Verfahren zum Schützen der Hydroxylgruppen von Oxyaminosäuren bzw. deren funktionellen Derivaten bei der Synthese von Peptiden
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum
Schützen der Hydroxylgruppen von Oxyaminosäuren bzw. deren funktionellen Derivaten bei der Synthese von Peptiden mit einem oder mehreren Hydroxy aminosäureestern.
Die biologisch wirksamen natürlichen Peptide ent halte, verschiedene Aminosäurereste mit einer Hydr- oxylgruppe. Zahlreich vertreten sind Serin, Threonin und Tyrosin und weniger zahlreich 5-Hydroxylysin und 4-Hydroxyprolin.
Es war bereits bekannt, dass in der Synthese von Peptiden, d. h. in der Bildung von Peptidbindungen, die reaktionsfähigen Gruppen wie-HN2,-COOH und -SH vorübergehend blockiert oder geschützt werden, wenn ihre Umwandlung vermieden werden muss.
In der Synthese von, Peptiden, die einen oder mehrere Reste von, HydroxyaminosÏuren enthalten, ist es zur Vermeidung von Nebenreaktionen wie die Wanderung einer Acylgruppe von einem Stickstoff- atom an ein Sauerstoffatom ratsam, die Hydroxylgruppe vorübergehend durch die Einführung einer den Sauerstoff blockierenden Gruppe zu sch tzen. Für einen solchen Schutz ist es wünschenswert, dass die Einführung einer solchen Gruppe mit sehr guter Ausbeute erfolgt. Weiterhin sollte der Schutz unter den Bedingungen der Entstehung der Peptidbindungen erhalten bleiben, und schliesslich muss es möglich sein, die genannte schützende Gruppe nach erfolgter Synthese ohne Aufbrechen der Peptidbindungen wieder abzuspalten. W. Grassman und E.
W sch haben einen Überblick einer Zahl von Sauerstoff schützenden Gruppen gegeben, der von L. Zechmeister in Progress in The Chemistry of organic natural products, 13, 482487 (1956) wiedergogeben ist, die jedoch alle ihre Nachteile aufweisen und sehr selten allein zur Anwendung kommen.
Das neue, erfindungsgemässe Verfahren zum Schützen der Hydroxylgruppe von Oxyaminosäuren bzw. deren funktionellen Derivaten bei der Peptidsynthese ist dadurch gekennzeichnet, dass man die Hydroxylgruppe von Oxyaminosäuren bzw. deren funktionellen Derivaten mit Isobuten zur t-ButylÏthergruppe umsetzt, aus welcher die Hydroxylgruppe durch Hydrolyse mit Säure wieder freigelegt werden kann,.
Während der Bildung der neuen Peptidbindungen bleibt diese Athergruppe fest an der entsprechenden Aminosäure oder dem Peptid gebunden, und kann nach Beendigung der gewünschten Synthese leicht wieder mit Hilfe einer Säure abgespalten werden, vorzugsweise mit Hilfe von wasserfreier Trifluoressigsäure, gegen deren Einwirkung die Peptidbindung bei Zimmertemperatur widerstandsfähig sind.
Es wurde festgestellt, dass durch den erfindungs gemässen Schutz der Hydroxylgruppe die optische Aktivität vollkommen erhalten bleibt, so dass keine Racemisierung eintritt. Die Ausbeuten bei der erfindungsgemÏssen Einf hrung der O-t-ButylÏthergruppe und derjenigen der Wiederabspaltung dieser Gruppe sind sehr hoch. Ausserdem ist die O t Butylather- gruppe durchaus widerstandsfähig gegen eine Hydrierung sowie auch gegen den Einfluss von alkalischen Reaktionspartnern.
