DE2134938A1 - Verfahren zur gleichzeitigen Gewinnung reiner hoch- und niedermolekularer Amylosen - Google Patents

Description

Patenten ν» alte

ZELLEMTiN υ. LUYKEN

. r_o-;0 München 22

Ken Hayashibara 15. Juli 197I

Okayama / Japan SJ/Hu

kho 7173

Verfahren zur gleichzeitigen Gewinnung reiner hoch- und niedermolekularer Amylosen

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur gleichzeitigen Gewinnung von reinen hoch- und niedermolekularen Amylosen durch Gelatinieren, Hydrolysieren und Aufarbeiten der Lösungen van Stärken.

Bekanntlich bestehen sämtliche otärkearten, einschließlich solcher von Kartoffeln, Süßkartoffeln, Mais und Amylomais, aus geradkettigen Amylosemolekulen und verzweigtkettigen Amylopektiniüolekülen. Gewöhnliche Stärken enthalten auf Trockensubstanz berechnet, 20 bis 25 Gew.% hochmolekularer Amylose, wogegen diese in Amylomaisstärke zu 50 bis 80 Gew.% vorliegt. Die Abtrennung der hochmolekularen Amylose aus Stärken ist schwierig, wie dies bei stark hydrophilen Makromolekülen stets uer Fall Lsb.

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_ 2 —

Die bekannten einschlägigen Trennungsmethoden zum Ausarbeiten der Stärkelösungen betreffen entweder die Fällung der Amylose durch Versetzen der wässrigen Stärkelösung mit einem Salz, wie Magnesiumsulfat, in hoher Konzentration oder das Ausfällen der Amylose in Komplexform durch Zusetzen eines Alkohols, wie n-Butanol. Die erstere Methode erfordert eine große Salzmenge; darüber hinaus ist die Entfernung der Salze aus eLen Fällungen h schwierig. Bei der zweiten Methode muß der Alkoholzusa.t.z zu einer Stärkelösung geringer Konzentration erfolgen; außerdem ist der Feuchtigkeitsgehalt der Fällungen hoch, wodurch Schwierigkeiten bei den nachfolgenden Arbeitsstufen der Entwässerung und der Entfernung des Alkohols entstehen. Beiden Methoden haftet der Nachteil an, daß in den Fällungen die hochmolekulare

durch

Amylose zusätzlich mehr oder weniger/Amylosepektin und niedrigmolekulare Amylose verunreinigt ist.

Die.der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe bestand demnach in der Entwicklung eines Verfahrens zur Gewinnung hochreiner, von Amylopektin freier, hoch- und niedermolekularer Amylosen ohne Benutzung von Fällungsmitteln.

Zur Lösung dieser Aufgabe prüfte man Methoden zur Abtrennung der Amylose aus wässrigen Stärkelösungen unter Auswertung der Tatsache, daß "rückläufig" (retrograded) polymerisierte Amylose mit geringem Feuchtigkeitsgehalt kristallisiert. Im Verfolg dessen wurden Methoden entwickelt, gemäß welchen die wässrigen .Stärkelösungen zwecks Ausfällung der "rückläufigen"

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Amylose in Kristallform gekühlt und dann die Lösungen zwecks Abtrennung eines großen Anteils des den Stärkemolekülen anhaftenden Wassers in Form von Eis zum Gefrieren gebracht werden, worauf nach dem Auftauen der Feuchtigkeitsgehalt der Lösungen in einfacher Weise durch Schleudern oder Filtrieren entfernt und eine poröse "rückläufige" Amylose gewonnen wird. Es wurde gefunden, daß auf die angegebene Weise der Feuchtigkeitsgehalt der Fällungen von 90 auf 60 bis 70% verringert werden kann.

