Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines stark abgeschwächtes Rötelnvirus enthaltenden Impfstoffes, der nicht nur neu und wirksam ist, sondern auch stärker abgeschwächt ist, d.h. weit weniger Nebenwirkungen hat, als die bisher bekannten Impfstoffe diese: Art.
Röteln sind eine masernähnliche Infektionskrankheit, die durch Infektion mit dem Rötelnvirus verursacht wird und durch schwaches Fieber, Hautausschlag und Lymphadenopathie, die nach einer Inkubationszeit von einigen Wochen auftreten, gekennzeichnet ist. Während bei Säuglingen und Kindern keine ernsten Symptome auftreten, neigt die Krankheit dazu, bei Erwachsenen schwerere Formen anzunehmen, die von Gelenkentzündung, Gelenkneuralgie oder dergleichen begleitet sind.
Besonders wenn Schwangere in einem frühen Stadium der Schwangerschaft an dieser Krankheit leiden, erstreckt sich die Infektion über die Placenta auf den Fetus, so dass eine hohe Rate von Säuglingen mit angeborenem Rötelnsyndrom, z. B.
Symptomen wie Linsentrübungen, angeborene Herzinsuffizien; und Hörfehler, geboren werden. Ausserdem wird eine Tendenz zum periodischen Auftreten von umfassenden Rötelnausbrüchen beobachtet. Daher bestand bei den Medizinern der Wunsch nach der Entwicklung einer wirksamen Massnahme zu Bekämpfung der Röteln.
Selbstverständlich ist es erwünscht, die Röteln mit beliebigen Massnahmen zu bekämpfen; die Möglichkeit einer Rötelnimpfung wurde nach der Entdeckung des Rötelnvirus durch Weller et al. und Parkman et al. im Jahre 1962 sehr gründlich untersucht. Es ist bereits gelungen, das Rötelnvirus in Säugetier- oder Geflügelembryogewebekulturen zur Vermehrung zu bringen, und es wurde auch gezeigt, dass das Rötelnvirus durch
Reihenpassagen in derartigen Kulturen bis zu einem Virulenz grad abgeschwächt werden kann, der die Impfung von Menschen in Form eines lebendiges abgeschwächtes Virus enthal tenden Impfstoffes erlaubt, wobei die Geimpften ohne ernste
Nebenwirkungen immun werden.
Es wurde klinisch bewiesen, dass durch Impfen von Säuglin gen und Kindern mit einem abgeschwächtes lebendes Röteln virus enthaltenden Impfstoff die entsprechende Antikörper reaktion ohne ungünstige klinische Reaktionen ausgelöst werden kann und dass diejenigen Impflinge, welche die Anti körper erworben haben, gegen Erkrankung an Röteln geschütz sind. Aus dem Rachen von geimpften Personen wird in
Laboratorien gelegentlich Rötelnvirus isoliert, es ist aber bekannt, dass nie eine Kontaktinfektion bei in der Umgebung der Impflinge lebenden anfälligen Kindern und Erwachsenen aufgetreten ist, da die Kontaktpersonen niemals klinische
Rötelnerscheinungen und serologische Anzeichen für eine
Infektion mit dem Rötelnvirus zeigten.
Wenn andererseits Erwachsene, insbesondere Frauen im gebärfähigen Alter, mit den bisher bekannten, abgeschwächtes lebendes Rötelnvirus enthaltenden Impfstoffen geimpft werden, treten andere Reaktionen auf als bei Säuglingen und Kindern, und es werden häufigsogenannterötelnartigeSympto- me, wie Fieber, Unwohlsein, Hautausschlag, Gelenkentzündung, Gelenkneuralgie und dergleichen, beobachtet. Daher ist es noch immer eine schwierige Aufgabe, für Infektionen anfällige Erwachsene mit den bekannten, abgeschwächtes lebendes Rötelnvirus enthaltenden Impfstoffen zu impfen.
Überdies wess man nicht, ob der bekannte Impfstoff bei der Impfung von Schwangeren vollständig frei von teratogenen Eigenschaften oder fetaler Toxizität für die Nachkommenschaf ist.
Im Verlauf von vergleichenden Untersuchungen über das biologische Verhalten vieler Stämme von Rötelnvirus, die verschiedene Passagen durchlaufen hatten und von denen einige von der Patentinhaberin und andere von anderen Forschern in der ganzen Welt isoliert wurden, wurde fest gestellt, dass durch Impfung von weiblichen Kaninchen in einem frühen Stadium ihrer Schwangerschaft mit einem Röteln virus bei der Nachkommenschaft manche angeborenen
Anomalien hervorgerufen werden, die dem bei Menschen beo bachteten angeborenen Rötelnsnydrom ähnlich sind.
Es wurde ferner festgestellt, dass einer der getesteten
Rötelnviren, nämlich Rötelnvirus Stamm To-336, der von der Patentinhaberin isoliert worden war, nicht nur bei Kaninchen, sondern auch bei Mäusen und Ratten praktisch keine fetale
Toxizität zeigt (siehe Tests 1 und 2, die im folgenden detailliert beschrieben werden). Durch fortschreitende Abschwächung dieses Stammes gelang es schliesslich, einen ein stark abge schwächtes Rötelnvirus enthaltenden Impfstoff herzustellen, der bei erwachsenen Menschen nicht die oben erwähnten unerwünschten Nebenwirkungen hervorruft.
Hauptziel der Erfindung ist es daher, einen ein stark abgeschwächtes lebendes Rötelnvirus enthaltenden Impfstoff zur Verfügung zu stellen, der neu und wirksam ist, aber nach der Impfung nicht die rötelnähnlichen Symptome und die tera togene Wirkung oder fetale Toxizität hervorruft, die beiden bei den bisher bekannten Rötelnvirus enthaltenden Impfstoffen nur schwierig vollständig beseitigt werden konnten.
Ein zweites Ziel der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Herstellung dieses neuen und wirksamen, ein stark abge schwächtes lebendes Rötelnvirus enthaltenden Impfstoffes zu entwickeln, das leicht und zu einem wirtschaftlich vertretbaren
Preis ausgeführt werden kann.
Ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, eine wirksame und sichere immunologische Massnahme zur Verfügung zu stellen, um ohne teratogene Wirkung oder fetale Toxizität und ungii,n- stige Reaktionen zu verhüten, dass erwachsene Menschen, insbesondere Frauen im gebärfähigen Alter, eine Rötelnvirus infektion erleiden.
