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Neue Rubelle-Lebendvneine und Verfahren zu ihrer Herstellung Die Erfindung
betrifft eine stark abgeschwächte Rubella-Lebendvaccine, die nicht nur neu und wirksam,
sondern auch weiter abgeschwächt ist, d.ho weit weniger Nebenwirkungen hat als die
bisher bekannten Vaccinen.
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Die Rötelnkrankheit ist eine. durch Infektion mit dem Rubelle-Virue
hervorgerutene masernartige Infektionskrankheit, die durch leichtes Fieber, Rautausschlag
und Schwellungen der Symphknoten gekennzeichnet ist, die nach einer Inkubationszeit
von einigen Wochen auftreten.
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Bei Säuglingen und Kindern ergeben sich keine ernsten Symptome, jedoch
ist die Krankheit bei Erwachsenen bedenklicher, weil sie von Arthritis, Arthralgie
o.dgl.
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begleitet ist. Insbesondere bei Rötelnerkrankung von Schwangeren im
Frühstadium der Schwangerschaft gelangt die Infektion über die Placenta zum Fetus,
wobei Kinder mit dem kongsnitalen Rubellasyndrom, z.B. Katarakten, kongenitalen
Herzstörungen und hocbgradiger Schwerhörigkeit, geboren werden0 Ferner ist festgestellt
worden, daß die Rötelnkrankheit periodisch in größerem Umfange auftritt. Dahar ist
die Entwicklung einer wirksamen Bekampfungsmafnahme der Röteln bei den Ärzten sehr
erwünscht,
Es ist natürlich erwünscht, die Rötelnkrankheit mit allen
Mitteln zu bekämpfen, Die Möalichkeit einer Rubella-Impfung wurde nach der Entdeckung
des Rubella-Virus von Weller und Mitarbeitern und Parkman und Mitarbeitern im Jahre
1962 eingehend untersucht0 Als Ergebnis gelang es bisher, den Rubella-Virussin Gewebekulturen
von Säugetier- oder Geflügelembryonen zu vermehren. Ferner wurde gezeigt, daß das
Rubella-Virus durch eine Reihe von Passagen in der Kultur bis zu einem solchen virulenzgrad
abgeschwächt werden kann, daß es möglich ist, Menschen mit einer abgeschwächten
tebendvaccine zu impfen und die Geimpften ohne ernste Nebenwirkungen immun zu machen
Es wurde klinisch nachgewiesen, daß durch Impfung von Säulingen und Kindern mit
einer abgeschwächten Rubella-Lebendvaccine die entsprechende Antikörper-Reaktion
ausgelöst werden kann, ohne daß nachteilige klinische Reaktionen auftreten, und
daß ferner Personen, in denen der Antikörper erzeugt worden ist, gegen den Befall
mit Röteln geschützt werden können. Das Rubella-Virus wird gelegentlich aus dem
Hals der Geimpften in Laboratorien gewonnen, jedoch ist die Kontaktinfektion bekanntlich
nie bei in der Nähe befindlichen gefährdeten Kindern und Erwachsenen festgestellt
worden, da die Kontakte nie zu einem klinischen Befall mit Masern und serologischem
Nachweis einer Rubella-Virusinfektion geführt haben, Andererseits sind jedoch bei
Impfung von Erwachsenen, insbesondere Schwangeren, mit den bisher bekannten abgeschwächten
Rubellavirus-Lebendvaccinen die Reaktionen von denen bei Säuglingen und Kindern
verschieden, und häufig werden die für RLbella typischen Symptome wie Fieber, Unwohlsein,
Hautausschlag, Arthritis, Arthralgie u.dgl. beobachtet.
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Die Impfung von gefährdeten Erwachsenen mit dem abgeschwächten Rubella-Virus-Lebendvaccinen
ist somit zimmer noch ein schwieriges Problem.
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Ferner ist es unbekannt, ob die bekannte Vaccine völlig ungefährlich
in Bezug auf die Mißbildungsentstehung oder fötale Toxizität für das Kind ist, wenn
Schwangere damit geimpft werden.