Es konnte ausserdem gefunden werden, dass die schiitzen, de O-t-Butyläthergruppe durch Zugabe einer Hydroxyaminosäure oder eines Peptids zu Isobuten in Gegenwart einer geringen Menge einer katalysierenden Säure besonders gute Ergebnisse ergibt. Hierbei wird ein Uberscbuss an Isobuten verwendet. Die Reaktion verläuft nach folgendem Schema ;
EMI1.1
in welchem R den Rest eines N-Acylhydroxyamino- esters oder eines N-Acylhydroxypeptidesters darstellt.
Somit kann als Ausgangssubstanz eine Aminosäure oder ein Peptid verwendet werden, deren Carboxyl- gruppe bereits auf bekannte Weise in den Methyloder Äthylester übergefiihct worden ist. Es ist jedoch nützlich, als Ausgangssubstanz eine nicht veresterte Aminosäure oder ein solches Peptid zu verwenden, weil während der Einwirkung eines Isobutenüber- schusses nicht nur eine Verätherung der Hydroxylgruppe eintritt, sondern gleichzeitig auch eine Ver esterung zum t-Butylester gemäss dem folgenden Reaktionsschema :
EMI2.1
in welchem R den Rest einer N-Acylhydroxyamino- sÏure oder eines Peptids darstellt.
Das erfindungsgemässe Verfahren wird mitVorteil in einer L¯sung oder Suspension einer N-Acylhydroxyaminosäure oder eines Peptids in einem neutralen organischen Lösungsmittel oder in fl ssigem Isobuten durchgeführt. Als Beispiele von sehr geeigneten organischen ; Lösungsmitteln seien. genannt : Methylen- chlorid, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Nitromethan und Dioxan.
Zur Erreichung einer hohen Ausbeute sollte ein wesentlicher Uberschuss an Isobuten verwendet werden. Sofern gleichzeitig eine Carboxylgruppe verestert werden soll, ist ein bedeutender Uberschuss an Isobuten zu verwenden, vorzugsweise ungefähr 10-fache molare Menge für jede umzuwandelnde Hydroxylund Carboxylgruppe.
Die Reaktion wird vorzugsweise bei Zimmertemperatur oder einer niedrigeren Tempenatur in einer Druckflasche durchgeführt. Bei Zimmertemperatur ist die Umwandlung i. A. nach ungefähr 6-10 Stunden vollständig. Die hierbei erreichte Ausbeute an dem t-Butylester einer N-Acyl-O-t-butylaminosäure oder eines Peptids ist sehr gut und praktisch quantitativ.
Nach Beendigung der Peptidsynthese, die auf ge wöhnliche Weise durchgeführt werden kann, können die verschiedenen Schutzgruppen auf irgendeine bekannte Weise unter Erhaltung des freien Peptids wieder abgetrennt werden. Beispielsweise kann die vor zugsweise benutzte Nenzyloxycarbonylgruppe durch Hydrierung abgespalten werden.
Die O-t-Butyläthergruppe kann durch Behandlung des Äthers mit einer Säure abgespalten wenden, wobei die Peptidbindung erhalten bleibt. Zu diesem Zweck können sowohl wässrige als auch wasserfreie Säuren benützt werden,. Die Abspaltung wird vorzugsweise bei Zimmertemperatur oder bei einer niedrigeren Temperatur durchgeführt. In diesem Zusammenhang g wird die Verwendung von Trifluoressigsäure bevor zugt. Als Beispiele von wässrigen Säuren seien die anorganischen Säuren, wie Chlorwasserstoffsäure und Schwefelsäure und als organische Säure Trichloressig- säure genannt. Als wasserfreie Säuren können Chlorwasserstoff und Phosphorsäure verwendet werden.
Es ist möglich, die die NH2-Gruppe blockierende Benzyloxycarbonylgruppe und die die Hydroxylgnuppe blok kierende Gruppe gleichzeitig abzuspalten, nämlich durch Auflösen des geschützten Peptids bei Zimmer- temperatur oder einer niedrigeren Temperatur in wasserfreier Trifluoressigsäur, e, wobei Ausbeuten von mehr als 80"/o erreicht werden.