Das Verfahren gemäss der Erfindung zur Herstellung eines stark abgeschwächtes Rötelnvirus enthaltenden Impfstoffes, wobei man Rötelnvirus bei einer Temperatur von 28 bis 36 C
Züchtungspassagen in einer lebende Zellen eines warmblütigen
Tieres, die das Virus zu ernäheren vermögen, enthaltenden
Gewebekultur unterwirft und die Passagen abbricht, wenn eine ausreichende Abschwächung erzielt ist, ist dadurch gekenn zeichnet, dass man das Rötelnvirus Stamm To-336 verwendet und diesen Stamm mehr als zehn Züchtungspassagen unter wirft, worauf man ein Kulturmedium mit dem so abgeschwäch ten Stamm To-336 impft und bebrütet und die Kulturflüssigkeit von Feststoffen befreit.
Das Rötelnvirus Stamm To-336 wurde von der Patent inhaberin aus dem Rachenabstrich eines an Röteln erkrankten
Mädchens in Japan isoliert; eine Subkultur davon wurde unter der Hinterlegungs-Nr. ATCC-VR-553 bei der American Type
Culture Collection, Maryland, U.S.A. hinterlegt.
Beispielsweise wird eine Gewebekultur, die geeignete primäre Zellen eines warmblütigen Tieres enthält, mit Stamm
To-336 geimpft und bei einer Temperatur zwischen 28 C und 36" C (gewöhnlich von ca. 29 bis ca. 32" C) ca. 5 bis ca. 10
Tage lang (gewöhnlich ca. eine Woche lang) stationär oder rotierend bebrütet, worauf das vermehrte Virus dann in eine frische Gewebekultur übertragen wird, die primäre Zellen der obigen Art enhält, um eine weitere Züchtungspassage auszu führen. Wenn derartige Passagen nacheinander wiederholt werden, geht die Abschwächung schnell vor sich.
Die Zellen für die Gewebekultur werden zweckmässig aus Geweben oder Zellen von warmblütigen Tieren, d. h. Säugetieren und Vögeln, gewählt; es kann sich beispielsweise um primäre Nierenzellen verschiedener Tiere (wie Affen, Rinder, Schweine, Kaninchen und Hunde), Embryozellen verschiedener Geflügelsorten (wie Hühner oder Enten) und dergleichen handeln.
Zur Ausführung der Reihenpassagen können auch Kulturen von diploiden Zellen menschlicher Feten verwendet werden.
Der Stamm To-336 kann aber auch in die Amnionhöhlung eines ein Embryo enthaltenden Eies (z. B. in ein 7-tägiges oder 8-tägiges Hühnerei oder Entenei) geimpft und dieses bei einer Temperatur von 30 bis 36" C ca. 7 bis ca. 10 Tage langbebrütei werden. Das geimpfte Amnion kann dann aseptisch entfernt und in einem geeigneten Medium, wie beispielsweise die Salzlösung nach Hanks (die im folgenden detailliert beschrieben wird) oder dergleichen, verrieben werden, um eine ca.10Soige Suspension herzustellen, die dann zentrifugiert wird, um die überstehende Flüssigkeit abzutrennen. Diese enthält das vermehrte Virus und kann in der oben beschriebenen Weise einer nachfolgenden Züchtungspassage unterworfen werden, wodurch die Abschwächung schnell fortschreitet.
Für eine neue Züchtungspassage in einer Gewebekultur oder einem ein Embryo enthaltenden Ei wird die Kulturflüssigkeit der vorhergehenden Passage gewöhnlich auf das ca. 10fache Volumen verdünnt und die verdünnte Flüssigkeit als Impfvirus verwendet. Gewünschtenfalls kann man aber auch eine unverdünnte Kulturflüssigkeit verwenden, oder es kann gelegentlich die sogenannte Methode der beschränkten Verdünnung angewandt werden. Auf die Passage oder Passager in der Amnionhöhlung können eine oder mehrere Passagen in einer Gewegekultur, die primäre Zellen eines warmblütigen Tieres oder menschliche diploide Zellen enthält, folgen und umgekehrt.
Dem Kulturmedium für die Ausführung einer Züchtungspassage können ein oder mehrere Antibiotika, wie Streptomycin, Dihydrostreptomycin, Neomycin oder Penicilline, zugesetzt werden, wodurch verhindert wird, dass sich in der Kultur von einer zufälligen Verunreinigung herrührende Mikroorganismen vermehren.
Auf diese Weise wird das Rötelnvirus Stamm To-336 mehr als 10 Züchtungspassagen unterworfen, bis durch eine Versuchsimpfung eines seronegativen menschlichen Körpers, der für Rötelnvirus anfällig ist, bestätigt werden kann, dass das Virus genügend abgeschwächt worden ist.
Der so abgeschächte Stamm To-336 wird als Impfvirus für die Erzeugung des stark abgeschwächtes Rötelnvirus enthaltenden Impfstoffes verwendet, indem man ein Kulturmedium, z. B.
ein solches, wie es oben als für die Abschwächungspassagen brauchbar bezeichnet wurde, mit dem Impfvirus impft. Man kann die gleichen Medien, wie sie für die Abschwächung des Impfvirus verwendet wurden, oder andere Medien verwenden.
Wenn für die Erzeugung des Impfstoffes eine Gewebekultur verwendet wird, ist es empfehlenswert, dass man das Virus sich in einem Kulturmedium vermehren lässt, das keine Substanzen enthält, die als Antigen wirken können, wenn der menschliche Körper mit dem resultierenden Impfstoff geimpft wird.
Aus der so erhaltenen Kulturflüssigkeit werden feste Materialien, wie Zellen, Zellbruchstücke oder dergleichen, entfernt, beispielsweise durch Filtration oder Zentrifugieren, worauf das Filtrat oder die überstehende Flüssigkeit den erfindungsgemäss hergestellten Impfstoff darstellen, der je nach seinem bzw. ihrem Virustiter als solches bzw. solche oder nach Verdünnung mit einem geeigneten Verdünnungsmittel, wie physiologische Kochsalzlösung oder destilliertes Wasser, verwendet werden kann.
Während der auf diese Weise erzeugte, ein stark abgeschwächtes Rötelnvirus enthaltende Impfstoff gebrauchsfertig ist, kann er in gefrorener Form mit oder ohne Zusatz eines oder mehrerer Stabilisatoren, wie Saccharose, Lactose, Glutamate, Phosphate und dergleichen, aufbewahrt werden. Er kann aber auch mit oder ohne Zusatz eines oder mehrerer Stabilisatoren, wie menschliches Serumalbumin, Gelatine und dergleichen, für die Aufbewahrung gefriergetrocknet werden; das gefriergetrocknete Produkt kann zur Verwendung mit einem geeigneten Verdünnungsmittel, wie physiologische Kochsalzlösung oder steriles destilliertes Wasser, aufgelöst werden.
