salze die Sulfonate, und die von Methan- und Athansulfonsäuren werden besonders vorgezogen. Mono- und Dihydroxyphenylsulfonate und insbesondere Resorcinsulfonat und p-Hydroxyphenylsulfonat sind ebenfalls nutzvoll. a-Naphthylsulfonat und dessen Mono- und Dihydroxy-Derivate werden den entsprechenden ss-Naphthylsulfonaten vorgezogen, doch können je nach der Struktur der zu fällenden Peptidcarboxy- bzw. Peptidthiocarboxyaminoverbindung beide Klassen von Verbindungen vorteilhaft verwendet werden.
Die beim vorliegenden erfindungsgemässen Verfahren verwendeten neuartigen Organothalliumsulfonatsalze werden am zweckmässigsten nach folgendem Fliess Schema erzeugt:
EMI3.1
In diesen Gleichungen ist R ein organischer Rest der oben beschriebenen Klasse und R' der organische Rest einer Sulfosäure, wie z. B. Methyl, Äthyl, Monound Dihydroxyphenyl, a- oder ss-Naphthyl und Monound Dihydroxy-Derivate von a- und ss-Naphthyl. R' kann auch ein anderer bis zu 10 Kohlenstoffatomen aufweisender Alkyl- oder Aryl-Rest sein. X ist Chlor, Brom oder Jod und M ein ein in Wasser unlösliches Chlorid, Bromid oder Jodid bildendes Metall.
Das Fliess-Schema zeigt die Herstellung eines Diorganothallium-III-Halogenids durch Umsetzung eines Thallium-III-chlorids mit einem Grignard-Reagens. Zur Verwendung beim vorliegenden erfindungsgemässen Verfahren werden Dimethyl- und Dibutylth allium-III- Salze besonders bevorzugt, die ersteren, da sie aus wirtschaftlich erhältlichen Reagenzien leicht hergestellt werden können, die letzteren wegen ihrer breiten Anwendbarkeit hinsichtlich der Fällung einer Vielfalt von Peptidcarboxy- bzw. Peptidhiocarboxyamino-Salz-Zwi- schenverbindungen. Durch die Umsetzung des auf diese Weise gebildeten Diorganothallium-III-chlorids mit einem Salz der gewählten Sulfosäure, vorzugsweise mit dem Silbersalz, wird die gewünschte Verbindung erzielt.
Das zur Verwendung bei der Herstellung der bei der vorliegenden Erfindung verwendeten Organothallium Verbindungen bevorzugte Thalliumsalz ist Thallium III-chlorid, das nach den von Johnson und Walton in Inorg. Chem. 5, 49 (1966) beschriebenen Verfahren durch die Chlorierung von Thallium-I-chlorid in einem wasserfreien organischen Lösungsmittel, wie z. B. Acetonitril, erzeugt werden kann. Am Ende der Reaktionsperiode wird die Lösung bei etwa 25 C unter vermindertem Druck zur Trockene konzentriert. Das Acetonitril-Solvat vom Thallium-III-chlorid zersetzt sich bei fortgesetzter Anwendung von vermindertem Druck zur Bildung des gewünschten Produkts.
Thallium-III-chlorid ist in Lösungsmitteln der zur Grignard-Umsetzung verwendeten Klasse und insbesondere in Ather-Lösungsmitteln, wie z. B. Diäthyläther, Di-n-butyläther, Tetrahydrofuran, und Dioxan, leicht löslich. Die Grignard-Umsetzung wird im gewählten Lösungsmittel unter im wesentlichen wasserfreien Bedingungen normalerweise bei einer Temperatur von etwa 0 bis 400 C während einer Reaktionsperiode, die nicht wesentlich ist, sondern von der gewählten Temperatur und der Mengen der Reaktionsteilnehmer abhängt, ausgeführt.
Das bei der Grignard-Umsetzung erzeugte Organothallium-halogenid, gewöhnlich das Chlorid, wird isoliert (am zweckmässigsten, indem das Lösungsmittel bei vermindertem Druck entfernt wird) und bei Raumtemperatur, d. h. etwa 20 bis 350 C, mit dem gewählten Salz der Sulfosäure in einem wässrigen Milieu, vorzugsweise Wasser, behandelt. Das Metallhalogenid fällt aus und wird entfernt, was zweckmässig durch Filtrieren erfolgt. Das gewünschte Produkt kann rückgewonnen werden, indem das Lösungsmittel gewöhnlich unter vermindertem Druck entfernt wird. Es wird vorgezogen, obwohl dies nicht wesentlich ist, ein molares Aequivalent des Salzes der Sulfosäure zu verwenden, um eine möglichst vollständige Umsetzung zu erzielen, wobei das gewünschte Produkt doch nicht mit nicht umgesetztem Salz verunreinigt wird.
Zur Herstellung von Thalliumsaizen von Peptidcarboxy- bzw. Peptidthiocarboxy-a-aminoverbindungen werden die NCA- und TCA-Verfahren wie oben beschrieben ausgeführt, ausser dass das Thallium-I-Salz oder das Organothallium-III-Salz dem Reaktionsmilieu einverleibt wird. Die unlösliche Thallium- oder Organothallium-Peptidcaboxy- bzw. -thiocarboxy-a-aminoverbindung fällt bei seiner Bildung aus. Die als Ausfällmittel zu verwendende Menge löslichen Thalliumsalzes hängt im allgemeinen von der Anzahl der funktionellen Gruppen, die für die Umsetzung zur Verfügung stehen.