Nachfolgend werden einige Beispiele fur die Herstellung von O-t-Butyläthern von Aminosäuren wiedergegeben, nämlich von L-Serin, L-Threonin und L-Tyrosin, sowie von funktionellen Derivaten davon, worunter bekanntlich die entsprechenden Verbindungen zu verstehen sind, in denen die funktionellen Gruppen blockiert sind, wie in den N-Acylverbindun- gen, Ammoniumsalzen und Esberns. Alle diese Ver- bindungen sind wichtige Substanzen für die Synthese von biologisch wirksamen Peptiden. Zum Schluss werden Beispiele von Peptidsynthesen gegeben, in denen Gebrauch vom erfindungsgemässen Verfahren gemacht wird.
Beispiel 1
Serin
1. In 25 ml Methylenchlorid wurden 2, 30 g N Benzyloxycarbonyl-L-. Serin suspendiert und der Suspension 20 ml flüssiges Isobuten zugesetzt. Dann wurde 0, 1 ml konzentrierte Schwefelsäure zugesetzt und die Suspension während einer Nacht in einer Druckflasche bei Zimmertemperatur bis zurErhaltung einer klaren Lösung geschüttelt, die während weiteren 24 Stunden bei Zimmertemperatur stehen gelassen wurde. Der Isobutenüberschuss wurde durch Hin durchgleiten eines trockenen Stickstoffstroms abgetrennt. Danach wurde die erhaltene Lösung bis zum Neutralpunkt mit einer 5 /oigen wässrigen Natrium bicarbonatlösung gewaschen. Nach Trocknen mit Natriumsulfat und Verdampfen der Lösung wurde ein klares, leicht gelbes 01 erhalten.
Die Ausbeute an N-Benzyloxycarbonyl-0-t-butyl-L-serin-t-butylester betrug 3, 1 g oder 92 /o.
2. Abspaltung der Befnzyloxycarbonylgruppe durch Hydrierung.
Zu diesem Zweck wurde das aben erwähnte Íl mit Wasserstoff und einem Pd/BaSO4-Katalysator solange geschüttelt, bis kein weiterer Wasserstoff mehr aufgenommen wurde. Anschliessend wurde der Katalysator durch Zentrifugation abgetrennt und das Lösungsmittel im Vakuum abdestilliert. Es wurden 1, 81 g (81 /o) O-t-Butyl-L-serin-t-butylester erhalten.
3. 0, 90 g des entcarbobenzoxylierten Produkts wurden in wenig trockenem Ather aufgelöst und danach trockenes Chlorwasserstoffgas durch die Lösung geleitet. Während dieser Behandlung kristallisierte eine weisse Substanz aus, die durch Filtration abgetrennt, bei 60 C und 0, 1 mm getrocknet und nach einmaliger Umkristallisation aus einem Gemisch aus t-Butylalkohol und ¯ther schliesslich analysiert wurde.
Es wurden 0, 90 g O-t-Butyl-L-serin-butylester-hydro- chlorid mit einem Schmelzpunkt von 170 C und einer optischen Drehung von Mj-6 für c = 1, 15 in Dimethylformamid erhalten.
4. Abspaltung der t-Butylgruppen.
0, 90g O-t-Butyl-L-serin-t-butylester wurden unter Abkühlen in 10 ml wasserfreier TrifLuoressigsäure aufgelöst. Nach Stehen über Nacht wurde die Lösung im Vakuum eingedampft. Der ölrückstand wurde in wenig Wasser aufgelöst und an einer lonenaustau- schersäule chromatographiert. Das Filtrat wurde im Vakuum verdampft und der übrigbleibende kristalline Rückstand aus einem Athanol-Wassergemisch umkristallisiert. Nach Trocknen bei 60 C und 0, 1 mm betrug die Ausbeute 0, 35 g (93 /o) L-Serin mit einem Zersetzungsschmelzpunkt von 218'ans einer opti schen Drehung von [a] D ; +14, 3 für c = 5, 1 in 1 N Chlorwasserstoffsäure.