Zur Erzielung einer befriedigenden Impfung ist es bekanntlich erforderlich, pro Person mit einem Virustiter von mindestens 102,0 InDsO (50% Interfering Dose) pro Person zu impfen, und zwar vorzugsweise die ganze Dosis subkutan auf einmal.
Die besonders bevorzugte Dosis beträgt ca. 102,5 bis 103'5 In50. Höhere Dosen als die angegebene sind zwar nicht mit irgendeiner Gefahr unerwünschter Nebenwirkungen verbunden, weil der vorliegende Impfstoff sehr sicher verwendbar ist, aber es ist sinnlos, so hohe Dosierungen anzuwenden, da keinerlei besondere Zunahme der gewünschten Immunisierungswirkung zu erwarten ist.
Wenn Säuglinge und Kinder mit dem so hergestellten, ein stark abgeschwächtes Rötelnvirus enthaltenden Impfstoff geimpft werden, wird danach eine bemerkenswerte Erhöhung des Antikörperspiegels im Serum beobachtet, wodurch Infektionen mit Rötelnvirus vermieden werden. Wenn der Impfstoff Erwachsenen, einschliesslich Frauen im gebärfähigen Alter, verabreicht wird, wird ebenfalls eine Zunahme der Serumantikörper im Blut beobachtet; es ist bemerkenswert, dass keine rötelnartigen Symptome beobachtet werden, die als unerwünschte Nebenwirkungen betrachtet werden und häufig infolge Impfung mit den bisher bekannten Rötelnvirus-Impfstoffen auftreten. Daher kann der neue, ein stark abgeschwächtes Rötelnvirus enthaltende Impfstoff gemäss der Erfindung selbst für Erwachsene unbedenklich verwendet werden, um sie gegen Rötelnvirus-Infektionen zu immunisieren.
Die Ungefährlichkeit des ein stark abgeschwächtes Rötelnvirus enthaltenden Impfstoffes gemäss vorliegender Erfindung wird durch die folgenden Tests erläutert. Darauf wird die Erfindung anhand von Beispielen beschrieben.
Test I (Fetale Toxizität bei Kaninchen):
Gesunde, 8 Monate alte weibliche japanische weisse Kaninchen wurden gepaart, und 8 Tage nach der Empfängnis wurden die trächtigen Kaninchen mit einer Probe von 1,0 cm3 in eine Ohrvene geimpft. Es wurden die folgenden Testproben verwendet: (a) eine infizierte Gewebekulturflüssigkeit von nicht abgeschwächtem Rötelnvirus Stamm To-336, der drei Passagen mit Nierenzellen von Cercopitheus sabaeus (im folgenden als AGMK -Zellen bezeichnet) unterworfen worden war; (b) ein stark abgeschwächtes Rötelnvirus enthaltender Impfstoff, der nach dem folgenden Beispiel 1 hergestellt worden war; (c) eine infizierte Gewebekulturflüssigkeit von nicht abgeschwächtem Rötelnvirus Stamm Brown, das fünf Passagen mit AGMK-Zellen unterworfen worden war (positive Kontrolle); und (d) eine nicht infektiöse Gewebekulturflüssigkeit von AGMK-Zellen (negative Kontrolle).
Die jungen Kaninchen, die von den infizierten Mutterkaninchen auf normale Weiese zur Welt gebracht wurden, wurden 30 Tage nach ihrer Geburt beobachtet, worauf die überlebenden jungen Kaninchen für die Autopsie mittels makroskopischer und histopathologischer Beobachtungen getötet wurden. Die Ergebnisse dieser Beobachtungen sind in Tabelle I zusammengefasst.
In der Gruppe (c), in der die Mütter mit dem Stamm Brown infiziert worden waren, überlebten von den geborenen 58 jungen Kaninchen nur 7, und bei 4 von den überlebenden 7 Kaninchen wurden typische Missbildungen, wie Linsentrübungen, Irisdefekte, Undurchsichtigkeit der Hornhaut, kapilläre Invasion der Hornhaut, Staphylom und Mikrophthalmie, und zwar entweder beidseitig ober einseitig, beobachtet. In den Gruppen (a), (b) und (d) überlebten 58 bzw.
56 bzw. 61 junge Kaninchen, von denen keines irgendwelche merklichen Missbildungen zeigte.
In der Gruppe (c), in der die Mütter mit dem Stamm Brown infiziert worden waren, wurde der grösste Teil der 51 Todesfälle innerhalb von 3 Tagen nach der Geburt beobachtet, während die Todesrate unter den jungen Kaninchen, die 7 Tage nach der Geburt überlebten, in der gleichen Grössenordnung lag wie bei den anderen Gruppen. Tabellen Gruppe (a) (b) (c) (d) Stamm To-336 To-336 Brown Keiner Durchlaufende Passagen2) AGMK-3 AGMK-25 AGMK-5 Verabreichte Dosis3) 4,2 4,3 3,5 0 Anzahl der trächtigen Kaninchen 10 8 8 10 Anzahl der jungen Kaninchen (N) 78 66 58 74 Anzahl der nach der Geburt 20 10 51 13 gestorbenen jungen Kaninchen (D) Todesrate (D/N) (%) 25,6 15,2 87,9 17,6 Missbildungsrate bei den 0/58 0/56 4/7 0/61 überlebenden Jungen Bemerkungen:
1) Der Stamm Brown ist der verbreiteste und typischste Wildstamm des Rötelnvirus in den Vereinigten Staaten.
2) AGMK bedeutet die Anzahl Passagen durch AGMK Zellen (siehe oben).
3) Die Dosis wird als dekadischer Logarithmus der 50% Interfering Dose (10 glO InDsO) ausgedrückt.
Test 2 (Fetaltoxizität bei Mäusen und Ratten):
Gesunde 10 bis 12 Wochen alte weibliche Mäuse (CF-1) und Ratten (sprague Dawley) wurden gepaart; 5 Tage nach der Empfängnis wurden die trächtigen Tiere intravenös mit 104s8 InDsO pro 0,2 cm3 einer Gewebekulturflüssigkeit von Rötelnvirus Stamm To-336, das drei Passagen mit AGMK-Zellen durchlaufen hatte, geimpft. Am Tag vor den erwarteten Geburtsdaten, d. h. am 19. Tag der Trächtigkeit bei Mäusen und am 21. Tag der Trächtigkeit bei Ratten, wurden Kaiserschnitte vorgenommen und die Feten herausgenommen und makroskopisch beobachtet, wobei das Knochengerüst nach der Methode von Dowsons [vgl. Dowsons, A.B.; Stain Technology 1, 123 bis 124 (1926)] angefärbt und histopathologische Befunde der Augen und des Gehörsystems festgestellt wurden.