Z. B. ist bei der Herstellung der Thiocarboxy-a-aminoverbindung von Leucyl-arginin bei einem pH von etwa 9 die einzige funktionelle Gruppe, die für die Umsetzung mit Thallium zur Verfügung steht, die Carboxybzw. Thiocarboxy-a-amino-Gruppe, da die Guanidyl Gruppe des Arginins die Carboxylgruppe als Zwitterion neutralisiert. Andererseits sind bei der Bildung von Glycylalanylphenylalinin zwei Aequivalent Thallium erforderlich, da zur Umsetzung mit Thallium nicht nur die Thiocarbamyl-Gruppe oder Carbamylgruppe sondern auch die Carboxylgruppe des Phanylalinins zur Verfügung steht. Zur Herstellung von Glycylglutaminsäure sind drei Aequivalent Thallium erforderlich, um beide Carboxylgruppen der Glutaminsäure und die Carbamyloder Thiocarbamylgruppe zu neutralisieren.
Auf alle Fälle wird es im allgemeinen vorgezogen, einen molaren Überschuss am gewählten Thallium-Ausfällmittel zu verwenden, um eine möglichst vollständige Fällung zu bewirken. Im typischen Fall wird ein etwa 100/oiger molarer Überschuss, auf das theoretische Thallium-Bedürfnis bezogen, verwendet.
Die erfindungsgemäss erzeugten Thallium- bzw. Organothalliumsalze von N-Carboxy- bzw. N-Thiocarboxyaminoverbindungen können zur Herstellung entsprechender Peptide verwendet werden. Diese Herstellung ist dadurch gekennzeichnet, dass eines der erwähnten Salze entweder im ursprünglichen wässrigen Milieu mit einer Säure umgesetzt wird oder das Salz zuerst isoliert, in ein anderes flüssiges Milieu aufgenommen und dann mit einer Säure umgesetzt wird, wobei man das entsprechende Peptid und ein entsprechendes Thalliumsalz entweder beide in Lösung oder eines von beiden als Niederschlag erhält.
Diese erfindungsgemässe Verwendung kann auf folgende Weise näher erläutert werden.
Mit Thallium-I-acetat als Quelle des Thallium I-Ions bei derHerstellung eines Dipeptids in einem wässrigen Milieu nach dem erfindungsgemässen Verfahren fällt die Thalliumpeptidcarboxyaminoverbindung aus. Wird nun diese letztere Verbindung zur Herstellung des entsprechenden Peptids verwendet, so wird die ausgefällte Thalliumpeptidverbindung mit Essigsäure umgesetzt. Diese Verbindung zersetzt sich in das gewünschte Peptid und das Thallium-I-acetat. Dieses letztere ist in wässrigem Milieu löslich, so dass eine wirksame Konzentration an Thallium-I-Ion zur Umwandlung des erzeugten Dipeptids in ein Tripeptid durch die Umsetzung mitzusätzlichem N-Carboxyaminosäureanhydrid im Reaktionsgemisch verbleibt.
Wird die gleiche Umsetzung mit der Thalliumpeptidverbindung ausgeführt, ausser dass zur Zersetzung der pH mit Salzsäure eingestellt wird, so ist das sich bildende Thallium-I-Salz Thallium-I-chlorid, das im Reaktionsmilieu unlöslich ist. Daher wird sich das bei der Zersetzungsreaktion gebildete Dipeptid lösen und Thallium-I-chlorid ausfallen. Es kann durch Filtrieren rückgewonnen werden. Zur Umwandlung des Dipeptids in ein Tripeptid nach dem erfindungsgemässen Verfahren ist es dann nötig, dem Filtrat ein wasserlösliches Thallium-I-Salz beizufügen. Ähnliche Verfahren können mit andern Organothallium-Reagenzien befolgt werden.
Wie oben erwähnt, ist somit das erfindungsgemässe Verfahren zur Reinigung ein hohes Molekulargewicht aufweisender Peptide besonders nützlich. Z. B. konnte ein 10 Aminosäure-Reste aufweisendes Polypeptid durch eine Reihe von Umsetzungen erzeugt werden, wobei verschiedene N-Thiocarboxyaminosäureanhydride nacheinander in eine ursprüngliche Aminosäure in einer wässrigen Lösung gegeben und nacheinander ein Dipeptid, ein Tripeptid, ein Tetrapeptid und schliesslich ein Decapeptid gebildet wurden. Neun verschiedene Umsetzungen konnten ausgeführt werden, von denen jede die Beigabe von Säure oder Base erforderte, um die Wasserstoffionenkonzentration zur Kupplung oder Zersetzung einzustellen. Bei jeder Umsetzung besteht die Möglichkeit einer Überreaktion oder anderer Nebenreaktionen.
Es wird dann klar, dass eine unerwünscht hohe Konzentration an organischen und anorganischen Nebenprodukten sich im Verlauf der Umsetzungen im Reaktionsmilieu ansammeln könnte. Es wäre zweckmässig, das Decapeptid aus dem kontaminierten Milieu zu isolieren, bevor es zur Bildung eines Undecapeptids mit einem weiteren N-Carboxyaminosäureanhydrid umgesetzt wird.
Die gewünschte Isolierung lässt sich ohne weiteres im Einklang mit dem erfindungsgemässen Verfahren durchführen. Z. B. kann die letzte Kupplungsreaktion zur Bildung des Decapeptids in Gegenwart eines Organothalliumsulfonats, z. B. von Dibutylthalliumäthansulfonat, ausgeführt werden. In einer Alternative kann das Thalliumsalz beigefügt werden, wenn die Kupplungsreaktion im wesentlichen zu Ende ist. In beiden Fällen fällt das Thalliumsalz des Decapeptidcarbamats aus.
Das Salz kann dann in ein flüssiges Milieu, in welchem das Decapeptid unlöslich ist, aufgenommen werden.
Wird das Thalliumsalz des Decapeptidcarboxyamines zur Herstellung des Decapeptids verwendet und somit, wie oben angeführt mit einer Säure zersetzt, wobei ein im gewählten Milieu lösliches Thalliumsalz gebildet wird, so löst sich das Thalliumsalz, und Decapeptid, das sich nicht löst, kann durch Filtrieren isoliert werden.
Z. B. kann das Decapeptid in Isopropanol aufgenommen und mit Äthansulfonsäure zersetzt werden. Dibutylthalliumsulfonsäure ist in Isopropanol löslich und löst sich daher bei ihrer Bildung. Das Decapeptid löst sich nicht.