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Bei Vergleichsuntersuchungen über das biologische Verhalten vieler
Rubella-Virusstämme mit unterschiedlicher Geschichte bezüglich der Züchtung über
eine Reihe von Passagen, wobei eine Stämme von den Erfindern selbst und andere von
anderen Forschern in der Welt isoliert wurden, wurde festgestellt, daß gewisse kongenitale
Anomalitäten ähnlich dem beim Menschen beobachteten kongenitalen Rubellasyndrom
bei den Nachkommen auftreten, wenn Rehe im Frühstadium ihrer Trächtigkeit mit einem
Rubella-Virus geimpft werden.
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Von den Erfindern wurde ferner festgestellt, daß von den getesteten
Rubella-Viren das Rubella-Virus Stamm To-336, einer der Stämme, die von einem der
Erfinder isoliert wurden, im wesentlichen keine fötale Toxizität nicht nur bei Kaninchen,
sondern auch bei Mäusen und Ratten zeigt (siehe die nachstehenden Versuche 1 und
2)o Durch Abschwächung dieses Stammes gelang der Anmelderin schließlich die Herstellung
einer stark abgeschwächten Rubella-Virus-Vaccine, die nicht zu den oben genannten
unerwünschten Nebenwirkungen bei Erwachsenen führt.
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Hauptgegenstand der Erfindung ist demgemäß eine stark abgeschwächte
Rubella-Virus-Lebendvaccine, die nicht nur neu und wirksam ist, sondern auch nach
der Impfung nicht zu den für Rubella typischen Symptomen und der Mißbildungsentstehung
oder der fötaleu Toxiität führt, die beide nur schwierig bei den bisher bekannten
Rubella-Virus-Vaccinen auszuschalten waren, Die Erfindung umfaßt ferner ein Verfahren
zur Herstellung dieser neuen und wirksamen, stark abgeschwächten Rubella-Virus-Lebundvaceine
in einem einfachen Verfahren mit wirt-@chaftlich vertretbaren Kosten.
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Die Erfindung ist ferner auf eine wirksame und sichere immunologische
Methode zur Verhinderung von Rubella-Virus-Infektionen bei Erwachsenen, insbesondere
bei Schwangeren, ohne Mißbildungsentstehung der fötale Toxizität und nachteilie
Reaktionen gerichtet.
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Die Aufgaben, die die Erfindung sich stellt, werden gelöst, indem
der Rubella-Virusstamm To-336, der in an sich bekannter Weise durch wenigstens zehn
Passagen weitergezüchtet worden ist, durch weitere Züchtungspassagen in einer aus
Warmblütern hergestellten Gewebekultur bei einer Temperatur von etwa 28 bis 360C
geführt wird, bis er genügend abgeschwächt ist0 Der Rubella-Virusstamm To-336 wurde
von einem der Erfinder aus einem Halsabstrich eines Mädchens, das von Masern befallen
war, in Japan isoliert, Seine Subkultur wurde bei der American Type Culture Collection,
Maryland, U.S.A., unter der Zugangsnummer ATCC-VR-553 hinterlegt0 Beispielsweise
wird der Stamm To-536 in eine Gewebekultur geimpft, die geeignete Primärzellen eines
Warmbliiters enthält, und stationär oder unter Drehung bei einer Temperatur zwischen
etwa 28 und 36 C (gewöhnlich etwa 29 bis 32°C) etwa 5 bis 10 Tage (Gewöhalich etwa
1 Woche) bebrütet, worauf das vermehrte Virus in eine frische Gewebekultur, die
die oben genannten Primärzellen enthält, zur anschließenden Züchtungspassage übertragen
wird. Wenn diese Passage fortlar fend wiederholt wird, verläuft die Abschwächung
schnell.