Als negative Kontrolle wurde die nicht infizierte Gewebekulturflüssigkeit verabreicht. Die Ergebnisse, verglichen mit den negativen Kontrollen, sind in Tabelle II zusammengefasst, aus der hervorgeht, dass die mütterliche Infektion mit dem Stamm To-336 keinerlei Anomalitäten der Feten hervorrief.
Tabelle II Tierart Maus Ratte Gruppe Kontrolle To-336 Kontrolle To-336 Anzahl der trächtigen Tiere 7 9 12 12 Mortalität der Feten (%) 35,0 Mortalität der Feten (%) 35,0 34,1 9,0 6,2 (Todesfälle/Gesamtzahl der Implantate) Anzahl der lebenden Feten 56 60 152 151 Körpergewicht der lebenden Feten (g) 1,03 1,10 3,17 3,22 (Mittelwert + Standardfehler) * 0,031 + 0,063 * 0,063 + 0,097 Anzahl der Feten mit Anomalien des 0 0 0 0 Knochengerüstes Anzahl der Feten mit visceralen 0 0 0 0 Hystopathologische Befunde der Augen Normal Normal Normal Normal und des Gehörsystems Test 3 (Impfung von Affen):
:
Drei Gruppen von je fünf gesunden Affen (Cercopitheus sabaeus) wurden mit dem ein stark abgeschwächtes Rötelnvirus enthaltenden Impfstoff, der im folgenden Beispiel 1 hergestellt wurde und einen Virustiter von mindestens 104.0 InDsO/cm3 aufwies, auf folgende Weise geimpft: (a) In den Thalamus (1,0 cm3 d. h. je 0,5 cm3 in jede Hemisphäre); (b) intraspinal (0,2 cm3); und (c) intramuskulär (1,0 cm3).
Die Affen wurden in den nächsten 28 Tagen beobachtet und dann histopathologisch untersucht, wobei keine Anomalitäten festgestellt wurden.
Test 4 (Sicherheitstest):
Der nach Beispiel 1 hergestellte, ein stark abgeschwächtes Rötelnvirus enthaltende Impfstoff wurde in der in Section 73.114 der Public Health Service Regulations, Title 42, Part.
73, U.S.A. für Sicherheitstests für Kinderlähmungsimpfstoff, lebendig, oral sowie in der in Section 73.73 der gleichen Verordnung für Sterilitätstests vorgeschriebenen Weise getestet.
Die Ergebnisse von Impfversuchen mit verschiedenen Tieren (d. h. Kaninchen, erwachsenen Mäusen, säugenden bzw.
gesäugten Mäusen und Meerschweinchen) und von Gewebekulturversuchen mit verschiedenen primären Zellen (d. h.
Affennieren, menschliches Amnion, menschliche Nieren und Kaninchennieren) sowie die negativ verlaufenden Tests auf zusätzliche Mittel bestätigten, dass der getestete Impfstoff allen Anforderungen der oben erwähnten Verordnung entsprach.
Beispiel 1
Die Nieren werden aseptisch aus Affen (Cercopitheus sabeus) entfernt. Die Nieren, die im folgenden, wie bereits erläutert, als AGMK bezeichnet werden, werden mit der Salzlösung nach Hanks gewaschen und zerhackt. Das zerhackte Gewebe wird in ca. dem 50-fachen Volumen einer mit 0,25 % Trypsin ergänzten Lösung nach Hanks suspendiert und unter Rühren aufgeschlossen. Die resultierenden freien Zellen werden durch 5-minütiges Zentrifugieren bei 1000 Umdrehungen pro Minute isoliert und mit einer solchen Menge von Lactalbuminlösung nach Hanks, die durch 5% inaktiviertes Kälberserum ergänzt worden ist, versetzt, dass die resultierends Zellensuspension ca. 5 x 105 Zellen pro cm3 enthält. Die Suspension wird bei 36 C in Roux-Flaschen stationär bebrütet.
Nach 7 Tagen, wenn sich die Zellen auf der Innenwandung der Flaschen kräftig vermehrt haben, werden die Zellen dreimal mit TC-Medium 199 gewaschen, um ein AGMK-Zellkulturmedium herzustellen.
Die Zellen werden mit einem Impfvirus des Rötelnvirus Stamm To-336 geimpft, wobei das Impfvirus 90 Minuten lang bei 37 C in den Zellen absorbiert wird. Dann wird die Flüssigkeit verworfen, worauf die Zellen dreimal mit TC-Medium 199, gewaschen werden. Schliesslich werden 40 cm3 TC-Medium 199, die durch 2% inaktiviertes Kälberserum ergänzt worden sind, in die Flaschen gegeben, worauf man 7 Tage lang bei 32 C bebrütet. Die Kulturflüssigkeit wird 5 Minuten lang bei 3000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert, um eine überstehende Flüssigkeit abzutrennen, die nach Verdünnung mit TC-Medium 199 um das 10-Fache, bezogen auf das Volumen, als Impfvirus verwendet wird.
Die Passage mit AGMK-Gewebekultur wird auf diese Weise 24-mal (berechnet von der Stufe der Isolierung des Wildstammes To-336 aus) wiederholt, um einen Impfvirus für die Erzeugung eines Rötelnvirus-Impfstoffes zu erhalten. Die Zellen werden mit dem Impfvirus geimpft und bei 32 C 7 Tage lang in 40 cm3 eines serumfreien TC-Mediums 199 bebrütet.
Die Kulturflüssigkeiten werden gesammelt und für die Auf bewahrung sofort bei 700 C C gefroren. Die zurückbleibenden gezüchteten Zellen werden mit weiteren 40 cm3 eines frischen serumfreien TC-Mediums 199 versetzt, worauf die Bebrütung 24 Stunden lang bei 32" C fortgesetzt wird. Die Kulturflüssigkeiten werden wieder gesammelt und gefroren. Dieses Verfahren wird bis zum 10. Tag der Bebrütung wiederholt. Alle gefrorenen Kulturflüssigkeiten werden rasch aufgetaut, vereinigt und 5 Minuten lang bei 3000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert, um eine überstehende Flüssigkeit abzutrennen, die aus einem stark abgeschwächtes Rötelnvirus enthaltenden Impfstoff besteht.
Die überstehende Flüssigkeit zeigt einen Rötelnvirustiter von 104.2 InD50/cm3, bestimmt mittels des Systems von ECHO-1 1 und AGMK.
Das Produkt kann für die Aufbewahrung bei 700 C gefroren werden.
Die Salzlösung nach Hanks besteht aus: 8,0 g Natriumchlorid 0,4 g Kaliumchlorid 0,2 g wasserfreiem Calciumchlorid 0,2 g Magnesiumsulfat-heptahydrat 0,006 g wasserfreiem Kaliumdihydrogenphosphat ,0,6 g wasserfreiem Kaliumdiyhdrogenphosphat 0,25 g Natriumbicarbonat 1,0 g d-Glucose 0,02 g Phenolrot sowie genügend dreifach destilliertem Wasser zum Auffüllen auf insgesamt 1 Liter.
