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Verfahren zur Herstellung von trägergebundenem Protein Die Er£inung
betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines trägergebundenen Proteins, insbesondere
eines an einen wasserunlöslichen Träger gebundenen Enzyms.
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Das Interesse an trägergebundenen Proteinen, insbesondere an trägergebundenen
enzymatisch aktiven Proteinen, nimmt n vielen Zweigen der Technik laufend zu. Es
sind auch schon mehrere Verfahren zur kovalenten Verlcnüpfung von Proteinen mit
Trägersubstanzen bekannt. Viele dieser Verfahren haben den Nachteil, daß sie recht
aufwendig sind und die Fixierung des Proteins mit einem erheblichen Verlust an Aktivität
verbunden ist. Auch sind vielfach die Ausbeuten recht gering. Ferner sind bisher
keine Verfahren bekannt, we].che sich allgemein zur Bindung aller Arten von Proteinen
eignen. Die Erfahrung hat vielmehr gezeigt, daß mit den verschiedenen Verfahren
zumeist nur bestimmte aktive Proteine onne Aktivitätsverlust gebunden werden können,
wobei zumeist nur der Versuch Aufschluß dariiber gibt, ob sich ein bestimmtes Protein
für cin bestimmtes Verfahren eignet. Die meistern enzymatisch aktiven Proteine konnten
bisher überhaupt noch nicht; an unlösliche Träger ohne Verlust der Aktivität gebunden
werden.
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Aufgabe der rfindung ist daher die Schaffung eines besonders einfachen
Verfahrens zur Bindung von Preteinen an Träger, welches einfach und schonend durchführbar
ist, so daß die Aktivität der Proteine nicht ode nicht wesentlich verschlechtert
wird und gleichzeitig gute Ausbeuten erzielt werden.
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Nunmehr wurde gefunden, und hierauf basiert die Erfindung, daß 7-
bis 10-gliedrige cyclische Garbonate bzw. Thionocarbonate mit Aminen in polarer
Lösung, insbesondere wässriger Lösung, rasch und vollständig bei Normaltemperatur
unter Ringöffnung und Bindung des Amines reagieren, wobei als Amine auch Proteine,
insbesondere enzymatisch aktive Proteine, verwendet werden können.
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Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung eines trägergebundenen
Proteins besteht daher darin, dass das Protein in wässriger Lösung mit einer Verbindung
umgesetzt wird, welchs wenigstens eine Cyclocarbonat- oder Cyclothionocarbonat-Gruppe
mit 7- bis 10-gliedri.gem Ping enthält.
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Es scheint, daß 7- bis 10-gliedrige Cyclocarbonatringe eine besonders
ausgewogene Reaktivität gegenüber Amingruppen besitzen, die es ermöglicht, durch
einfaches Zusammenbringen der umzusetzenden Verbindungen in wässriger lösung in
guter Ausbeute die angestrebte Verknüpfung zwischen der amingruppenhaltigen Verbindung,
also dem Protein, und der Trägerverbindung herzustellen Optimale Eigenschsften wurden
dabei beim gliedrigen Cyclocarbonatring festgestellt, insbesondere wenn die außer
der Carbonatgruppe vorhandene Ringglieder aus Kohlenstoffatomen bestehen. Der Ring
kann jedoch auch ein oder mehrere Heteroatome, insbesondere Sauerstoff, Stickstoff
oder Schwefelatome, als Ringglieder enthalten.
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Die zur Umsetzung mit dem Protein verwendete cyclocarbenatgruppenhaltige
Verbindug kann ein oder mehrere Cyclocarbonstgruppen der ober angegebene Ringgröße
enthalten. Bevorzugt werden solche Verbindungen, welche mehrere Cyclocarbonatringe
enthalton.
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Besondere gute Ergebnisse wurden beim erfinduugsgemäßen Verfah ren
mit cyclocarbenstgruppeuhaltigen Verbindungen erhalten, welche durch Umsetzung einem
Polyols mit 4 bis 7 Kohlenstoffstemen, die gegebenenfalls teilweise durch Sauerstoff-,
Sticksteff- oder Schwefelatome ersetzt sein können, zwischen je zwei OH-Gruppen
mit einem Halogenameisensäure-niedrig-Alkylester in einem organischen Lösungsmittel
erhalten wurden. Ein besonders bevorzugter Polyol ist hierbei Polyallylalkohol.