Folgende Beispiele dienen zur Veranschaulichung des erfindungsgemässen Verfahrens.
Beispiel 1
Dibutylthalliummethansulfonat
Insgesamt 4,65 g Dibutylthalliumchlorid werden in 50 ml eine kleine Menge Methanol enthaltendem Wasser suspendiert, und 2,67 g (durch Neutralisierung von Methansulfonsäure in wässriger Lösung mit Silberoxyd hergestelltes) Silbermethansulfonat werden unter Rühren beigefügt. Es wird weiter gerührt, während die Temperatur bei 60-700 C gehalten wird. Das Gemisch wird bei schwachem Licht bei dieser Temperatur gehalten, bis die Bildung und Fällung von Silberchlorid nicht mehr sichtbar ist. Die Suspension wird filtriert und der Niederschlag mit Wasser und mit Methanol gewaschen.
Das Filtrat und das zum Waschen verwendete Wasser und Methanol werden kombiniert und bei vermindertem Druck konzentriert, um die Kristallisation des gewünschten Produkts zu bewirken, das durch Filtrieren gesammelt wird.
Dieses Verfahren wird befolgt, um eine Vielfalt von Organothallium-III-alkansulfonaten herzustellen, einschliesslich spezifisch derjenigen, bei denen die Organo Reste bis zu 10 Kohlenstoffatomen aufweisen und der Alkan-Rest von Methansulfosäure, Äthansulfosäure, p-Hydroxyphenylsulfosäure, Resorcinsulfosäure, a- und ss-Naphthylsulfosäure, 4-Hydroxy-a-naphthylsulfosäure und 4-Hydroxy-ss-naphthylsulfosäure abgeleitet ist. Spezifische Organo-Reste in den erzeugten Verbindungen sind z. B. Methyl, Methyl, Propyl, Butyl, Phenyl, Tolyl, Naphthylcyclohexylfuranyl, Pyridinyl, Chinonyl, Isochinonyl, p-Chlorphenyl-4-phenoxytolyl und p-Nftronaph- thyl.
L-Valyl-L-Serin
1 Millimol L-Serin wird in 50 ml Wasser gelöst, und 2 Millimol Dibutylthalliummethansulfonat werden beigefügt. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur magnetisch gerührt und der pH mit 2,5 N Natriumhydroxyd auf 9,0 eingestellt. Ein Millimol pulverförmiges N-Thiocarboxyvalinanhydrid wird beigefügt, während der pH durch die Beigabe von 2,5 N Natriumhydroxyd aus einer Mikobürette in der Nähe von 9 gehalten wird. Man lässt die Umsetzung vor sich gehen, bis sich kein Niederschlag des Dibutylthallium-Salzes von L-Valyl-L-se rin-thiocarboxamino-Salz bildet (etwa 1 Stunde).
Verwendung der Peptidverbindung
Die wässrige Suspension des Dibutylthallium-Salzes von L-Valyl-L-serin-thiocarboxyamino wird mit Salzsäure angesäuert und mit Stickstoff gereinigt, um das Thiocarboxyamino-Salz zu zersetzen und das gewünschte Dipeptid zusammen mit Carbonylsulfid und Dibutylthalliumchlorid zu bilden. Dieses Salz fällt aus und wird durch Filtrieren entfernt. Das Peptid löst sich und wird chromatographisch zurückgewonnen.
Befolgt man dieses Verfahren mit Dimethylthalliumäthansulfonat, so erhält man das entsprechende Produkt.
Beispiel 2
L-Valyl-L-valyl-L-serin
Das Verfahren von Beispiel 1 wird wiederholt, ausser dass das Thalliumthiocarbamat mit Essigsäure zersetzt wird. In diesem Fall sind sowohl das Dipeptid als auch das sich bildende Dibutylthalliumacetat im Reaktionsmilieu löslich. Das Dipeptid wird im selben Milieu unter denselben Bedingungen mit einem zusätzlichen Millimol N-Thiocarboxy-L-valinahydrid umgesetzt. Das sich bildende Dibutylthallium-Salz des Thiocarboxyamins von L-Valyl-L-valyl-L-serin wird dann wie in Beispiel 1 beschrieben mit Salzsäure zersetzt, so dass Dibutylthalliumchlorid gefällt und L-Valyl-L-valyl-L-serin erzeugt wird. Das Chloridsalz wird durch Filtrieren entfernt und das Tripeptid chromatographisch rückgewonnen.
Befolgt man das Verfahren mit Dimethylthalliumäthansulfonat, so erhält man das entsprechende Produkt.
Beispiel 3
Leucyl-arginin
1 Millimol Arginin wird in 50 ml Wasser aufgenom men und magnetisch gerührt, während der pH mit 2,5 N Natriumhydroxyd auf 9,5 eingestellt wird. 1 Millimol N-Thiocarboxyleucin-anhydrid wird beigefügt und das Gemisch etwa 18 Minuten bei Raumtemperatur gerührt.
Dann wird ein Millimol Dibutylthalliummethansulfonat in einer konzentrierten wässrigen Lösung beigefügt, und es bildet sich ein reichlicher Niederschlag von Mo no-(Dibutylthallium)4eucylargininthiocarboxyamins.
Das gefällte Organothalliumthiocarboxyamins wird durch Filtrieren gesammelt, in Wasser aufgenommen und durch die tropfenweise Beigabe von genügender Bromwasserstoffsäure gemäss Verfahren von Beispiel 1, um den pH auf 3,0 herabzusetzen, zersetzt. Unlösliches Dibutylthalliumbromid bildet sich ziemlich langsam und fällt aus. Es wird durch Filtrieren rückgewonnen. Das Filtrat wird unter Verwendung von Stickstoff von Car bonylsulfid gereinigt und das gewünschte Produkt chromatographisch isoliert.