Jedoch hatte die vorstehende Arbeitsweise den Nachteil, daß das Gefrieren der abgekühlten Stärkelösungen im hochmolekularen Amyloseanteil das Mitvorhandensein beträchtlicher Mengen von niedermolekularen Amylosen sowie von Amylopektin bewirkte. Die zur Beseitigung dieses Nachteils durchgeführten Versuche ergaben, daß die "rückläufige" hochmolekulare Amylose in reinem Zustand erhältlich ist, wenn man die aufgetaute Stärkelöung kurzzeitig auf eine temperatur von höchstens 70 C, bei welcher keine Gelatinierung und Auflösung des "rückläufigen", kristallisierten hochmolekularen Amyloseanteils stattfindet, erhitzt und gleichzeitig bzw. nachfolgend die in der wässrigen Lösung verbliebenen Anteile an Amylopektin und niedrigmolekularer Amylose durch Schleudern, Filtrieren oder Abpressen entfernt, wodurch ausreichend reine "rückläufige", hochmolekulare Amylosen erhalten werden. Das Nacherhitzen der "ausgefrorenen" !".suii^en bewirkt selbst bei Stärken mit einem Amylosegehalt

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von etwa 25% eine Erhöhung der gefällten hochmolekularen Amylosen gegenüber den gelösten niedermolekularen Amylosen.

Die Wirksamkeit dieser Arbeitsweise zeigt sich vorzugsweise bei Anwendung von Stärken mit einem Gehalt an hochmolekularen Amylosen von über 50% als Ausgangsstoffe. Solche Stärken sind erstens Amylomaisstärken, zweitens die aus gelatinierter Stärke durch Fällen mit Salzen abgetrennte Amylosestärke, drittens w die durch Fraktionierung erhaltenen Stärken mit einem hohen Gehalt an hochmolekularen Amylosen. Dies gilt insbesondere für AmylomaisstärkeÄ, die einen Amylosegehalt von 50 bis 80% aufweisen und aus denen hochmolekulare Amylosen mit einer Ausbeute von 60 bis 80%, berechnet auf das Gewicht des Ausgangsmaterials, gewinnbar sind; in den 60 bis 70% Feuchtigkeit enthaltenden Fällungen bestehen die Feststoffe zu 80 bis 90% aus Amylosen vom Polymerisationsgrad (P.G.) über 50. Aber auch die aus durch Erhitzen gelatinierten gewöhnlichen Stärken gefällte amylosereiche Stärke enthält hauptsächlich hochmolekulare Amylosen und kann hochreine Produkte ergeben.

Durch folgende Versuche konnte man nachweisen, daß die Trennbarkeit hochmolekularer Amylosen von niedermolekularen Amylosen auf ihrer unterschiedlichen Löslichkeit nach der vorstehend beschriebenen Behandlung der Amyloselösungen durch Kühlen, Einfrieren, Auf tauen und Erhitzen beruht. Es wurden 10%ip;e wässrige AmyloseIosungen, die entweder hochmolekulare Amylosen vom P.G. über 50 oder niedermolekulare Amylosen vom J-.G. unter

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50 enthielten, nach dem Kühlen eingefroren, bei 40⁰O aufgetaut, 10 bis 60 min bei 60 bis 80°0 erhitzt und dann der verbliebene Auflösungsgrad bestimmt. Die Ergebnisse zeigten, daß die Konzentration der gelösten hochmolekularen Amylosen nur 1 bis 2 Gew.%, dagegen die Konzentration der gelösten niedermolekularen Amylosen 8 bis 10 Gew.% betrug.

Auf diesen großen Unterschied in der Löslichkeit der verschiedenen Amylosen fußend, wurde ein Verfahren erarbeitet, welches nicht nur die Gewinnung hochreiner hochmolekulare!» Amylosen aus amylοsereichen Ausgangsstoffen in allen Fällen gewährleistet, sondern auch aus gewöhnlichen Stärken. Dies wurde dadurch erreicht, daß man das in Stärke enthaltene störende Amylopectin mittels taeis^ä^ Alpha-1,6-Glukosidasen, welche die Alpha-1,6-glukosidbindungen der verzweigtkettigen Moleküle selektiv aufzuspalten und damit in geradkettige Moleküle überzuführen vermögen, abbaute, indem die durch Erhitzen gelatinierte Stärke mit Jenen Enzymen hydrolysiert wurde. "