Lactalbuminlösung nach Hanks wird hergestellt, indem man 5 g Lactalbuminhydrolysat in einer solchen Menge Salzlösung nach Hanks auflöst, dass die Gesamtlösungsmenge 1000 cm3 beträgt. Das TC-Medium 199 ist eine sterile, auf pH = 7,2 eingestellte wässrige Lösung, die Aminosäuren, Purinbasen, Pyrimidinbasen, Vitamine, Zucker, Nucleotide, anorganische Salze usw. enthält. Die genaue Zusammensetzung ist beispielsweise von Morgan, J.F. et al in Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 73, S. 1 bis 8 (1950) beschrieben.
ECHO-1 1 bedeutet ECHO-Virus Typ 11 (Stamm Gregory), welcher häufig für die Prüfung der ansteckenden Wirkung von
Rötelnvirus verwendet wird.
Beispiel 2
Entenembryonen (die im folgenden als DE bezeichnet werden) werden am 13. Tag der Bebrütung aseptisch aus den
Eiern entfernt und nach Abschneiden des Kopfes wie in Bei spiel 1 verarbeitet, um ein DE-Zellkulturmedium in Roux
Flaschen herzustellen. Das Kulturmedium wird mit einem Impf virus von Rötelnvirus Stamm To-336, das wie in Beispiel 1 be schrieben, 20 Passagen in AGMK-Zellen unterworfen worden ist, geimpft. Das geimpfte Kulturmedium wird unter den in
Beispiel 1 angegeben Bedingungen bebrütet. Die Passagen mit dem DE-Zellkulturmedium wird viermal wiederholt, worauf die Kulturflüssigkeit der vierten Kultur zentrifugiert wird; dabei erhält man ein Impfvirus für die Erzeugung eines Röteln virus-Impfstoffes.
DE-Zellen in Roux-Flaschen werden in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 unter Verwendung eines serumfreien TC
Mediums 199 mit dem Impfvirus geimpft und verarbeitet, um einen stark abgeschwächtes Rötelnvirus enthaltenden Impf stoff herzustellen. Der bei dem letzten Zentrifugieren er haltene Impfstoff zeigt einen Rötelnvirustiter von 104so InDsO/cm3, bestimmt mittels des gleichen Systems wie in Beispiel 1.
Das Produkt kann in gleicher Weise wie in Beispiel 1 für die Aufbewahrung gefroren und danach aufgetaut und zur Impfung verwendet werden, wobei sowohl Erwachsene als auch Kinder und Säuglinge in befriedigender Weise immunisiert werden.
Die für die Passagen und die Impfstofferzeugung als Gewebekultur verwendeten DE-Zellen müssen in Bezug auf den COFAL-Test [Sarma, P.S. et al; Virology 23, 313 et seq.
(1964)] negativ reagieren.
Beispiel 3
Aseptisch aus gesunden Kaninchen entfernte Nieren (die in folgenden als RK bezeichnet werden) werden wie in Beispiel 1 verarbeitet, um ein RK-Zellkulturmedium in Roux-Flaschen herzustellen. Das Kulturmedium wird mit einem Impfvirus von Rötelnvirus Stamm To-336, das fünf Passagen mit AGMK Zellen wie in Beispiel 1 beschrieben unterworfen worden ist, geimpft. Das geimpfte Kulturmedium wird unter den in Beispie 1 angegebenen Bedingungen bebrütet. Die Passage mit dem RK-Zellkulturmedium wird 54-mal wiederholt, und die Kultur flüssigkeit der 54. Kultur wird zentrifugiert, wobei man ein Impfvirus für die Erzeugung von Rötelnvirus-Impfstoff erhält.
RK-Zellen in Roux-Flaschen werden wie in Beispiel 1 unter Verwendung eines serumfreien TC-Mediums 199 mit dem Impfvirus geimpft und verarbeitet, wobei ein stark abgeschwächtes Rötelnvirus enthaltender Impfstoff erzeugt wird.
Der durch das letzte Zentrifugieren erhaltene Impfstoff zeigt einen Rötelnvirustiter von 104.2 InDsO/cm3, bestimmt mittels des gleichen Systems wie in Beispiel 1.
Das Produkt kann in gleicher Weise wie in Beispiel 1 für die Aufbewahrung gefroren und danach aufgetaut und für die Impfung verwendet werden, wobei Erwachsene sowie Kinder und Säuglinge in befriedigender Weise immunisiert werden.
PATENTANSPRUCH 1
Verfahren zur Herstellung eines stark abgeschwächtes Rötelnvirus enthaltenden Impfstoffes, wobei man Rötelnvirus bei einer Temperatur von 28 bis 36 C Züchtungspassagen in einer lebende Zellen eines Warmblüters, die das Virus zu ernähren vermögen, enthaltenden Gewebekultur unterwirft und die Passagen abbricht, wenn eine ausreichende Abschwächung erzielt ist, dadurch gekennzeichnet, dass man das Röteln virus Stamm To-336 verwendet und diesen Stamm mehr als zehn Züchtungspassagen unterwirft, worauf man ein Kulturmedium mit dem so abgeschwächten Stamm To-336 impft und bebrütet und die Kulturflüssigkeit von Feststoffen befreit.
UNTERANSPRÜCHE
1. Verfahren nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass man lebende Zellen des Affen Cercopitheus sabaeus verwendet.
2. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man lebende Zellen von Entenembryos verwendet.
3. Verfahren nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass man lebende Zellen von Kaninchen verwendet.
PATENTANSPRUCH II
Stark abgeschwächtes Rötelnvirus enthaltender Impfstoff, hergestellt nach dem Verfahren nach Patentanspruch I.
**WARNUNG** Ende DESC Feld konnte Anfang CLMS uberlappen**.
The present invention relates to a process for the preparation of a highly attenuated rubella virus containing vaccine which is not only new and effective but also more attenuated, i. has far fewer side effects than the previously known vaccines: Art.
Rubella is a measles-like infectious disease caused by rubella virus infection and characterized by a mild fever, rash, and lymphadenopathy that appear after an incubation period of a few weeks. While there are no serious symptoms in infants and children, in adults the disease tends to take on more severe forms accompanied by joint inflammation, joint neuralgia, or the like.
Especially when pregnant women suffer from this disease early in pregnancy, the infection spreads across the placenta to the fetus, causing a high rate of infants with congenital rubella syndrome, e.g. B.