Unter Verwendung von Dibenzylthalliumäthansulfonat als Quelle des Organothallium-Rests wird das gleiche Produkt erzeugt.
Zur Herstellung von Glycylserin und Glycylarginin wird dasselbe Verfahren verwendet.
Beispiel 4
Glycylalanylphenylalanin
Insgesamt 0,47 g Alanylphenylalanin wird in 20 ml Wasser aufgenommen und der pH mit 2,5 N Natriumhydroxyd auf 9,5 eingestellt, während die Temperatur bei 3 C gehalten wird. In das Gemisch wird 0,206 g N-Thiocarboxyglycylanhydrid gegeben. Nach 10 Minuten werden 1,66 g Dibutylthalliummethansulfonat beigefügt. Ein schwerer Niederschlag von Di-(dibutylthallium) glycylalanylphenylalaninthiocarboxyamins bildet sich und wird durch Filtrieren gesammelt. Der Niederschlag wird in Wasser suspendiert und durch die Beigabe von Methansulfonsäure zersetzt. Die sich bildende Thalliummethansulfonsäure ist löslich. Sie wird durch die Beigabe von Natriumjodid als Dibutylthalliumjodid gefällt.
Das in Lösung verbleibende Tripeptid wird nach Entfernen des Jodid-Niederschlags durch Filtrieren chromatographisch gesammelt.
Beispiel 5
Alanylalanylphenylalanin
Insgesamt 0,472 g Alanyiphenylalanin werden unter magnetischem Rühren in eine kleine Menge Wasser aufgenommen. Die Temperatur wird durch äussere Kühlung und gelegentliche Beigabe von Eis bei etwa 3 C gehalten. Der pH wird mit 2,5 N Natriumhydroxyd auf 9,6 eingestellt, und 0,26 g N-Thiocarboxyalaninanhydrid werden beigefügt. Das Gemisch wird 10 Minuten gerührt, und 1,613 g Dibutylthalliummethansulfonat werden beigefügt, um eine rasche Fällung von Di-(dibutylthallium)alanylalanylph enylalaninthiocarboxyamins zu bewirken. Der Niederschlag wird durch Filtrieren gesammelt, in Wasser aufgenommen und durch die Beigabe von wässriger Bromwasserstoffsäure gemäss Verfahren vom Beispiel 1 zur Bildung des gewünschten Tripeptids zersetzt.
Das ausfallende Dibutylthalliumbromid wird durch Filtrieren entfernt und das gewünschte Tripeptid chromatographisch aus der Lösung rückgewonnen.
Beispiel 6
Die Verfahren der obigen Beispiele werden unter Verwendung von N-Carboxyaminosäureanhydrid anstelle des angegebenen N-Thiocarboxyaminosäureanhy- drids befolgt, wobei die gleichen Produkte erzielt werden. Die Reaktionsdauer der Kupplungsumsetzung wird in jedem Fall auf weniger als 1 Minute herabgesetzt, und die Temperatur der Kupplungsumsetzung beträgt etwa 10 C. Ein alkalischer pH wird unter Verwendung eines Natriumborat-Puffers anstelle von Natriumhydroxyd aufrechterhalten.
Beispiel 7 Phenylalanylphenylalanylarginin
Insgesamt 1 Millimol Phenylalanylarginin wird in eine kleine Menge Natriumborat-Pufferlösung bei pH 9,5 aufgenommen und 1 Millimol Thallium-I-acetat beigefügt. Die Lösung wird bei Raumtemperatur gehalten und 1 Millimol N-Thiocarboxyphenylalaninanhy drid beigefügt. Das Gemisch wird etwa 20 Minuten bei Raumtemperatur gerührt, während der pH durch die Beigabe von 2,5 N Natriumhydroxyd aus einer Mikrobürette bei etwa 9,5 gehalten wird. Am Ende dieser Periode wird das ausfallende Thallium-I-Salz des Thiocarboxyamins von Phenylalanylphenylalanylarginin durch die Beigabe von Salzsäure zersetzt, wie im Beispiel 1 beschrieben, während Stickstoff durch das Gemisch geperlt wird, um das Carbonylsulfid zu eliminieren.
Das gewünschte Tripeptid, das sich bei seiner Bildung löst, wird chromatographisch rückgewonnen.
Process for the preparation of thallium or organothallium salts of N-carboxy or N-thiocarboxypeptides
The present invention relates to a new process for the controlled stepwise production of thallium or organothallium salts of N-carboxy- or N-thiocarboxypeptides, in which an N-carboxy-α-amino acid anhydride or an N-thiocarboxy-amino acid anhydride in one aqueous medium is reacted with an amino acid, a peptide or a functional derivative thereof in the presence of a thallium I ion or an organothallium III ion.
The peptides or polypeptides are a large class of chemical compounds which include dipeptides, tripeptides, tetrapeptides and higher peptides in which amino acids are linked to one another by amide bonds (peptide bonds). The controlled, staged synthesis of polypeptides, and particularly heteropeptides, has long been a problem of concern to those skilled in the art. Such products are useful as intermediates in the synthesis of proteins; certain are therapeutically effective; they are also useful in the study and analysis of proteins, especially in studies that are used to study the mode of action of enzymes, hormones and other proteins with important functions in the organism.
In the present description and in the claims, the term peptide is used in the general sense for reasons of convenience, so that it includes not only dipeptides but also polypeptides and proteins with a medium and high molecular weight including tripeptides, tetrapeptides and the like. Amino acids useful in the present invention include both natural and synthetic amino acids in the dextro and levo forms and mixtures of such forms, including mixtures of racemics. The term derivatives encompasses amino acids, peptides and their N-carboxy and N-thiocarboxy analogs, in which different functional groups are replaced by an easily removable group, e.g.
B. the im-benzyl group, the trialkylsilyl group, the carbobenzoxy group, the tert-butyloxycarbonyigruppe and the like can be blocked.