Diese A^bbaumaßnahme bewirkt, daß in den erhaltenen Stärkelösungen enthalten sind: erstens hochmolekulare Amylosen, die im ursprünglichen Stärkematerial bereits vorlagen und einen P. G. von etwa 500 bis 2000 aufw4/e}sen, und zweitens niedermolekulare Amylosen, die durch die Hydrolyse aus Amylopektin gebildet waren und einen P.G. von etwa 15 bis 50 aufw^sen,. Damit waren alle Stärkebestandteile in lineare Amylosemoleküle übergeführt. Beim Kühlen der Lösungen derartiger Amylosege-

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mische mit verschiedenen P.G.-Werten werden, wie gefunden wurde, die hochmolekularen Amylosen "rückläufig" polymerisiert und fallen in größeren Mengen und in reinerem Zustand aus den Lösungen aus, worauf man sie in einfacher Weise und in reiner Form von den gelösten niedermolekularen Amylosen abtrennt. Dies läßt sich glatt jedoch nur durch das vorhergehende Ausfrieren erreichen. Ohne diese Maßnahme würde der hohe Feuchtig- ^ keitsgehalt der Fällungen - etwa 90% - auf das Amylose gemisch lösend einwirken und damit den Anteil an hochmolekularen Amylosen weitgehend herabsetzen. Deshalb konnte man die für Amylosen bekannten Trennungs- und Beinigungsmethoden nicht anwenden.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur gleichzeitigen Gewinnung reiner hoch- und niedermolekularer Amylosen ist somit dadurch gekennzeichnet, daß man

(a) eine Aufschlämmung üblicher oder amylosereicher Stärken durch Erhitzen bei etwa 100 bis 170, vorzugsweise 100 bis 135°O gelatiniert,

(b) die gelatinierten Stärken nach schnellem Abkühlen auf etwa 40 bis 60⁰G mittels Alpha-1,6-Glukosidase unter Abspaltung der Verzweigungen verzweigter Stärkeanteile, insbesondere von Amylopektin, hydrolysiert,

(c) die erhaltene Lösung auf unter -5» vorzugsweise - 20 bis

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-z-

-15°C einfriert und nach dem Auftauen bei etwa 40 bis 80, vorzugsweise 55 bis 70 C erhitzt,

(d) aus dem Reaktionsgemisch die ausgefallenen hochmolekularen Amylosen abtrennt und

(e) aus den verbleibenden flüssigen Anteilen nach dem Eindampfen die ausgefallenen reinen niedermolekularen Amylosen gewinnt.

Als Ausgangsstoffe sind alle Stärkearten anwendbar, nämlich sowohl übliche amylosearme Stärken, gewonnen aus Mais, Kartoffeln und Süßkartoffeln, als auch amylosereiche Stärken, wie Amylomaisstärke oder durch Fraktionieren gewonnene Amylosen (z.B. solche der Firma Avebe, Veenham/ Holland). Wie dargelegt, ist besonders vorteilhaft die Verarbeitung von Amylomaisstärke, aus welcher naturgemäß mit höchster Ausbeute hochreine hochmolekulare Amylose gewinnbar ist.

Die Ausgangsstärken kommen als 5 bis 20%ige wässrige Aufschlämmungen zur Anwendung. Die Gelatinierung erfolgt in der Regel unter Rühren bei 100 bis 135°G, wobei eine vollständige Dis- . persion der hochmolekularen Amylosen unnötig ist; vielmehr ist lediglich daß Amylopektin völlig zu dispergieren, eine Hydrolyse der hochmolekularen Amylosen ,jedoch möglichst zu verhüten. Die gelatinierten Stärken werden schnell vorzugsweise auf 50 bis 60⁰G gekühlt.