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Für die Gewebekultur werden zweckmäßig Gewebe oder Zellen von Warmblütern,
d.h. Säugetieren und Gefliigel, verwendet, z.B. primäre Nierenzellen von verschiedenen
Tieren (zOBO Affen, Rinder, Schweine, Kaninchen und Runde), Embryozellen verschiedener
Vögel (z.B. Hühner oder Enten). u. dgl.
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Für die Durchführung der Reihenpassagen bei der Züchtung können ferner
Kulturen von menschlichen fötalen diploiden Zellen verwendet werden
Es
ist auch möglich, den Stamm To-336 in die Mnnionhöhle von Bruteiern (z0B. Hühner-
oder Enteneiern nach 7- oder 8-tägiger Bebrütung) zu impfen und etwa~7 bis 10 Tage
bei einer Temperatur von etwa 30 bis 3600 zu bebrüten. Das geimpfte Amnion wird
dann aseptisch entfernt und in einem geeigneten Medium, z.B. ausgewogener Hanks-
Salzlösung (der nachstehend angegebenen Zusammensetzung) o.dgl. verreiben, um eine
etwa 1obige Suspension herzustellen, worauf der Überstand durch Zentrifugieren abgetrennt
wird. Die überstehende Flüssigkeit enthält das vermehrte Virus und kann anschließend
in einer Reihe von Passagen in der oben beschriebenen Weise weitergezüchtet werden,
wobei eine schnelle Abschwächung erfolgt, Für die neue Züchtungspassage mit einer
Gewebekultur oder einem Brutei wird die Kulturflüssigkeit der vorhergehenden Passage
gewöhnlich auf etwa das 10-fache Volumen verdünnt, und die verdünnte Flüssigkeit
wird als Impfvirus oder Inocolum verwendet, Gegebenenfalls kann jedoch gelegentlich
eine unverdünnte Kulturflüssigkeit verwendet oder die soPO Grenzverdünnungsmethode
angewandt werden. Auf die Passage oder Passagen in der Amnionhöhle kann eine Passage
oder können mehrere Passagen mit einer Gewebekultur folgen, die die Primärzellen
eines Warmblüters oder menschliche diploide Zellen enthält, und umgekehrt.
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Dem Kulturmedium, in dem die Züchtung über eine Reihe von Passagen
durchgeführt wird, kann man ein oder mehrere Antibiotika wie Streptomycin, Dihydrostreptomycin,
Neomycin oder Penicilline zusetzen, so daß eine Vermehrung von durch zufällige Verunreinigung
vorhandenen Fremdmikroorganismen in der Kultur verhindert wird0 In dieser Weise
wird der Rubella-Virusstamm To-336 wiederholt in einer Reihe von Passagen weitergezüchtet,
bis durch Versuchsimpfung von seronegativen Personen, die für das Rubella-Virus
empfänglich sind, die Bestätigung erhalten worden ist, daß das Virus gßenügend abgeschwächt
ist.
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Der in dieser Weise abreschwächte Stamm To-336 wird als Impfvirus
für die Herstellung der stark abgeschwächten Rubella Virus-Lebendvaccine gemäß der
Erfindung verwendet.
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Das Impfvirus wird in ein Kultursystem geimpft, das aus deti Systemen
ausgewählt ist, die oben als geeignet für die Abschächunspassagen beschrieben wurden0
Es ist möglich, das gleiche System oder die gleichen Systeme, die für die Abschwächung
des Impfvirus verwendet wurden, oder andere Systeme zu verwenden. Bei Verwendung
einer Gewebekultur für die Herstellung der Vaccine wird empfohlen, die Vermehrung
des Virus in einem kulturmedium vorzunehmen, das keine Substanzen enthält, die als
Antigen wirksam sein können, wenn Menschen mit der hergestellten Vaccine geimpft
werden.
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Aus dem hierbei erhaltenen Kulturmedium werden Reststoffe wie Zellen,
Zellbestandteile o.dgl. beispielsweise durch Filtration oder Zentrifugieren entfernt.