Beispiel 2
Threonin
1. Auf die gleiche wie in Beispiel 1 b, eschriebene Weise wurden 8, 10 g N-Benzyloxycarbonyl-L-threonin in Methylenchlorid mit Isobuten umgewandelt. Die Ausbeute an N-Benzyloxycarbonyl-0-t-butyl-L-thre- onin-t-butylester in Form eines klaren, hellgelben Öls betrug 9, 89 g, das sind 86, 5 %.
2. Durch Hydrierung der erhaltenen Substanzmenge wurden 5, 40 g, das sind 98 /o, O-t-Butyl-Lthreonin-t-butylester erhalten.
3. Gemäss dem Verfahren aus Beispiel 1 wurde das Hydrocblorid von O-t-Butyl-L-threonin-t-butylester in Form eines Öls erhalten. Aus einer Lösung desselben in Wasser wurde das Pikrat durch Zugabe eines Überschusses von Natriumpikrat erhalten. Das gebildete Pikrat von O-t-Butyl-L-threoninrt-butylester wurde aus einem Gemisch von t-Butanol und Wasser umkristallisiert. Der Schmelzpunkt betrug 140 und die optische Drehung Hp-6 für c = 2, 1 in Di methylformamid.
4. Abspaltung der t-Butylgruppen.
0, 56 g O-t-Butyl-L-threonin-tmbutylester wurden auf die f r Serin beschriebene Weise in 9 ml Trifluoressigsäure ausgelöst. Das L-threonin wurde mit Hilfe eines Ionenaustauschers isoliert. Die Ausbeute betrug 248 mg, das sind 86 /o. Der Zersetzungsschmelzpunkt betrug 255-260 C und, die optische Drehung [a] D 21 -31¯ f r c = 1,3 in. Wasser.
Beispiel 3
Tyrosin
1. 3, 15 g N-Benzyloxycarbonyl-L-tyrosin wurden in Methylenchlorid mit Isobuten in Gegenwart einer geringen Menge Schwefelsäure gemäss Beispiel 1 umgesetzt. Nach Aufarbeitung des Reaktionsgemisches auf die übliche Weise wurden 4, 01 g, das sind 93, 5 /o, N-Benzyloxycarbonyl-O-t-butyl-L-tyrosin-t-butylester in Form eines hellgelben Öls erhalten.
2. Die Benzyloxycarbonylgruppe wurde durch Hydrierung abgespalten. Ausgehend von 2, 00 g Sub stanz wurden 1, 3 g, das sind ungcfähr 100 /o, O-t- Butyl-L-tyrosin-t-butylester erhalten.
3. Diese Verbindung wurde in Äther aufgelöst.
Der Ather wurde im Vakuum verdampft und der erhaltene Rückstand in Benzol aufgenommen. Durch Zugabe von PetrolÏther bildeten sich Kristalle. Nach Umkristallisation aus einem t-Butanol-Petroläther- Gemisch und nach Trocknen bei 60 C unter 0, 1 mm wurden 1, 21 g, das sind 78 /o, O-t-Butyl-L-tyrosin- t-butylesterhydrochlorid erhalten. Der Schmelzpunkt betrug 154-155 C und die optische Dnehung [a] D21 +40 für c = 1, 63 in Dimethylformamid.