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Als Alpha-1,6-glukosidasen benutzt man vorzugsweise hitzebeständige Enzyme der Gattungen Actinomycetes und Lactobacillus bei 60 Gj mit Erniedrigung der Viskosität der Lösungen wird die Temperatur auf 4-0 bis 50°C herabgesetzt. Außer üblicher Alpha-^/l,6-glukosidasen_J von denen Pseudomonas amyloderamosa (B15-ATG0 21 262) am günstigsten ist, sind andere Glukosidasen, Isoamylasen oder Pullulanasen anwendbar. Der Hydrolysevorgang läuft vollständig ab, wenn man 20 bis 50 Einheiten Enzym Je g Stärke (E/g St.) 4-0 bis 50 min lang im pH-Bereich von 3»5 bis 6,0 einwirken läßt.

Nach Abkühlen und Gefrieren erfolgt vorzugsweise ein Erwärmen auf etwa 4-0⁰G zwecks Auftauen und dann ein 20 bis 60 min dauerndes indirektes Erhitzen bei etwa 50 bis 70 G unter Rühren. Da bei 80⁰G eine Gelatinierung der "rückläufigen" Amylose eintritt, muß die Temperatur und Erhitzungsdauer in einem Bereich gehalten werden, durch welchen der nachfolgende Trennungsvor- k gang erleichtert wird. Die Vorgänge der Eückläufigkeit und Fällung erleichtert man durch Zusatz einer geringen Menge Alkohol, wie n-Butanol_t oder durch Stimulierung der Amyloselösung mittels Ultraschall.

Nach Abtrennung der die niedermolekularen Amylosen enthaltenden Lösung durch Schleudern oder Filtrieren erhält man die Fällungen der hochmolekularen Amylosen mit einem Feuchtigkeitsgehalt von 60 bis 70%. Die Fällungen werden zwecks Entfernung

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der Anteile mit niedrigem P. G. in warmem Wasser von 40 bis

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50 G suspendiert oder mit gewaschen. Die mit obiger Lösung der niedermolekularen Amylosen vereinigten Waschlösungen dampft man ein und gewinnt aus dem Konzentrat niedermolekulare Amylose, während aus den Fällungen Feststoffe mit bis zu 90% Amylose vom P, G. über 50 erhalten werden.*

In den folgenden Beispielen betreffen die Mengenangaben G*~ wichtsmengen.

Beispiel 1:

Eine 15%ige Aufschlämmung einer 70% Amylose enthaltender Amy~ lomaisstärke wird auf pH 4,0 bis 4,5 eingestellt und im Autoklav unter Rühren bei 135°G gelatiniert, dann schnell auf 50°0 gekühlt und unter Zusatz von 30 E/g St. Pseudomonaa amyloderamosa (ATCG 21 262) hydrolysiert. Das Hydrolysat enthält» auf Feststoff berechnet, 70% Amylose vom P.G. 100 bis 1000} die restlichen 30% bestehen aus Amylose vom P.G. 15 bis 50· Die Enzy»- inaktivierung erfolgt durch Erhitzen oder Kühlen, das Gefrie~ ren in einem Gefrierschrank bei -15°0, das Auftauen im Waimwasserbad von 30 bis 40°G und das Erhitzen bei 60 bis 65°0 unter Bohren. Die Fällung, enthaltend £0% Feuchtigkeit, enthält im Feststoff 90% Amylose vom P.G. über 50_$ die abgeschleuderte Lösung Amylosen vom P.G. 15 bis 5Oj das beiderseitige Verhältnis ist 73:27.

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- ίο -

Wenn die gefrorene Amyloselösung nach dem Auftauen kräftig gerührt, der poröse Feststoff zerdrückt, auf 6O⁰G erhitzt und abgeschleudert wird, erhält man im Fällprodukt zu 95% Amylose vom P.G. über 50 und mit einer engeren Streuung (sharpened distribution) des Molekulargewichts.