Das Filtrat oder der Überstand kann als solcher oder nach Verdünnung mit einem geeigneten
Verd2nnungsmittel, z.B. physiologischer Kochsalziosung oder destilliertem Wasser,
je nach dem Virustiter als Produkt der Erfindung verwendet werden Die auf diese
Weise hergestellte stark abgeschwächte Rubella-Virus-1>ebendvaccine ist gebrauchsfertig,
kann jedoch in eingefrorener Form mit oder ohne Zusatz eines oder mehrerer stabilisierender
Mittel wie Saccharose, Lactose, Glutamate und Phosphate konserviert werden. Sie
kann auch mit oder ohne Zusatz eines oder mehrerer stabilisierender Mittel wie menschlichem
Serumalbumin, Gelatine u.dlg. für die Lagerung gefriergetrocknet -werden. Das gefriergetrocknete
Produkt wird bei Gebrauch in einem geeigneten Verdünnungsmittel, z0B. physiologischer
Kochsalzlösung oder sterilem destilliertem Wasser, gelöst.
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Für eine befriedigende Impfung ist es erforderlich, wenigstens 102,0
InD50 (50%ige Interferierende Desis) Virnstiter pro Person vorzugsweise subkutan
in einer einzigen Dosis
fu verabreichen. Besonders bevorzugt wird
eine Dosis von etwa 102,5 bis 103,5 InD500 Bei einer noch höheren Dosis besteht
keine Gefahr unerwünschter Nebenwirkungen wegen der hohen Sicherheit der Vaccine
gemäß der Erfindung, jedoch-ist die Verwendung einer so hohen Dosis zwecklos, da
keine besondere Steigerung des gewünschten Impfeffektes zu erwarten ist0 Für die
subkutane Impfung muß eine Dosis des notwendigen Virustiters in einem wässrigen
Präparat von etwa 0,1 bis 1,0 ml, zweckmäßig 0,25 bis 0,5 ml, enthalten sein, Die
Vaccine gemäß der Erfindung muß daher zum Gebrauch so eingestellt werden, daß sie
den stark abgeschwächten Rubella-Virus Stamm To-336 in einem Rubella-Virustiter
von wenigstens 102,0 InD50/ml, zweckmäßig etwa 102,5 bis InD50/ml und einen physiologisch
unbedenklichen Träger für das Virus enthält0 Wenn Säuglinge und Kinder mit der in
dieser Weise hergestellten stark abgeschwächten Rubella-Virus-Vaccine geimpft werden,
ist anschließend eine bemerkenswerte Steigerung des antikörpergehalts im Serum festzustellen,
der eine Infektion durch das Virus verhindert. Wenn Erwachsene einschließlich Schwangerer
geimpft werden, ist ebenfalls ein Anstieg der antikörperkonzentration im Blutserum
festzustellen.
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Es ist bemerkenswert, daß hierbei keine für Rubella typischen Symptome
beobachtet werden, die als unerwünschte Nebenwirkungen angesehen werden, die häufig
nach einer Impfung mit den bisher bekannten Rubella-Virus-Vaccinen auftreten, Die
neue und stark aboesWhwächte Rubella-Virus-Vaccine gemäß der Erfindung kann somit
unbedenklich selbst für Erwachsene verwendet werden, um sie wirksam gegen eine Rubella-Virus-Infektion
zu immunisieren, Die Sicherheit der stark abgeschwächten Rubelle-Virus-Voccine gemäß
der Erfindung wird durch die nachstehend beschriebenen Versuche weiter voranschalulicht.
Auschlißern wird die Erfindung mit Beispieler weiter erläutert.
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Versuch 1 (Test zur Ermittlung der fetalen Toxizität bei Kaninchen)
Gesunde 8 Monate alte weibliche japanische weiße Kaninchen wurden gepaart. Nach
8 Tagen gerechnet von der Konzeption, wurde 1,0 ml einer 'Testprobe in eine Ohrvene
der trächtigen Kanischen geimpft. Die folgenden Testproben wurden verwendet: a)
Infizierte Gewebekulturfliissigkeit von nicht abgeschwächtem Rubella-Virus-Stamm
To 336 nach 3 Passagen auf Nierenzellen vom afrikanischen Grünaffen (nachstehend
als "AGMK" bezeichnet).