Symptoms such as clouding of the lens, congenital heart failure; and hearing defects, are born. In addition, a tendency for extensive rubella outbreaks to occur periodically is observed. Therefore, there was a desire among medical professionals to develop an effective measure to combat rubella.
It goes without saying that it is desirable to combat rubella by any means; the possibility of rubella vaccination was raised after the discovery of rubella virus by Weller et al. and Parkman et al. examined very thoroughly in 1962. Rubella virus has been successfully propagated in mammalian or poultry embryo tissue cultures, and rubella virus has also been shown to be caused by
Serial passages in such cultures can be attenuated to a degree of virulence that allows vaccination of humans in the form of a live attenuated virus containing vaccine, with the vaccinated without serious
Become immune to side effects.
It has been clinically proven that vaccinating infants and children with a vaccine containing attenuated live rubella virus can elicit the appropriate antibody response without adverse clinical reactions and that those vaccinees who have acquired the antibodies are protected against rubella disease . The throat of vaccinated people becomes in
Laboratories occasionally isolate rubella virus, but it is known that contact infection has never occurred in susceptible children and adults in the vicinity of the vaccinees since the contacts are never clinical
Rubella symptoms and serological signs for one
Showed infection with rubella virus.
On the other hand, when adults, especially women of childbearing age, are vaccinated with the previously known vaccines containing attenuated live rubella virus, the reactions are different from those of infants and children, and so-called rubella-like symptoms such as fever, malaise, rash, joint inflammation, joint neuralgia are common and the like, observed. Thus, vaccinating infection-susceptible adults with the known vaccines containing attenuated live rubella virus remains a difficult task.
Furthermore, it was not known whether the known vaccine was completely free of teratogenic properties or fetal toxicity for the offspring when vaccinated in pregnant women.
In the course of comparative studies of the biological behavior of many strains of rubella virus that had passed through various passages, some isolated by the patentee and others by other researchers around the world, it was found that by vaccinating female rabbits in one early pregnancy with rubella virus in the offspring some congenital
Anomalies similar to the congenital rubella syndrome seen in humans.
It was also found that one of the tested
Rubella viruses, namely rubella virus strain To-336, which had been isolated by the patentee, were practically non-fetal not only in rabbits but also in mice and rats
Shows toxicity (see tests 1 and 2 detailed below). By progressive weakening of this strain it was finally possible to produce a vaccine containing a severely weakened rubella virus which does not cause the undesirable side effects mentioned above in adult humans.
It is therefore the main object of the invention to provide a vaccine containing a severely attenuated live rubella virus which is new and effective but does not induce the rubella-like symptoms and the teratogenic effects or fetal toxicity, both of which are previously known, after vaccination It has been difficult to completely eradicate vaccines containing rubella virus.
A second object of the invention is to provide a process for the preparation of this new and effective vaccine containing a severely weakened live rubella virus which is easy and economically feasible
Price can be run.
Another aim of the invention is to provide an effective and safe immunological measure to prevent adults, especially women of childbearing age, from suffering from rubella virus infection without a teratogenic effect or fetal toxicity and unfavorable reactions .
The method according to the invention for the preparation of a highly attenuated rubella virus containing vaccine, wherein rubella virus is treated at a temperature of 28 to 36 ° C
Cultivation passages in a living cell of a warm-blooded one
Animal capable of feeding on the virus
Tissue culture is subjected and the passages are terminated when sufficient attenuation is achieved, is characterized in that the rubella virus strain To-336 is used and this strain is subjected to more than ten cultivation passages, whereupon a culture medium with the strain To-336 is used. 336 inoculates and incubates and the culture liquid is freed from solids.
The rubella virus strain To-336 was obtained by the patent holder from the throat swab of a person suffering from rubella
Girl isolated in japan; a subculture thereof has been registered under deposit no. ATCC-VR-553 on the American Type
Culture Collection, Maryland, U.S.A. deposited.
For example, a tissue culture containing suitable primary cells from a warm blooded animal is strained
To-336 and inoculated at a temperature between 28 C and 36 "C (usually about 29 to about 32" C) for about 5 to about 10
Stationary or rotary incubation for days (usually about a week), after which the replicated virus is then transferred to a fresh tissue culture containing primary cells of the above type for a further cultivation passage. When such passages are repeated one after the other, the attenuation occurs quickly.
The cells for tissue culture are expediently made from tissues or cells from warm-blooded animals, i. H. Mammals and birds, chosen; for example, they can be primary kidney cells from various animals (such as monkeys, cattle, pigs, rabbits and dogs), embryo cells from various types of poultry (such as chickens or ducks) and the like.
Cultures of diploid cells from human fetuses can also be used to carry out the serial passages.
The strain To-336 can, however, also be inoculated into the amniotic cavity of an egg containing an embryo (e.g. in a 7-day or 8-day chicken egg or duck egg) and this at a temperature of 30 to 36 "C approx. 7 to The inoculated amnion can then be aseptically removed and triturated in a suitable medium, such as Hanks' saline solution (described in detail below) or the like, to produce a suspension of about 10% is centrifuged in order to separate the supernatant fluid, which contains the replicated virus and can be subjected to a subsequent cultivation pass in the manner described above, whereby the attenuation proceeds rapidly.
For a new cultivation passage in a tissue culture or an egg containing an embryo, the culture liquid of the previous passage is usually diluted to about 10 times the volume and the diluted liquid is used as a vaccine virus. However, if desired, an undiluted culture liquid can also be used, or the so-called limited dilution method can occasionally be used. The passage or passers in the amniotic cavity can be followed by one or more passages in a tissue culture containing primary cells of a warm-blooded animal or human diploid cells, and vice versa.
One or more antibiotics such as streptomycin, dihydrostreptomycin, neomycin or penicillins can be added to the culture medium for carrying out a cultivation passage, thereby preventing microorganisms resulting from accidental contamination from multiplying in the culture.
In this way, rubella virus strain To-336 is subjected to more than 10 breeding passages until it can be confirmed by a trial vaccination of a seronegative human body susceptible to rubella virus that the virus has been sufficiently attenuated.
The thus attenuated To-336 strain is used as a vaccine virus for the production of the highly attenuated rubella virus-containing vaccine by using a culture medium, e.g. B.
such as has been described above as being useful for the attenuation passages, inoculates with the vaccine virus. One can use the same media used for attenuating the vaccine virus or other media.
When tissue culture is used to produce the vaccine, it is recommended that the virus be allowed to propagate in a culture medium that does not contain substances that can act as antigen when the human body is vaccinated with the resulting vaccine.
Solid materials such as cells, cell fragments or the like are removed from the culture fluid obtained in this way, for example by filtration or centrifugation, whereupon the filtrate or the supernatant fluid represent the vaccine produced according to the invention, which depending on its virus titer as such or such or after dilution with a suitable diluent such as physiological saline or distilled water can be used.