The term derivatives also includes amides, esters and other functional modifications of the carboxyl group of the amino acid or of the peptide, as well as homologues and analogs of natural amino acids in which one or more hydrogen atoms e.g. By a lower alkyl group, e.g. a-methylleucine or a fluoroglycine, are substituted.
It has recently been found that peptides and their derivatives can be produced by using as starting material an amino compound from the group formed from amino acids, peptides and derivatives thereof which contain a free amino group in an aqueous medium under such controlled conditions that the only one Amino group, which in the course of the reaction is present in reactive form and in considerable concentration, is the amino group of the amino acid peptide or derivative thereof which is to react to form the desired product with an N-carboxy amino acid anhydride, an N-thiocarboxy amino acid anhydride or a derivative of this anhydride Reagents is implemented.
Under carefully controlled pH, temperature, mixing rate and reagent concentration conditions, the reaction of the anhydride, thioanhydride or derivative thereof with the amino acid, peptide or derivative thereof proceeds with minimal formation of by-products.
At the end of the reaction period, the peptide carbamate or peptide thiocarbamate intermediate is decomposed by the addition of acid to form the desired peptide with evolution of carbon dioxide or carbonyl sulfide. Usually this is achieved by adding enough acid to lower the pH to around 3-5. Various acids can be used. Mineral acids, such as. B. sulfuric acid or hydrochloric acid, but organic acids and especially star ke.organische acids, such as. B. sulfonic acids can be used.
The reaction of an N-carboxyamino acid anhydride or a derivative thereof with an amino acid, a peptide or a derivative thereof is normally carried out in an aqueous medium which can contain an organic solvent, preferably a water-miscible organic solvent, in order to increase the solubility of the reagents , carried out. The reaction is carried out at a temperature of about 0 to about 100 ° C. at a pH of about 4 to about 11 and preferably 9 to 11 for a period of about 5 minutes. The reagents are intimately mixed by stirring or some other form of agitation. An excess of anhydride is usually used.
The reaction of an N-thiocarboxyamino acid anhydride or a derivative thereof with an amino acid, a peptide or a derivative thereof is preferably carried out in an aqueous medium which can contain an organic solvent and preferably a water-miscible organic solvent to increase the solubility of the reagents.
The reaction is carried out at a temperature of about 0 to about 600 ° C. and a pH of about 4 to 10 and preferably 7.5 to 10 for a period of about half an hour to about 4 hours or even considerably less. As in the above method, the reagents are intimately mixed with one another by stirring or some other form of agitation.
It is also preferred to use excess anhydride.
For the sake of convenience, the N-carboxy anhydride method is hereinafter referred to as the NCA method and the N-thiocarboxy anhydride method is referred to as the TCA method.
Both the NCA and TCA methods are useful in the controlled, stepwise synthesis of peptides, including polypeptides and proteins of high molecular weight, in an aqueous medium without isolation of intermediates. However, it has been found that in the production of peptides having a low molecular weight, and in particular di-, tri- and tetrapeptides, there is a risk of overreaction, which leads to an accumulation of undesired by-products in the reaction medium.
This is due to a reaction of converted carboxy or thiocarboxy anhydride with the peptide carbamate or peptide thiocarbamate that is formed.
So z. B. a reaction to produce a dipeptide result in the formation of discernible amounts of tripeptide as a result of the reaction of a carbamate or thiocarbamate intermediate with the anhydride reagent.
In the production of high molecular weight peptides, e.g. Those having 7 or more amino acid segments, it is often desirable. isolate the peptide essentially free of accumulated by-products. The isolated peptide can then be used to continue the polypeptide synthesis in a non-contaminated reaction mixture in a fresh aqueous medium.
According to the present invention, it has now been found that these two objects can be achieved by carrying out the coupling reaction between the anhydride reagent or a derivative thereof and the amino acid, the peptide or the derivative thereof which is used as the starting compound, under the conditions described above However, as an improvement in the reaction medium, a sufficiently high concentration of thallium-I ion or organothallium-III ion is incorporated to form an insoluble salt with the peptide carbamate or peptide thiocarbamate. The source of these ions can be present during the reaction or added when the reaction is essentially over.
The process according to the invention for the preparation of thallium or organothallium salts of N-carboxy or N-thiocarboxyamino compounds is now characterized in that an N-carboxy-a-amino acid anhydride or N-thiocarboxy-a-amino acid anhydride in an aqueous medium in which the salts mentioned are insoluble in the presence of a thallium I salt or an organothallium III compound, which has two organic radicals each with up to 10 carbon atoms, with an amino starting compound which has a single free amino group and which is composed of an amino acid, a peptide or a functional derivative of these compounds, is reacted under such controlled conditions that the free amino group of said amino starting compound reacts with the anhydride to form a peptide bond, with said thallium or
Organothallium salt is formed, or that the starting substances mentioned are first allowed to react to form N-carboxy or N-thiocarboxy-amino compounds and then the thallium I salt or an organothallium III compound to form the insoluble thallium or organothallium salt clogs.
When carrying out the process according to the invention, the choice of the source of the thallium I ion or the organothallium III ion must expediently be given special consideration. The source should be a salt that is sufficiently soluble in the reaction medium to produce an effective concentration of cations. When making the choice, the particular reactants and the desired method for carrying out the synthesis are generally also taken into account. Certain thallium salts, especially those derived from low molecular weight N-carboxy or
N-thiocarboxyamino compounds are formed are quite soluble in aqueous media. In addition, thallium-I-N-carboxy or thallium-I-thiocarboxyamino compounds tend to be unstable. The thallium-I ion does not fall in relatively large amounts of certain N-carboxy or N-thiocarboxyamino compounds and even in cases where relatively large amounts of precipitate form, a considerable amount of dissolved thallium IN-carboxy or thallium remains. I-thiocarboxyamino compounds back in the reaction medium. Incidentally, even in those cases where essentially all of the thallium-I salt is precipitated, it is often not practical to use the thallium-I ion as a precipitating agent, since the precipitated salt should be used quickly to avoid the risk of decomposition to avoid.