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b) Stark abgeschwächte Rubella-Virus-Vaccine, hergestellt gemäß Beispiel
1.
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c) Infizierte Gewebekulturflüssigkeit von nicht abgeschwächtem Rubella-Virus
des Brown-Stammes1) nach 5 Passagen auf AGMK-Zellen (positive Kontrolle).
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d) Nicht-infektiöse Gewebekulturflüssigkeit von AGMK-Zellen (negative
Kontrolle)0 Die normal von den infizierten Mutterkaninchen geworfenen Kaninchen
wurden während einer Zeit von 30 Tagen nach der Geburt beobachtet. Die überlebenden
Jungen wurden zur Autopsie für makroskopisohe und histopathologische Beobachtungen
getötet. Die Ergebnisse der Beobachtungen sind nachstehend in Tabelle 1 zusammengestellt.
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In der Gruppe (c), in der die Infektion des Muttertieres mit dem Brown-Stamm
erfolge, überlebten nur sieben von den geworfenen 58 jungen Kaninchen. Bei vier
von den überlebenden sieben jungen Kaninchen wurden typische Mißbildungen wie Katarakte,
Irisschäden, Hornhauttrübung, Kapillarinvasion der Hornhaut, Staphyloma und Microphthalmie
beiderseits oder einseitig bcobachtct. In den anderen Gruppen (u), (b) und (d) überleten
58, 56 bzw. 61 Junge, die sämtlich keine wallrnehmbaren Mißbildungen zeigten.
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In der Gruppe (c), bei der das Muttertier mit dem Brown-Stamm infiziert
worden war, wurden die meisten der 51 Todesfälle innerhalb von 3 Tagen nach der
Geburt beobachtet, und die Todesrate unter den jungen Kaninchen, die 7 Tage nach
der Geburt überlebten, war die gleiche wie bei den anderen Gruppen.
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Tabelle 1 Gruppe (a) (b) (c) (d) Stamm To-336 To-536 Brown -Züchtung
in Passagen2) AGMK-3 AGMK-25 AGMK-5 -Verabreichte Dosis3) 4,2 4,3 3,5 0 Zahl der
trächtigen Kaninchen 10 8 8 10 Zahl der geworfenen Kaninchen(N) 78 66 58 74 Zahl
der nach der Geburt eingegangenen Jungen (D) 20 10 51 13 Todesrate(D/N), % 25,6
15,2 87,9 17,6 Zahl der Nißbildungen bei den überlebenden Jungen 0/58 0/56 4/7 0/61
1) Der Brown-Stamm ist einer der am häufigsten auftretenden und typischen Wildstämme
des Rubella-Virus in den Vereinigten Staaten.
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2) AGMK" bedeutet, daß die Züchtung in einer Reihe von Passagen auf
Nierenzellen des afrikanischen Grünaffen erfolgte. Die Zahl gibt die Anzahl der
Passagen an.
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3) Die Dosis ist als Dezimallogarithmus der 50igen interferierenden
Dosis (log10 InD50) ausgedrückt.
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Versuch 2 (Test zur Ermittlung der fötalen Toxizität bei Mäusen und
Ratten Gesunde 10 bis 12 Wochen alte weibliche Mäuse (CF-1) und Ratten (Sprague
Dawley) wurden gepaart. Nach 5 Tagen, gerechnet von der Konzeption, wurden die trächtigen
Tiere intravenös mit InD50 104,8/0,6 ml einer Gewebekultuflüssigkeit des Rubella-Virus
Stamms To-336, der in 3 Passagen auf AGMK-Zellen gezüchtet worden war, geimpft.