Beispiel 2;

^ Eine 10%ige Aufschlämmung einer 50% Amylose enthaltenden Amylomaisstärke wird gemäß Beispiel 1 gelatiniert und hydrolysiert. Die mit Wasser von 40⁰C gewaschene fällung enhält 80% Amylose vom P. G. über 50} Ausbeute 61%_# Nach Eindampfen der flüssigen Anteile auf die Hälfte, Abkühlen auf unter 5°C und Abschleudern der Fällung gewinnt man vorzugsweise Amylosen vom P.G. 15 bis 50} Ausbeute 91%.

Beispiel 5 s

Man gelatiniert eine 8%ige Aufschlämmung einer 70% Amylose enthaltenen Amylomaisstärke bei 125°G vollständig. Nach anschließendem, 30 min dauerndem Gefrieren, Auftauen bei 40⁰G, Zerdrücken der porösen Masse, und Erhitzen bei 60 bis 70⁰G werden die abgeschleuderten Fällungen in 30 bis 40°C warmem Wasser auf ge schlämmt, erneut abgeschleudert und mit Wasser von 40⁰G besprüht· Sie enthalten zu 85% Amylose vom P.G. über 50; Ausbeute 65%, berechnet auf Ausgangsstärke. Die abgeschleuderten flüssigen Anteile werden auf die Hälfte eingedampft, gekühlt, gefroren, entwässert und geschleudert· Die eingedampfte

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-ΛΛ -

Waschflüssigkeit ergibt eine Fällung, die hauptsächlich aus Amylopektin besteht.

Dieses Beispiel zeigt, daß man bei Nichtdurchführung der enzymatischen Zersetzung des Amylopektins unter Anwendung einer Alpha-1,6-glukosidase nicht in einfacher Weise gleichzeitig reine niedermolekulare Amylose gewinnen kann.

Beispiel 4-:

Eine 15%ige Hais stärke-Auf schlämmung gelatiniert man unter Rühren mit Hilfe von Irischdampf und dispergiert vollständig bei 130⁰O, kühlt die Dispersion dann schnell auf 6O⁰O und stellt auf pH 6,0 ein. Hierauf werden 30 E/g St. einer aus Lactobacillus plantarum (ATOO 8008) gewonnenen, hitzestabilen Alpha-1,6-glukosidase zugesetzt« Mit der Herabsetzung der Viskosistät kühlt man das Gemisch bis auf 50°C, worauf 4-0 h lang inkubiert wird. Die vollständig hydrolysierte Lösung gefriert man im Gefrierschrank bei -20⁰O unter "Riicklaufigke.it" und Kristallisierung der Amylosen. Das eingefrorene Gemisch wird bei 4-0⁰G aufgetaut, dann zwecks Auflösen der niedermolekularen Amylosen bei 55 0 unter Rühren erhitzt und sofort geschleudert. Die in hoher Ausbeute mit 60% Feuchtigkeit erhaltenen Fällungen beqstehen aus "rückläufiger" Amylose mit größeren Anteilen an hochmolekularen Amylosen als in der Reaktionsmischung und erniedrigten Anteilen an niedermolekularer Amylose, jedoch immer noch von über 50%. Die "Rückläufigkeit" der Amy-

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losen und demnach die Trennung beider Amylosearten war somit ungenügend.

Beispiel 5ι

In Abänderung des Beispiels 4 wird die erhaltene Reaktionsmischung von 75% niedermolekularer Amylose und 25% hochmolekularer Amylose (berechnet auf Trockenstoff) gekühlt und bei 40 0 geschleudert. Man erhält ein grob gereinigtes Produkt mit 80 bis 85% Feuchtigkeit und etwa 40% hochmolekularer Amylose; Ausbeute 57f5%· Eine Probe des Produkts wird gekühlt, zwecks Erzielung der " Rücklaufigkeit" der hochmolekularen Amylosen eingefroren, dann aufgetaut, auf 70⁰C erhitzt und geschleudert. Man erhält in einer Ausbeute von 22% (berechnet auf Ausgangsstärke als Feststoffe) poröse Fällungen "rückläufiger" hochmolekularer Amylosen mit 90% Amylosen vom P.G. über 50 und stark verbesserter Reinheit.