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Als organisches Lösungsmittel wird vorzugsweise ein Gemisch von Dimethylsulfoxid
und Diexan, welches gegebenenfalls ein Alkylamin wie Triäthylamin enthält, verwendet.
Anstelle des Nalogemameisensäurecsters kann auch Phosgen verwendet werden.
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Die niedri.g-Alkylgruppe des Halogenameisensäureesters ka .at 1 bis
4 Kohlenstoffatome enthalten. Bevorzugt wird der Chlorameisensaureatllylestex eingesetzt.
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Als Trägersubstanzen im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens werden
vorzugsweise solche cyclocarbonatringhaltigen Verhindungen ver@endet, die noch wasserlöslich
sind, andererseits aber von Dialysenmembranen zurückgehalten werden. Diese Forderung
wird beispielsweise im Falle der Verwendung eines Polyallylalkohols als Ausgangsmaterial
für den Träger von Polyallylalkoholen mit einem Molekulargewicht zwischen 2 000
und 15 000 gut erfüllt. Bei der Herstellung des acyclischen Garbonats erden diese
Verbindungen unlöslich und fallen aus. Die Verwendung von Polyolen der angegebenen
Eigenschsften ermöglicht daher eine leichte Aufarbeitung und TRennung und wird deshalb
bevorzugt.
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Wie bereits erwähnt, können außer den wasserlöslichen Polyolen als
Ausgangsprodukte auch wasserunlösliche Polyole verwendet werden Hierunter fallen
sowohl besonders hochmolekulare Polyole als auch vernetzte Polyole. letztere lassen
sich gewinnen durch Zusatz von mehrfach ungesättigten Verbindungen bei der Polymerisation
des Ausgangsmaterials oder durch nachträgliche Vernetzung in üblicher Weise, beispielsweise
unter Verwendung von organisehen Peroxiden.
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Anstelle der Carbonate können für das erfindungsgemäße Verfah ren
auch die entsprechenden Thienocarbenate verweudet werden,
deren
@caktivität praktisch gleich der der Cyclocarbonate ist.
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Bei de@ Cyclothionocarbonaten ist die CO-Gruppe des Carbonats durch
eine CS-Cruppe ersetzt. Die Herstellung der Thio@ocarbo@ete kann durch Umsetzung
eines Polyols mit Schwefelkohlenstof@ i@ alkalischem Medlum erfolg@@.
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Das erfindungsgemäße Verfahren wird zweckmäßig bei pH-Werte@ u@ den
Neutralpunkt, also zwischen etwa 5 und 9, durchgef@@rt, d@ in diesem Bereich die
besten Ausbeuten erzielt werden. Es ist jedoch auch möglich, außerhalb dieses Bereiches
die Kupplung durchzuführen. Hierbei besteht jed@ch die Gefahr einer Ringspaltung
durch das Medium in Konkurrenz zur Ringspaltung durch die Aminogruppen des Proteins,
so daß die Ausbeute, bezogen auf die vorhandene@ Carbonat-bzw. Thionocarbonatringe,
b@rabgesetzt wird. Zufriedenstellende Kupplungeu wurden jedoch auch noch bei pH-Werten
bis hera@ zu 3 und nach oben bis 10 durchgeführt.
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Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird eine weitere Methode zur
Bindung von Proteinen, insbesondere aktiven Proteinen geschaffen, welche äußerst
einfach in wässrigem Medium ohne Hilfsreagentien durchführbar ist und die unter
größtmöglicher Schonung der Proteine abläuft. Die Kupplung kann ohne weiteres bei
pH-Werten durchgeführt werden, die für das jeweils eingesetzte aktive Protein am
günstigsten ist, a.h. beim pH-Wert- der optima len Stabilität und Aktivität. Da
die Umsetzung boi Normaltemperatur abläuft und eine Erwärmung, die bei aktiven Proteinen
vielfach zu Aktivitätsverlust führt, @icht erforderlich ist, sind auch in dieser
Hinsicht besonders schonende Bedingungen gegeben.
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Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.
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Beispiel 1 A. Herstellung von Polyallylalkohol 60 ml Äthylac@ylat
wurden in 600 ml trockenem 1,4-Dioxan gelöst.