Am Tage vor
dem erwarteten Wurf, d.h. am 19.Tage der Trächtigkeit
der Mäuse und am 21.Tag der Trächtigkeit der Ratten, wurde die Gebärmutter der Tiere
aufgeschnitten. Die Fötusse wurden herausgenommen und den makrosleopischen Untersuchungen
einschließlich des nach der Bewson-Msthode angefärbten Skeletts (siehe Dowsons A.B.;
Stain Technology, 1, 123-124 (t926)) und der histopathologischen UNtersuchungen
von Augen und Gehör unterworfen. Als negative Kontrolle wurde die nicht infizierte
Gewebekulturflüssigkeit verabreicht0 Die Ergebnisse der Beobachtungen im Vergleich
zu der negativen Kontrolle sind in Tabelle 2 zusammengestellt.
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Sie zeigen, daß die Infizierung der Muttertiere mit dem Stamm To-336
nicht zu Mißbildungen bei den Fötussen führt.
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Tabelle 2 Tiergattung Maus Ratte Gruppe Kontrolle To-336 Kontrolle
o-336 Zahl der trächtigen Tiere 7 9 12 12 Todesrate der Fötusse (%) (tote Tiere/insges.
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implantierte) 35,0 34,1 9,0 6,2 Zahl lebender Fötusse 56 60 152 151
Körpergewicht der Fötusse (g) 1,03 1,10 3,17 3,22 (Mittelwert + Standardfehler)
+0,031 + 0,063 +0,065 +0,097 Zahl der Fötusse mit Skelettmißbildungen O 0 0 0.
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Zahl der Fötusse mit Viszeraldefekten O 0 0 O-Histopathologische Feststellungen
an Augen und Gehör normal normal normal normal
Versuch 3 (Impftest
bei Affen) Drei Gruppen von je 5 gesunden afrikanischen Grünaffen wurden mit der
gemäß Beispiel 1 hergestellten stark abgeschwächten Rubella-Virus-Vaccine geimpft,
die einen Virus titer von wenigstens 104,0 1nD50/ml zeigte: a) Intrathalamisch (1,0
ml, je 0,5 ml in beide Nemisphären), b) intraspinal (O,2 ml) und c) intramuskulär
(1,0 ml)O Die Affen wurden an den folgenden 28 Tagen beobachtet und dann histopathologischen
Beobachtungen unterworfen, wobei keine hnomalitäten festgestellt wurden.
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Versuch 4 (Sicherheitetest) Die gemäß Beispiel 1 hergestellte, stark
abgeschwächte Rubella-Virus-Vaccine wurde den Tests unterworfen, die in Abschnitt
23.114 der Public Health Service Regulations, Title 42, Part 73, U.S.A., für Sicherheitstests
von "Polyomyelitis Vaccine, live, oral", und in Abschnitt 73.73 der gleichen Vorschriften
für Sterilitätstests beschrieben sind.
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Als Ergebnis der Impfversuche bei verschiedenen Tieren (Kaninchen,
erwachsene Mäuse, Jungmäuse und Meerschweinchen), Gewcbekulturtests mit verschiedenen
Primärzellen (Affennieren, menschliches Amnion, menschliche Niere und Kaninchenniere)
und negativen Tests mit weiteren Mitteln wurde bestätiet, daß die untersuchte Vaccine
allen Erfordernissen der oben genannten Bestimmungen entsprach,
BQsiiel
1 Gesunden afrikanischen Grünaffen werden die Nieren aseptisch entnommen. Die Nieren
(AGEK) werden mit ansgewogener Hanks-Salzlösung4) gewaschen und zerkleinert. Das
zerkleinerte Gewebe wird in etwa dem 50-fachen Volumen einer mit 0,25% Trupain ergänzten
Hanks-Lösung suspendiert und unter Bewegung digeriert. Die erhaltenen freien Zellen
werden durch Zentrifugieren für 5 Minuten bei 1000 UpM abgetrennt und mit Hanks-Lactalbuminlösung
5) die mit 50% inaktiviertem Kalbssum ergänzt worden ist, in einer solchen Menge
verdünnt, daß die erhaltene Zellsuspension etwa 5 x 105 Zellen pro ml enthält. Die
Suspension wird stationär in Roux-Flaschen bei 36°C bebrütet. Nach 7 Tagen werden
die Zellen, die sich fest an der Innenwand der Flaschen angesetzt haben, dreimal
mit TC-Medium 1996) gewaschen, um ein AGMK-Zellkulturmedium zu bilden.