4. Abspaltung der t-Butylgruppe.
Unter Abkühlen mit Wasser wurden 180 mg O-t Butyl-L-tyrosin-t-butylester in 3 ml wasserfreier Tri fluoressigsäure aufgelöst. Nach Stehen über Nacht bei Zimmertemperatur wurde die Trifluoressigsäure im Vakuum eingedampft und der erhaltene Rückstand in wenig Wasser suspendiert. Alsdann wurde die Suspension auf einen pH mit 0, 1 N-Natriumhydroxydlösung gebracht und die abgetrennten Kristalle aus einem Athanol-WasserWGemisch umkristallisiert. Es wurden 90 mg, das sind 81 /o, L-Tyrosin mit einem Zersetzungsschmelzpunkt von ungefähr 300 C und einer optischen Drehung von [a]D21-8,5¯ f r c = 4, 0 in 6 N Salzsäure erhalten.
Beispiel 4
Synthese von L-Asparginyl-L-Threonin 1. t-Butylester von N-Benzyloxycarbonyl-L- asparginyl-O-tzbutyl-L-threonin.
Zu einer Lösung von 1, 00 g t-Butylester von 0-t-Butyl-L-threoninin 4 ml Dimethylformamid wurde eine Lösung von 2, 0 g N-Benzyloxycarbonyl L-asparagin-p-nitrophenylester in 4 ml Dimethylformamid gegeben. Die gelbe Lösung wurde während 24 Stunden bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Durch Wasserzugabe wurde ein öliger Niederschlag erhalten, der in Aethylacetat aufgenommen wurde.
Die erhaltene Lösung wurde mit Wasser gesch ttelt Dann wurde die Aethylacetatlösung mit Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abdestilliart. Der ¯lige Rückstand wurde in Benzol aufgelöst. Durch Zugabe von Petroläther bildete sich ein Niederschlag von 2, 0 g, das sind 97 /o.
Nach Umkristallisation wurden 1, 9 g Substanz erhalte. n. Der Schmelzpunkt betrug 112-114 C und die optische Drehung [a] D21-2, 3 für c = 2, 60 in Dime thylformamid. Die Kristalle wurden bei Zimmertem peratur und 0, 1 mm ber Phosphonpentoxyd getrocknet und analysiert.
Gefunden : C 60, 0 ; H 7, 8 ; N 8, 9 ;
Errechnet f r C24H37N3O7 (479, 58) : C 60, 11 ; H 7, 78 ; N 8, 76.
2. t-Butylester von L-Asparaginyl-O-t-butyl-Lthreonin
500 g t-Butylester von N-Benzylaxycarbonyl- übliche Weise mit Hilfe eines Pd/BaSO4-Katalysators in Wasserstoffatmosphäre entoarbobenzoxyliert. Nach Abtrennung des Katalysators und Abdestillieren des Lösungsmittels wurde ein kristallines Produkt in einer Ausbeute von 3, 51 g, das sind 98 /o, mit einem Schmelzpunkt von 145¯C erhalten Die Substanz wurde aus einem Aethanol-Aether-Gemisch, dem Petroläther zugesetzt wurde, umkristallisiert. Die gebildeten Kristalle hatten einen Schmelzpunkt von 149¯C und eine optische Drehung von [a] D21 +3 für c = 1, 27 in Dimethylformamid. Nach Trocknen bei 60 C und 0, 1 mm wurden sie analysiert.
Gefunden : C 35, 5 ; H 9, 0 ; N 12, 1 ;
Errechnet f r C10H31N3O5 (345, 45) : C 35, 63 ; H 9, 05 ; N 12, 16.
3. L-Asparaginyl-L-Threonin
200 mg t-Butylester von L-Asparaginyl-0-t- Butyl-L-threonin wurden bei 0 C in 5 ml Trifluor- essigsäure aufgelöst. Die Lösung wurde während einer Stunde im Eisbad und danach während einer Stunde bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Danach wurde der ¯berschuss von Trifluoressigsäure im Vakuum entfernt und der übriggebliebene Rückstand in wenig Wasser aufgelöst.