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Daun wurden 0,3 g Azoisobutyronitril zugesetzt und die Lösung 50 Stunden
bei 60° gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vahuum abgezogen, wobei als Rückstand
24 g eines viskosen Sirups aus Poly-(äthylacrylat) erhalten wurden.
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Der Rückstand wurde in 500 ml Tetrahydrofuran gelöst und mit cincr
Aufschlämmung von 10 zu g Lithiumaluminiumhydrid in 200 ml Tetrahydrofuran langsam
unter Rühren versetzt. Nach 40 Stunden bei Raumtemperatur wurde die Mischung weitere
4 Stunden zum Rückfiuß erhitzt. Anschließend wurde 1 1 Wasser vorsichtig zur Zerstörung
der Aluminiumkomplexe zugesetzt, die Mischung gerührt und suspendiertes Aluminiumhydrexid
abfiltriert und mit Wasser gewaschen (250 ml). Filtrat und Waschwasser wurden vereinigt
und aul etwa 200 ml eingeengt. Dann wurde der pH-Wert mit 2 n Salzsäure auf 5,0
eingestellt und die Lösung gegen fließendes Wasser dialysiert und anschließend gefriergetrocknet.
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Man erhielt so 6,4 g (50 %) Poly-(allylalkohol).
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Analyse: ber.: a 62,0 H 10,4 % gef.: C 61,8 H 10,6 %.
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B. Poly-(allylcarbonat) 2 g des obigen Polyallylalkohols wurden in
20 ml trockenem Dimethylsulfoxid, 3 ml trockenem Dioxan und 16 ml Triäthylamin gelöst.
Die erhaltene Lösung wurde auf einem Eisbad gerührt und innerhalb einer Stunde wurden
25 ml Chlorameisensäureäthylester zugetropft. Die Temperatur wurde dabei unter 200
gehalten.
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Hierbei trat ein reichlicher Niederschlag auf. Um die Fällung zu vervollständigen,
wurden 20 ml trockenes 1,4-Dioxan zugesetzt.
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Der Niederschlag wurde abgesaugt, mit trockenem 1,4-Dioxan und daun
mit Äther gewaschen und gegen fließendes Wasser dialysiert, um Triäthylaminhydrochlorid
zu entfernen. Der Rückstand wurde
gefriergetrocknet, wobei 1,9 g
Poly-(allylcarbonat) erhalten wurden.
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Die Verbindung wies starke Absorptionsbanden dei 1 810 und 1 750 cm
auf. -Die Absorption bei 1 610 cm 1 konnte den Cyclocarbonatgruppen zugeordnet werden,
während die Absorption bei 1 750 cm-1 auf acyclische Carbonatgruppen zurückzuführen
war.
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C. Kupplung von ß-D-Glucosidase 200 mg des wie oben beschrieben hergestellten
Polyallylcarbonats wurden mit 5 ml einer 0,1 M Natriumphosphatpufferlösung pH 7,6
gerührt. Ene Lösung von ß-D-Glucosidase (18,5 U/mg Protein; 5 mg) i.n 5 ml Wasser
wurde zugesetzt und die Aufschlämmung 3 1/2 Stunden bei 40 in einem verschlossenen
Reagensglas gerIhrt. ach Abzentrifugieren wurde der Niederschlag fünf Waschcyclen
mit M-Saccharose in M-Natrumchlorid (15 ml) und 0,005 M Natriumacetatpuffer pH 5,0
(15 ml) unterzogen. Dann wurde der Feststoff zwischen Filterpapieren getrocknet
und in einem Vakuumsexsikkator getrocknet.
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Das Produkt enthielt 14,6µg Protein/mg Polymer. Die speziiische Aktivität
des gebundenen Proteins betrug 6,0 U/mg, d.h. 31 % der Ausgangs aktivität.
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Beispiel 2 Bindug von Glucamylase 200 mg Poly-(allylcarbonat) wurden
in 5 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer pH 7,6 aufgeschlämmt und mit 5 ml einer Glucamylaselösung
(1 mg/ml; 330 U/mg) versetzt. Die Aufschlämmung wurde 22 Stunden bei 40 in einem
geschlossenen Glas gerührt. Dann wurde der Feststoff abzentrifugiert und wie in
Beispiel 1 beschrieben, gewaschen und getrocknet.
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Die A@tivität des erhaltenen gebundenen Enzyms betrug 6 U/mg Protein.
Die Aktivität pro mg Polymer betrug 2,44 U.