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Ein Impfvirus des Rubella-Stamms To-336 wird in die Zellen geimpft
und 90 Minuten bei 37°C der Absorption durch die Zellen überlassen. Die Flüssigkeit
wird dann verworfen, worauf die Zellen dreimal mit TC-Medium 199 gewaschen werden,
Abschließend werden 40 ml TC-Medium 199, das mit 2° inaktiviertem kalbsserum orgänzt
werden ist, in die Flasche gegeben, worauf 7 Tage bei 32°C bebrütet wird. Das Kulturmedium
wird Minuten bei 3000 UpM zentrifugiert, wobei ein überstand abgetrennt wird, der
nach 10 facher Verdünnung mit TC-Medium 199 als Impfvirus für die nächste Passage
verwendet wird0 Auf diese Weise wird die Passage mit der AGMK-Gewebekaltur 24 x,
gerechnet von der Stufe der Isolierung des Wildstammes To-336, wiederholt, wobei
ein Impfvirus für die Herstellung einer Rubella-Virus-Vaceine erhalten wird.
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Das Impfvirus wird in die Zellen inoculiert und in 40 ml eines serumfreien
TC-Mediums 199 bei 3200 7 Tage bebrütet.
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Die Kulturflössigkeiten werden abgetrennt und unmittelbar anschließend
zur Lagerung bei -70°C einrzefroren. Weitere
40 ml eines frischen
serumfreien TC-Mediums 199 werden den verbleibenden kultivierten Zellen zugesetzt,
worauf die Bebrütung 24 Stunden bei 3200 fortgesetzt wird. Die Kultur flüssigkeiten
werden erneut abgetrennt und eingefroren.
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Diese Maßnahme wird bis zum 10.Tag der Bebrütung wiederholt, Alle
gefrorenen Kulturflüssigkeiten werden schnell aufgetaut, zusammengegeßanen und 5
Minuten bei 3000 UpM zentrifufiert, wobei als Uberstand eine stark abgeschwächte
Rubella-Virus-Vccine abgetrennt wird. Der Überstand zeigt einen Rubella-Virus-Titer
von 104,2 InD50/ml, ermittelt mit dem System ECHO-117) und AGMK.
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Das Produkt wird zur Lagerung bei -70°C eingefroren. Nach einer Lagerungszeit
von 100 Tagen wird es nafgetaut und mit physiologischer Kochsalzlösung auf das dreifache
Volumen verdünnt. Mit der verdünnten Vaccine werden anschliessend Erwachsene sowie
Kinder und Säuglinge am Arm geimpft, wobei sich der gewünschte Immunisierungseffekt
einstellt.
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Bedeutung der Bezugszeichen: 4) Die ausgewogene Hanks-Salzlösung besteht
aus folgenden Bestandteilen: NaCl 8,0 g KOl 0,4 g CaCl2 0,2 g MgSO4.7 H2O 0,2 g
Na2HPO4.2 H2O 0,06 g KH2P()4 0,06 g NaHCO3 0,25 g d-lucose 1,0 g Phenolrot 0,02
g Destilliertes Wasser (dreifach destilliert) zur Auffüllung auf 1 Liter, 5) Hanks-Lachtalbuminlösung
wird hergestellt durch Auflösen von 5 g Lactalbuminhydrolysat in der ausgewogenen
Hanks-Salzlösung bis zu einem Gesamtvolumen von 1000 ml.