While the highly attenuated rubella virus vaccine produced in this way is ready to use, it can be stored in frozen form with or without the addition of one or more stabilizers such as sucrose, lactose, glutamates, phosphates and the like. However, it can also be freeze-dried with or without the addition of one or more stabilizers, such as human serum albumin, gelatin and the like, for storage; the freeze-dried product can be dissolved for use with a suitable diluent such as physiological saline or sterile distilled water.
In order to achieve a satisfactory vaccination, it is known to vaccinate per person with a virus titer of at least 102.0 InDsO (50% interfering dose) per person, preferably the whole dose subcutaneously at once.
The most preferred dose is about 102.5 to 103.5 in50. Doses higher than those indicated are not associated with any risk of undesirable side effects because the present vaccine is very safe to use, but it is pointless to use such high doses as no particular increase in the desired immunizing effect is to be expected.
When infants and children are vaccinated with the highly attenuated rubella virus-containing vaccine, a notable increase in serum antibody levels is observed thereafter, thus avoiding rubella virus infection. When the vaccine is given to adults, including women of childbearing potential, increases in serum antibodies in the blood are also seen; it is noteworthy that no rubella-like symptoms are observed, which are considered to be undesirable side effects and often occur as a result of vaccination with the rubella virus vaccines known to date. Therefore, the novel vaccine according to the invention containing a severely attenuated rubella virus can be safely used even for adults to immunize them against rubella virus infections.
The harmlessness of the severely attenuated rubella virus vaccine according to the present invention is illustrated by the following tests. The invention is then described by means of examples.
Test I (fetal toxicity in rabbits):
Healthy 8 month old female Japanese white rabbits were mated, and 8 days after conception, the pregnant rabbits were inoculated with a 1.0 cm 3 sample in an ear vein. The following test specimens were used: (a) an infected tissue culture fluid of non-attenuated rubella virus strain To-336 which had been subjected to three passages with kidney cells of Cercopitheus sabaeus (hereinafter referred to as AGMK cells); (b) a highly attenuated rubella virus containing vaccine prepared according to Example 1 below; (c) an infected tissue culture fluid from non-attenuated rubella virus strain Brown which had been subjected to five passages with AGMK cells (positive control); and (d) a non-infectious tissue culture fluid from AGMK cells (negative control).
The young rabbits, which were born in the normal manner by the infected mother rabbits, were observed 30 days after their birth, after which the surviving young rabbits were sacrificed for autopsy by means of macroscopic and histopathological observations. The results of these observations are summarized in Table I.
In group (c), in which the mothers were infected with the Brown strain, of the 58 young rabbits born, only 7 survived, and in 4 of the 7 surviving rabbits, typical malformations such as lens opacities, iris defects, opacity of the cornea, capillary invasion of the cornea, staphyloma and microphthalmia, either bilateral or unilateral, observed. In groups (a), (b) and (d), 58 and
56 and 61 young rabbits, respectively, none of which showed any noticeable malformations.
In group (c), in which the mothers were infected with the Brown strain, most of the 51 deaths were observed within 3 days of birth, while the death rate among the young rabbits surviving 7 days after birth , was of the same order of magnitude as in the other groups. Tables Group (a) (b) (c) (d) Strain To-336 To-336 Brown None Passages2) AGMK-3 AGMK-25 AGMK-5 Dose administered3) 4.2 4.3 3.5 0 Number of pregnant rabbits 10 8 8 10 Number of young rabbits (N) 78 66 58 74 Number of young rabbits who died after birth 20 10 51 13 (D) Death rate (D / N) (%) 25.6 15.2 87.9 17.6 Malformation rate in the 0/58 0/56 4/7 0/61 boys who survived Comments:
1) The Brown strain is the most common and typical wild strain of rubella virus in the United States.
2) AGMK means the number of passages through AGMK cells (see above).
3) The dose is expressed as the logarithm of the 50% interfering dose (10 glO InDsO).
Test 2 (fetal toxicity in mice and rats):
Healthy 10 to 12 week old female mice (CF-1) and rats (sprague Dawley) were mated; 5 days after conception, the pregnant animals were inoculated intravenously with 104s8 InDsO per 0.2 cm3 of a tissue culture fluid of rubella virus strain To-336 which had passed through three passages with AGMK cells. The day before the expected birth dates, i.e. H. on the 19th day of gestation in mice and on the 21st day of gestation in rats, caesarean sections were performed and the fetuses were removed and observed macroscopically, the skeleton using the Dowsons method [cf. Dowsons, A.B .; Stain Technology 1, 123 to 124 (1926)] and histopathological findings of the eyes and the auditory system were found.
The uninfected tissue culture fluid was administered as a negative control. The results compared to the negative controls are summarized in Table II, which shows that maternal infection with To-336 strain did not cause any abnormalities in the fetuses.
Table II Species Mouse Rat Group Control To-336 Control To-336 Number of pregnant animals 7 9 12 12 Mortality of fetuses (%) 35.0 Mortality of fetuses (%) 35.0 34.1 9.0 6.2 ( Deaths / total number of implants) Number of living fetuses 56 60 152 151 Body weight of living fetuses (g) 1.03 1.10 3.17 3.22 (mean + standard error) * 0.031 + 0.063 * 0.063 + 0.097 number of fetuses with Anomalies of the skeleton 0 0 0 0 Number of fetuses with visceral 0 0 0 0 Hystopathological findings of the eyes Normal Normal Normal Normal and the auditory system Test 3 (vaccination of monkeys):
:
Three groups of five healthy monkeys each (Cercopitheus sabaeus) were vaccinated with the vaccine containing a severely attenuated rubella virus, which was prepared in Example 1 below and had a virus titer of at least 104.0 InDsO / cm3, in the following manner: (a) In the thalamus (1.0 cm3 ie 0.5 cm3 in each hemisphere); (b) intraspinal (0.2 cm3); and (c) intramuscular (1.0 cm3).
The monkeys were observed for the next 28 days and then examined histopathologically and no abnormalities were found.
Test 4 (security test):
The vaccine prepared according to Example 1 and containing a severely attenuated rubella virus was specified in Section 73.114 of the Public Health Service Regulations, Title 42, Part.
73, U.S.A. for polio vaccine safety testing, live, orally, and tested in the manner prescribed in Section 73.73 of the same Sterility Testing Ordinance.
The results of vaccination trials with different animals (i.e. rabbits, adult mice, lactating and
suckled mice and guinea pigs) and from tissue culture experiments with various primary cells (i.e.