The organothallium ions used as precipitating agents, regardless of whether they are used during the reaction or when the reaction has essentially ended, give better results. However, choosing desirable organic radicals can be a problem. Certain organothallium salts, which could be considered the source of the organothallium III ion, would not be suitable because they are essentially insoluble in the original reaction medium and would not produce a sufficient concentration of organothallium ions to generate useful amounts of organothallium N-carboxy or organothallium thiocarboxyamino compounds to fell. Therefore, the original organothallium salt used as a precipitating agent should be quite soluble in the reaction medium and the organothallium ion formed in the reaction medium should be one that the N-carboxy resp.
Thiocarboxyamino compound precipitates.
Certain organothallium precipitants may be useful for precipitating specific N-carboxy or thiocarboxyamino intermediates, but not for precipitating other N-carboxy or thiocarboxyamino intermediates. So it is e.g. For example, it is possible that an organothallium precipitating agent useful for precipitating a high molecular weight N-carboxy or thiocarboxyamino intermediate is unsuitable for the precipitation of low molecular weight products.
Most of the thallium I salts are soluble in aqueous media; the notable exceptions are the halogen, bromine and iodine salts. As a result, where the thallium I ion is useful in the formation of peptide carboxy or thiopeptide carboxy amino salts, almost any source can be used except for the halogen salts mentioned above. This is particularly expedient because, in both the NCA and the TCA processes, the hydrogen ion concentration is kept within the desired limits using buffers and frequently borate, carbonate or phosphate buffers. Since the thallium salts formed from the anion used in the buffer are soluble, there is no risk of the reaction being impaired by the precipitation of thallium I salts in the buffer reagents.
In general, organothallium salts have the same solubility characteristics as the thallium I salts, but the solubility is influenced by the presence of organic radicals on the salt. As with the thallium I ions, the organothallium chlorides, organothallium bromides and organothallium iodides are insoluble. As the molecular weight of the organic radicals increases, the organothallium salts become increasingly less soluble. In general, the preferred salts are sulfonates, e.g. B. dimethylthallium sulfonate. Those derived from methane and ethanesulphonic acid are particularly preferred because they are readily available and a wide variety of organothallium compounds useful for the precipitation of peptide carbamates and peptide thiocarbamates can readily be produced from them.
Organothallium compounds are used in which the organothallium group consists of a thallium atom and two organic radicals containing up to about 10 carbon atoms. These include B. aryl, alkyl, cycloalkyl, alkaryl, aralkyl; other cyclic radicals can be either homocyclic or heterocyclic. Residues which can be mentioned, for example, are methyl, methyl, propyl, butyl, phenyl, tolyl, naphthyl, cyclohexyl, furanyl, pyridinyl, quinolyl and isoquinolyl. The radicals can by the reaction against inert substituents, for. B. halogen atoms, nitro groups, dialkylamino groups, phenoxy groups and the like can be further substituted.
As noted above, the preferred organothallium salts for use in the present process of the invention are the sulfonates, and those of methane and ethane sulfonic acids are particularly preferred. Mono- and dihydroxyphenyl sulfonates, and particularly resorcinol sulfonate and p-hydroxyphenyl sulfonate, are also useful. α-Naphthyl sulfonate and its mono- and dihydroxy derivatives are preferred to the corresponding β-naphthyl sulfonates, but both classes of compounds can advantageously be used depending on the structure of the peptide carboxy or peptide thiocarboxyamino compound to be precipitated.
The novel organothallium sulfonate salts used in the present process according to the invention are most suitably produced according to the following flow scheme:
EMI3.1
In these equations, R is an organic radical of the class described above and R 'is the organic radical of a sulfonic acid such as e.g. B. methyl, ethyl, mono and dihydroxyphenyl, a- or ss-naphthyl and mono and dihydroxy derivatives of a- and ss-naphthyl. R 'can also be another alkyl or aryl radical having up to 10 carbon atoms. X is chlorine, bromine or iodine and M is a water-insoluble chloride, bromide or iodide-forming metal.
The flow diagram shows the preparation of a diorganothallium III halide by reacting a thallium III chloride with a Grignard reagent. For use in the present inventive method, dimethyl and dibutylth allium III salts are particularly preferred, the former because they can be easily prepared from commercially available reagents, the latter because of their broad applicability to the precipitation of a variety of peptide carboxy- and peptide thiocarboxyamino, respectively -Salt intermediate compounds. By reacting the diorganothallium III chloride formed in this way with a salt of the selected sulfonic acid, preferably with the silver salt, the desired compound is achieved.
The preferred thallium salt for use in preparing the organothallium compounds used in the present invention is thallium III chloride, which is derived from the methods described by Johnson and Walton in Inorg. Chem. 5, 49 (1966) described method by the chlorination of thallium-I-chloride in an anhydrous organic solvent, such as. B. acetonitrile can be generated. At the end of the reaction period, the solution is concentrated to dryness at about 25 C under reduced pressure. The acetonitrile solvate of thallium (III) chloride decomposes with continued application of reduced pressure to form the desired product.
Thallium-III-chloride is used in solvents of the class used for the Grignard reaction and especially in ether solvents, such as. B. diethyl ether, di-n-butyl ether, tetrahydrofuran, and dioxane, easily soluble. The Grignard reaction is carried out in the chosen solvent under essentially anhydrous conditions, normally at a temperature of about 0 to 400 ° C. for a reaction period which is not essential but depends on the chosen temperature and the amounts of the reactants.
The organothallium halide produced in the Grignard reaction, usually the chloride, is isolated (most conveniently by removing the solvent at reduced pressure) and at room temperature, i.e. at room temperature. H. about 20 to 350 C, treated with the selected salt of the sulfonic acid in an aqueous medium, preferably water. The metal halide precipitates and is removed, which is expediently done by filtration. The desired product can be recovered by removing the solvent, usually under reduced pressure. It is preferred, although not essential, to use a molar equivalent of the salt of the sulfonic acid in order to achieve as complete a reaction as possible while still not contaminating the desired product with unreacted salt.