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6) Das TC-Medium 199 ist eine auf pII 7,2 eingestellte sterile wässrige
Lösung, die Aminosäuren, Purinbasen, Pyrimidinbasen, Vitamine, Zucker, Nucloetide,
anocganische Salze usw. enthält. Die gonaue Zusammensetsune wird beispielsweise
von J.F. Morgan und Mitarbeitern in Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 73, S.1 bis 8 (1950)
genannt.
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7) "ECRO-11" bedeutet "ECHO-Virus, Typ 11" (Gregory-Stamm) Dieser
Stamm wird häufig für die Ermittlung der Infektiosität des Rubella-Virus verwendet,
Beispiel 2 entenembryonen (nachstehend als"EE" bezeichnet) werden aseptisch aus
den Bruteiern am 13.Tage entnommen und nach dem Abschneiden des Kopfes auf die in
Beispiel 1 beschriebene -Weise behandelt, um ein EE-Zellkulturmedium in Roux-Flaschen
herzustellen. In das Kulturmedium wird ein Rubella-Virus, Stamm To-336, geimpft,
der 20 Passagen mit den AGNK-Zellen auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise durchlaufen
hat. Das Inoculum wird unter den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen bebrütet.
Nach weiteren vier Passagen in der EE-Zellkultur wird die Kulturflüssigkeit der
vierten Kultur zentrifugiert, wobei ein Impfvirus für die Herstellung einer Rubella-Virus-Vaccine
erhalten wird0 Das Impfvirus wird in die EE-Zellen in Roux-Flaschen inoculiert und
auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise unter Verwendung eines serumfreien TC-Mediums
199 verarbeitet, wobei eine stark abgeschwächte Hubella-Viruns-Vaceine erhalten
wird. Die nach der letzten Zentrifu£ierullg erhaltene Vaccine zeigt einen Rubella-Virus-Titer
von 104,0 1nD50/ml, ermlttelt mit dem gleichen System wie in Beispiel 1 Auf die
in Beispiel 1 beschriebene Weise wird das Produkt zur Lagerug eingefroren und anschließend
aufgetaut und zur Impfung verwendet, wobei gute Immunisterung bei Erwachbienen
sowie
bei Kindern und Säuglingen erzielt wird0 Die als Gewebekultur für die Passagen und
die Ileroteliung der Vaccine verwendeten ES-Zellen müssen negativ beim COPAL-Test
sein (siehe beispielsweise POSO Sarma und Mitarbeiter, Virology 23, 313 ff. (1964))o
Beispiel 3 Von gesunden Kaninchen aspetisch entnommene Nieren (nachstehend als "KN"
bezeichnet) werden auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise behandelt, um ein KN-Zellkulturmedium
in Roux-Flaschcn herzustellen. In das Kulturmedium wird ein Rubella-Impfvirus, Stamm
To-336, geimpft, das fünf Passagen auf AGMK-Zellen auf die in Beispiel 1 beschriebene
Weise durchlaufen hat. Das Inoculum wird unter den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen
bebrütet, Die Passage mit der KN-Zellkultur wird 54 x wiederholt. Das Kulturmedium
der 54.Passage wird zentrifugiert, wobei ein Inlpfvirus für die Herstellung einer
ltubella-Virus-Vaccine erhalten wird.
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Das Impfvirus wird in die Zellen in Roux-Flaschen geimpft und auf
die in Beispiel 1 beschriebene Weise unter Verwendung eines serumfreien TC-Mediums
199 verarbeitet, wobei eine stark abgeschwächte Rubella-Virus-Vaceine erhalten wird.
Die bei der letzten Zentrifugierung erhaltene Vaceine hat einen Rubella-Virustiter
von 104,2 InD50/ml, ermittelt mit dem gleichen System wie in Beispiel 1.
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Auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise wird das Produkt zur Lagerung
eingefroren und anschließend aufgetaut und für dic Impfung verwendet, wobei gute
Immunisierung bei Erwachsenen sowie bei Kindern und Säuglingen erzielt wird0