Monkey kidneys, human amnion, human kidneys and rabbit kidneys) as well as the negative results for additional agents confirmed that the tested vaccine met all requirements of the above mentioned regulation.
example 1
The kidneys are aseptically removed from monkeys (Cercopitheus sabeus). The kidneys, referred to below as AGMK, as already explained, are washed with Hanks' saline solution and chopped up. The chopped up tissue is suspended in about 50 times the volume of a Hanks solution supplemented with 0.25% trypsin and disrupted with stirring. The resulting free cells are isolated by centrifugation for 5 minutes at 1000 revolutions per minute and mixed with an amount of lactalbumin solution according to Hanks, which has been supplemented by 5% inactivated calf serum, that the resulting cell suspension is approx. 5 × 10 5 cells per cm3 contains. The suspension is incubated stationary at 36 ° C. in Roux bottles.
After 7 days, when the cells on the inner wall of the flasks have multiplied vigorously, the cells are washed three times with TC medium 199 to prepare an AGMK cell culture medium.
The cells are inoculated with a vaccine virus of rubella virus strain To-336, whereby the vaccine virus is absorbed in the cells for 90 minutes at 37 ° C. The fluid is then discarded and the cells washed three times with TC 199 medium. Finally, 40 cm3 of TC medium 199, which has been supplemented with 2% inactivated calf serum, are added to the bottles, followed by incubation at 32 ° C. for 7 days. The culture fluid is centrifuged at 3000 revolutions per minute for 5 minutes to separate a supernatant fluid, which is used as a vaccine virus after dilution with TC medium 199 by 10 times by volume.
The passage with AGMK tissue culture is repeated 24 times in this way (calculated from the stage of isolation of the wild strain To-336) in order to obtain a vaccine virus for the production of a rubella virus vaccine. The cells are inoculated with the vaccine virus and incubated in 40 cm3 of a serum-free TC medium 199 at 32 ° C. for 7 days.
The culture fluids are collected and immediately frozen at 700 ° C for storage. The remaining cultured cells are treated with a further 40 cm3 of fresh serum-free TC medium 199, whereupon the incubation is continued for 24 hours at 32 ° C. The culture fluids are collected again and frozen. This process is repeated until the 10th day of the incubation All frozen culture fluids are rapidly thawed, pooled, and centrifuged at 3,000 rpm for 5 minutes to separate supernatant fluid consisting of a vaccine containing severely attenuated rubella virus.
The supernatant liquid shows a rubella virus titer of 104.2 InD50 / cm3, determined by means of the ECHO-11 and AGMK system.
The product can be frozen for storage at 700 C.
The Hanks saline solution consists of: 8.0 g sodium chloride 0.4 g potassium chloride 0.2 g anhydrous calcium chloride 0.2 g magnesium sulfate heptahydrate 0.006 g anhydrous potassium dihydrogen phosphate, 0.6 g anhydrous potassium dihydrogen phosphate 0.25 g sodium bicarbonate 1.0 g d-glucose 0.02 g phenol red and enough triple distilled water to make up to a total of 1 liter.
Hanks 'lactalbumin solution is prepared by dissolving 5 g of lactalbumin hydrolyzate in such an amount of Hanks' saline solution that the total amount of solution is 1000 cm3. The TC medium 199 is a sterile aqueous solution adjusted to pH 7.2, which contains amino acids, purine bases, pyrimidine bases, vitamins, sugars, nucleotides, inorganic salts etc. The exact composition is described, for example, by Morgan, J.F. et al in Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 73, pp. 1 to 8 (1950).
ECHO-1 1 means ECHO virus type 11 (strain Gregory), which is often used for testing the infectious effects of
Rubella Virus is used.
Example 2
Duck embryos (hereinafter referred to as DE) are aseptically removed on the 13th day of incubation
Eggs removed and, after cutting off the head, processed as in Example 1 to make a DE cell culture medium in Roux
Making bottles. The culture medium is inoculated with a vaccine virus of rubella virus strain To-336, which has been subjected to 20 passages in AGMK cells as described in Example 1. The inoculated culture medium is placed under the in
Example 1 specified conditions incubated. The passages with the DE cell culture medium are repeated four times, after which the culture liquid from the fourth culture is centrifuged; this gives a vaccine virus for the production of a rubella virus vaccine.
DE cells in Roux bottles are collected in the same manner as in Example 1 using a serum-free TC
Medium 199 was inoculated with the vaccine virus and processed to produce a highly attenuated rubella virus vaccine. The vaccine obtained during the last centrifugation shows a rubella virus titer of 104 50 InDsO / cm 3, determined using the same system as in Example 1.
The product can be frozen for storage in the same way as in Example 1 and then thawed and used for vaccination, whereby adults as well as children and infants are immunized in a satisfactory manner.
The DE cells used as tissue culture for the passages and vaccine production must be used in relation to the COFAL test [Sarma, P.S. et al; Virology 23,313 et seq.
(1964)] react negatively.
Example 3
Kidneys aseptically removed from healthy rabbits (hereinafter referred to as RK) are processed as in Example 1 to prepare an RK cell culture medium in Roux bottles. The culture medium is inoculated with a vaccine virus of rubella virus strain To-336, which has been subjected to five passages with AGMK cells as described in Example 1, inoculated. The inoculated culture medium is incubated under the conditions given in Example 1. The passage with the RK cell culture medium is repeated 54 times, and the culture liquid of the 54th culture is centrifuged to obtain a vaccine virus for the production of rubella virus vaccine.
RK cells in Roux bottles are inoculated with the vaccine virus as in Example 1 using TC serum free medium 199 and processed to produce a highly attenuated rubella virus containing vaccine.
The vaccine obtained by the last centrifugation shows a rubella virus titer of 104.2 InDsO / cm3, determined using the same system as in Example 1.
The product can be frozen for storage in the same manner as in Example 1 and then thawed and used for vaccination, whereby adults as well as children and infants are immunized in a satisfactory manner.
PATENT CLAIM 1
Process for the preparation of a highly attenuated rubella virus containing vaccine, wherein rubella virus at a temperature of 28 to 36 C culture passages in a living cells of a warm-blooded animal, which are able to nourish the virus, containing tissue culture and the passages are broken off when sufficient attenuation is achieved , characterized in that the rubella virus strain To-336 is used and this strain is subjected to more than ten cultivation passages, whereupon a culture medium is inoculated and incubated with the thus weakened strain To-336 and the culture liquid is freed from solids.
SUBCLAIMS
1. The method according to claim I, characterized in that living cells of the monkey Cercopitheus sabaeus are used.
2. The method according to claim 1, characterized in that living cells from duck embryos are used.
3. The method according to claim I, characterized in that living cells from rabbits are used.
PATENT CLAIM II
Vaccine containing severely weakened rubella virus, produced by the process according to claim I.
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