To produce thallium salts of peptide carboxy or peptide thiocarboxy-a-amino compounds, the NCA and TCA processes are carried out as described above, except that the thallium I salt or the organothallium III salt is incorporated into the reaction medium. The insoluble thallium or organothallium peptide caboxy or thiocarboxy-a-amino compound precipitates during its formation. The amount of soluble thallium salt to be used as a precipitating agent generally depends on the number of functional groups which are available for the reaction.
For example, in the preparation of the thiocarboxy-a-amino compound of leucyl-arginine at a pH of about 9, the only functional group available for reaction with thallium is the carboxy-amino compound. Thiocarboxy-a-amino group, as the guanidyl group of arginine neutralizes the carboxyl group as a zwitterion. On the other hand, two equivalents of thallium are required for the formation of glycylalanylphenylalinine, since not only the thiocarbamyl group or carbamyl group but also the carboxyl group of the phanylalinine are available for reaction with thallium. To produce glycylglutamic acid, three equivalents of thallium are required to neutralize both carboxyl groups of glutamic acid and the carbamyl or thiocarbamyl group.
In any event, it is generally preferred to use a molar excess of the selected thallium precipitating agent in order to effect the most complete possible precipitation. Typically about a 100% molar excess based on the theoretical thallium requirement is used.
The thallium or organothallium salts of N-carboxy or N-thiocarboxyamino compounds produced according to the invention can be used to produce corresponding peptides. This preparation is characterized in that one of the salts mentioned is either reacted with an acid in the original aqueous medium or the salt is first isolated, taken up in another liquid medium and then reacted with an acid, the corresponding peptide and a corresponding thallium salt either both in solution or either as a precipitate.
This use according to the invention can be explained in more detail in the following way.
With thallium I acetate as the source of the thallium I ion in the preparation of a dipeptide in an aqueous medium by the process according to the invention, the thallium peptide carboxyamino compound precipitates. If this latter compound is now used to produce the corresponding peptide, the precipitated thallium peptide compound is reacted with acetic acid. This compound breaks down into the desired peptide and thallium I acetate. This latter is soluble in an aqueous medium, so that an effective concentration of thallium-I ion remains in the reaction mixture for converting the dipeptide produced into a tripeptide through the reaction with additional N-carboxyamino acid anhydride.
If the same reaction is carried out with the thallium peptide compound, except that the pH is adjusted with hydrochloric acid for the decomposition, the thallium I salt that forms is thallium I chloride, which is insoluble in the reaction medium. Therefore, the dipeptide formed during the decomposition reaction will dissolve and thallium-I-chloride will precipitate. It can be recovered by filtration. To convert the dipeptide into a tripeptide by the process according to the invention, it is then necessary to add a water-soluble thallium I salt to the filtrate. Similar procedures can be followed with other organothallium reagents.
Thus, as noted above, the method of the present invention is particularly useful for purifying high molecular weight peptides. For example, a polypeptide having 10 amino acid residues could be produced by a series of reactions in which various N-thiocarboxy amino acid anhydrides were successively added to an original amino acid in an aqueous solution and a dipeptide, a tripeptide, a tetrapeptide and finally a decapeptide were successively formed. Nine different reactions could be carried out, each of which required the addition of acid or base to adjust the hydrogen ion concentration for coupling or decomposition. With every implementation there is the possibility of an overreaction or other side reactions.
It then becomes clear that an undesirably high concentration of organic and inorganic by-products could accumulate in the reaction medium in the course of the reactions. It would be useful to isolate the decapeptide from the contaminated medium before it is reacted with another N-carboxyamino acid anhydride to form an undecapeptide.
The desired isolation can easily be carried out in accordance with the method according to the invention. For example, the final coupling reaction to form the decapeptide can be carried out in the presence of an organothallium sulfonate, e.g. B. of Dibutylthalliumäthansulfonat performed. In an alternative, the thallium salt can be added when the coupling reaction is essentially over. In both cases the thallium salt of the decapeptide carbamate precipitates.
The salt can then be taken up in a liquid medium in which the decapeptide is insoluble.
If the thallium salt of the decapeptide carboxyamine is used to produce the decapeptide and thus, as stated above, decomposed with an acid, whereby a thallium salt soluble in the selected medium is formed, the thallium salt dissolves and the decapeptide which does not dissolve can be isolated by filtration .
For example, the decapeptide can be taken up in isopropanol and decomposed with ethanesulfonic acid. Dibutylthallium sulfonic acid is soluble in isopropanol and therefore dissolves when it is formed. The decapeptide does not dissolve.
The following examples serve to illustrate the process according to the invention.
example 1
Dibutylthallium methanesulfonate
A total of 4.65 g of dibutylthallium chloride are suspended in 50 ml of water containing a small amount of methanol, and 2.67 g of silver methanesulfonate (prepared by neutralizing methanesulfonic acid in aqueous solution with silver oxide) are added with stirring. Stirring is continued while the temperature is maintained at 60-700 ° C. The mixture is kept at this temperature in low light until the formation and precipitation of silver chloride is no longer visible. The suspension is filtered and the precipitate is washed with water and with methanol.
The filtrate and the water and methanol used for washing are combined and concentrated under reduced pressure to cause crystallization of the desired product, which is collected by filtration.
This procedure is followed to prepare a variety of organothallium III alkanesulfonates, including specifically those in which the organo radicals have up to 10 carbon atoms and the alkane radical of methanesulfonic acid, ethanesulfonic acid, p-hydroxyphenylsulfonic acid, resorcinol sulfonic acid, a- and ss -Naphthylsulfonic acid, 4-hydroxy-a-naphthylsulfonic acid and 4-hydroxy-ss-naphthylsulfonic acid. Specific organo radicals in the compounds produced are e.g. B. methyl, methyl, propyl, butyl, phenyl, tolyl, naphthylcyclohexylfuranyl, pyridinyl, quinonyl, isoquinonyl, p-chlorophenyl-4-phenoxytolyl and p-nftronaphthyl.