Anschliessend wurde die erhaltene Lösung an einer Ionenaustauschersäule chromatogra- phiert. Das Filtrat wurde im Vakuum eingedampft und der übriggebliebene Rückstand im Hochvakuum über Phosphorpentoxyd getrocknet. Es wurde ein amorphes Produkt in einer Ausbeute von 120 mg, das sind 84 /o, mit einem Schmelzpunkt von ungefähr 130 C und einer optischen Drehung von [a] D2l-3 f r c = 1, 90 in Wasser erhalten.
61 mg amorphes Produkt wurden in Wasser aufgelöst und mit einem ¯berschuss von in Wasser aufgelöster Pikrolonsäure behandelt. Nach Abkühlen und Stehenlassen im Eisschrank über Nacht wurden die gebildeten gelben Kristalle abfiltriert.
Nach Trocknen bei 100 C und 0, 1 mm wurden 179 mg Substanz mit einem Zersetzungsschmelzpunkt von 200 bis 202 C erhalten. Nach Umkristallisation aus einem Aethanol-Wassergemisch blieb der Schmelzpunkt unverÏndert Die optische Drehung betrug [a] D21 + 7¯ f r c = 2,24 in Dimethylformamid.
Gefunden C 42, 4 ; H 4, 9 ; N 19, 1 ;
Errechnet f r C18H23N7O10H2O (515, 45) : C 41, 94 ; H 4, 89 ; N 19, 02.
Das L-Aspacaginyl-L-tbreonin ist das endständige Dipeptid des Pankreashormons Glucagon.
Beispiel 5 t-Butylester von N-Phthaloyl-L-methionyl-L- asparaginyl-O-t-butyl-L-threonin.
1. N-Phthaloyl-L-methionin.
Gemäss dem Verfahren von G. H. L. Nefkens et al. (Rec. Trav. Chim. 79, 688 (1960) wurde diese Verbindung in einer Ausbeute von 66 ouzo mit einem Schmelzpunkt von 125-126 C und einer optischen Drehung von [c] -78, 4 für c = 4, 63 in Dimethylformamid hergestellt.
2. N-PhtbaloyI-L-methionin-p-nitrophenylester.
Mit Hilfe von Dicyclohexylcarbodiimid wurde p-Nitrophenol mit N-Phthaloyl-L-methionin in die obige Verbindung übergeführt.
Die Ausbeutung betrug 81"/o. Der Schmelzpunkt der erhaltenen Substanz betrug 97-98 C ; die optische Drehung [a] D21 -89,8¯ f r c = 2, 36 in Dimethylformamid.
3. 2, 43 g t-Butylester von L-Asparaginyl-O-t- butyl-L-threonin und 3, 20 g N-Phthaloyl-L-methio nin-p-nitro-phenylester wurden nacheinander in 20 ml Dimethylformamid aufgelöst. Nach Stehenlassen während 24 Stunden bei Zimmertemperatur wurde das erhaltene Gemisch in bekannter Weise weiterverarbeitet. Als R ckstand wurde ein Íl erhalten, das durch Verreiben mit Aether kristallin wurde. Die Ausbeute an dem gewünschten Peptid betrug 3, 46 g, das sind 81 /o. Durch Umkristallisation aus einem Benzol-Heptan-Gemisch wurden Kristalle mit einem Schmelzpunkt von 165 C und einer optischen Drehung [a] D2t ¯9, 40 für c = 2, 13 in Dimethylform- amid erhalten. Nach Trocknen bei 60 C und 0, 1 mm wurden die Kristalle analysiert.
Gefunden : C 57, 5 ; H 7, 0 ; N 2 ;
Errechnet für C29H42N4O8S (606, 75) : C 57, 41 ; H 6, 98 ; N 9, 23.
Die schützenden t-Butylgruppen wurden wie in den vorangegangenen Beispielen aus dieser Verbindung abgespalten unter Erhaltung von N-Phthaloyl-L methionyl-Lzasparaginyl-L-threonin, das nach Abspaltung der N-schützenden Gruppe das endständige Tripeptid LgMethionyl-L-asparaginyl-L-threonin des Glucagons ergab.