) Beispiel 6t

Eine 20%ige Aufschlämmung gereinigter Kartoffelstärke wird durch Erhitzen bei 130⁰C gelatiniert und nach Zusatz von aus Pseudomonas amyloderamosa (ATCO 21 262) gewonnener Alpha-1,6-glukosj-dase 4-0 h bei pH 4,0 und 45 bis 50⁰C inkubiert. Man läßt die Reaktionsmischung einen Tag stehen und schleudert bei 45°C. Die in einer Ausbeute von 7^>% (berechnet auf Ausgangs-

keit stärke als Feststoffe) und mit einerF-eüchtigV von 79% erhalt

tene Fällung wird durch Erhitzen auf 6O⁰C gelöst, dann stufen-

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weise gekühlt und anschließend bei -2O⁰O eingefroren, hierauf bei 40°C aufgetaut und bei 60⁰G erhitzt. Die abgeschleuderten und mit warmem Wasser gewaschenen !Fällungen enthalten 60% Feuchtigkeit und im Feststoffanteil 90% natürliche hochmolekulare Amylosen vom P.G. über 50} Ausbeute 25% (auf Ausgangsstärke als Feststoffe berechnet).

Beispiel 7»

Man gelatiniert eine 20%ige Aufschlämmung von wächserner Maisstärke bei 120°Q unter Rühren, kühlt sohneil auf 5ö°0 und inkubiert nach Zusatz des Enzyms von Pieudomonas amyloderamosa (ATGG 21 262) 45 h bei pH 4,0 und 45°C, kühlt dann, gefriert bei -20°C, taut am folgenden Tag bei 40⁰O auf, erhitzt 20 min bei 70°0, rührt um und schleudert. Es werden 5 bis 10% Fällung mit Amylosen vom P.G. von etwa 50 gewonnen. Aus der abgeschleuderten, zwecks "Rückläufigkeitsmachung" des Produktes gekühlten und nochmals geschleuderten Flüssigkeit gewinnt man reine, wasserlösliche, niedermolekulare Amylosen.

Dieses Beispiel dient weniger der Gewinnung hochmolekularer Amylosen als der Reinigung niedermolekularer Amylosen.

von den niedermolekulare Amylose gelöst enthaltenden flüssigen Anteilen

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Claims (2)

P itt!. te ην» έί ι j ZELLENiINu. LUfKEN . fa München 22 Zweibrückenstr. 6 13. Juli 1971 SJ/Hu kho 7173 Patentansprüche

1. Verfahren zur gleichzeitigen Gewinnung reiner hoch- und niedermolekularer Amylosen durch Gelatinieren, Hydrolysieren und Aufarbeiten der Lösungen von Stärken, dadurch gekennzeichnet, daß man

(a) eine Aufschlämmung üblicher oder amylosereicher Stärken durch Erhitzen bei etwa 100 bis 170, vorzugsweise 100 bis 135°G gelatiniert,

(b) die gelatinierten Stärken nach schnellem Abkühlen auf etwa 40 bis 60⁰O mittels Alpha-1,6-glukosidase unter Abspaltung der Verzweigungen verzweigter Stärkeanteile, insbesondere von Amylopektin, hydrolysiert,

(c) die erhaltene Lösung auf unter -5, vorzugsweise -20 bis -15°C einfriert und nach dem Auftauen bei etwa 40 bis j vorzugsweise 55 bis 70°0 erhitzt,

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(d) aus dem Reaktionsgemisch die ausgefallenen hochmolekularen Amylοfien> trennt und

(e) aus den verbleibenden flüssigen Anteilen nach dem Eindampfen die ausgefallenen reinen niedermolekularen Amylosen gewinnt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Stufe (c) unter Zusatz von etwas Alkohol, vorzugsweise n-Butanol, oder unter Ultraschall-Behandlung durchführt.

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