L-valyl-L-serine
1 millimole of L-serine is dissolved in 50 ml of water and 2 millimoles of dibutylthallium methanesulfonate are added. The mixture is stirred magnetically at room temperature and the pH is adjusted to 9.0 with 2.5 N sodium hydroxide. One millimole of powdered N-thiocarboxyvaline anhydride is added while the pH is maintained near 9 by adding 2.5N sodium hydroxide from a micro-burette. The reaction is allowed to proceed until no precipitate of the dibutylthallium salt of L-valyl-L-serine thiocarboxamino salt forms (about 1 hour).
Use of the peptide compound
The aqueous suspension of the dibutylthallium salt of L-valyl-L-serine-thiocarboxyamino is acidified with hydrochloric acid and purged with nitrogen to decompose the thiocarboxyamino salt and form the desired dipeptide along with carbonyl sulfide and dibutylthallium chloride. This salt precipitates and is removed by filtration. The peptide dissolves and is recovered by chromatography.
If this procedure is followed with dimethylthallium ethanesulfonate, the corresponding product is obtained.
Example 2
L-valyl-L-valyl-L-serine
The procedure of Example 1 is repeated except that the thallium thiocarbamate is decomposed with acetic acid. In this case, both the dipeptide and the dibutylthallium acetate that forms are soluble in the reaction medium. The dipeptide is reacted with an additional millimole of N-thiocarboxy-L-valinahydride in the same environment under the same conditions. The resulting dibutylthallium salt of thiocarboxyamine of L-valyl-L-valyl-L-serine is then decomposed with hydrochloric acid as described in Example 1, so that dibutylthallium chloride is precipitated and L-valyl-L-valyl-L-serine is produced. The chloride salt is removed by filtration and the tripeptide is recovered by chromatography.
If one follows the procedure with dimethylthalliumethanesulfonate, one obtains the corresponding product.
Example 3
Leucyl arginine
1 millimole of arginine is taken up in 50 ml of water and stirred magnetically while the pH is adjusted to 9.5 with 2.5 N sodium hydroxide. 1 millimole of N-thiocarboxyleucine anhydride is added and the mixture is stirred for about 18 minutes at room temperature.
Then one millimole of dibutylthallium methanesulfonate in a concentrated aqueous solution is added and a copious precipitate of mono- (dibutylthallium) 4eucylargininthiocarboxyamine forms.
The precipitated organothallium thiocarboxyamine is collected by filtration, taken up in water and decomposed by the dropwise addition of sufficient hydrobromic acid according to the procedure of Example 1 to lower the pH to 3.0. Insoluble dibutylthallium bromide forms and precipitates rather slowly. It is recovered by filtration. The filtrate is purified from carbonyl sulfide using nitrogen and the desired product is isolated by chromatography.
Using dibenzylthallium ethanesulfonate as the source of the organothallium residue, the same product is produced.
The same process is used to make glycylserine and glycylarginine.
Example 4
Glycylalanylphenylalanine
A total of 0.47 g of alanylphenylalanine is taken up in 20 ml of water and the pH is adjusted to 9.5 with 2.5 N sodium hydroxide while the temperature is kept at 3 ° C. To the mixture is added 0.206 g of N-thiocarboxyglycyl anhydride. After 10 minutes, 1.66 g of dibutylthallium methanesulfonate are added. A heavy precipitate of di- (dibutylthallium) glycylalanylphenylalaninthiocarboxyamine forms and is collected by filtration. The precipitate is suspended in water and decomposed by adding methanesulfonic acid. The thallium methanesulfonic acid that forms is soluble. It is precipitated as dibutylthallium iodide by adding sodium iodide.
The tripeptide remaining in solution is collected chromatographically after removal of the iodide precipitate by filtration.
Example 5
Alanylalanylphenylalanine
A total of 0.472 g of alanyiphenylalanine is taken up in a small amount of water with magnetic stirring. The temperature is kept at around 3 C by external cooling and the occasional addition of ice. The pH is adjusted to 9.6 with 2.5 N sodium hydroxide and 0.26 g of N-thiocarboxyalanine anhydride is added. The mixture is stirred for 10 minutes and 1.613 grams of dibutylthallium methanesulfonate are added to cause rapid precipitation of di- (dibutylthallium) alanylalanylphenylalaninthiocarboxyamine. The precipitate is collected by filtration, taken up in water and decomposed by the addition of aqueous hydrobromic acid according to the method of Example 1 to form the desired tripeptide.
The dibutylthallium bromide which precipitates is removed by filtration and the desired tripeptide is recovered from the solution by chromatography.
Example 6
The procedures of the above examples are followed using N-carboxy amino acid anhydride in place of the indicated N-thiocarboxy amino acid anhydride, with the same products being achieved. The coupling reaction reaction time is reduced to less than 1 minute in each case and the coupling reaction temperature is about 10 C. An alkaline pH is maintained using a sodium borate buffer instead of sodium hydroxide.
Example 7 Phenylalanylphenylalanylarginine
A total of 1 millimole of phenylalanylarginine is taken up in a small amount of sodium borate buffer solution at pH 9.5 and 1 millimole of thallium-I acetate is added. The solution is kept at room temperature and 1 millimole of N-thiocarboxyphenylalanine anhydride is added. The mixture is stirred at room temperature for about 20 minutes while the pH is maintained at about 9.5 by the addition of 2.5N sodium hydroxide from a microburette. At the end of this period the precipitating thallium I salt of the thiocarboxyamine of phenylalanylphenylalanylarginine is decomposed by the addition of hydrochloric acid, as described in Example 1, while nitrogen is bubbled through the mixture to eliminate the carbonyl sulfide.
The desired tripeptide, which dissolves as it is formed, is recovered chromatographically.