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Verfahren zur Herstellung von Protease durch Kultivierung von Bakterien
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung einer alkalischen Protease
durch Kultivierung von Bacillus licheniformis auf einem geeigneten Kulturmedium,
und anschließende Abtrennung der alkalischen Protease aus der Kulturlösung.
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ßs izt bereits allgemein bekannt, Bakterien der Art Bacillus subtilis
für die IIerstellung einer alkalischen Protease zu verwenden, die ihre optimale
Aktivität bei einem hohen pH-Wert aufweist. Es wird hierzu auf die folgenden Literaturstellen
verwiesen:
das Buch "Nature", 1O, 802 (1952) von N. Ottessen et al; "Journal of the Agricultural
Chemical Society of Japan", 33, 9 (1959) von Fukumoto et al; "Agr. Biol. Chem.",
)0, 1261 (1966) von Fukumoto et al; oder "J. Biochem.", 45, 251 (1958) von Hagihara
et-al. Eine derartige-alkalische Protease findet ausgedehnte Verwendung in der Nahrungsmittel
industrie und in anderen Industrien. Es wird jedoch hier darauf hingewiesen, dar
die alkalische Protease unter Verwendung der Stämme von Bacillus subtilis hergesteift
wird.
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Es wurde nunmehr die Aktivität der Enzyme von verschiedenen Bakterienarten
untersucht, die aus dem Boden gewonnen wurden.
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Hierbei wurde festgestellt, daß gewisse Bakterien ein starkes Vermögen
zur Erzeugung von Protease besitzen. Die Bakterien wurden auf ihre morphologischen,
physiologischen und bakteriologischen Eigenschaften untersucht. Hierbei wurden die
Verfahren verwendet, die in dem Buch "Bergeyrs Manual of Determinative Bacteriology",
7. Auflage, angegeben sind. Es wurde gefunden, daß es sich um Bakterien handelte,
die zur Art Bacillus licheniformis gehörten.
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I)urch R.W, Bernlohr wird bereits in dem Buch tJ. Biol.Chem." 239,
538 (1964) von einer Protease berichtet, die durch Bacillus lichenisformis gebildet
wurde. Es wird dabei festgestellt, daß die Protease nicht durch Athylendiamintetraacetat
(EDTA) beeintrachtigt wurde, daß sie bezüglich ihrer thermischen Stabilität der
durch Bacillus subtilis erzeugten Protease ähnlich war, und dad sie ihre Aktivität
in dem weiten pH-TJertbereich von 6,o bis 10,0 entfaltet. Der optimale pH- ert wurde
jedoch nicht angegeben0 Von M. Damodaran et al wurde in "Biochem. Biophys. Acta",
17, 99 (1955) von einem Enzym berichtet, das vom Bacillus licheniformis abgetrennt
worden war.
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In diesem Buch wurde festgestellt, daß das Enzym aus Protease mit
einem optimalen pH-Wert von 7,4 und aus Peptidase bestand.
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Durch F. F. Hall et al wurde schließlich in dem Buch "ArchO Eiochem.
Biophys.", 114, 145 (1966) von einem Enzym berichtet, das vom Bacillus licheniformls
abgetrennt worden war. Die autoren stellten fest, da das Enzym aus zwei Arten Protease
und einer Art Peptidase bestand, und daß die Protease in einem Caseinlculturmedium
eine optimale Aktivität bei pH-retten von 7 bis 8 aufwies.
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Die Protease, die durch die Erfinder vom Bacillus licheniformis abgetrennt
und identifiziert wurde, unterscheidet sich von der Protease, von der in den obigen
Literaturstellen berichtet wurde, bezüglich ihrer Eigenschaften und insbesondere
ihres optimalen pH-Werts, der ein wichtiger Faktor für die ausnutzung der Wirkung
der Protease ist, wenn sie in der Praxis zur Verwendung gelangt. Die Protease, die
vom Bacillus licheniformis erhalten wurde, und die durch die Erfinder gefunden wurde,
zeigt ihre optimale aktivität bei einem pH-Wert im Bereich von 10 bis 10,5, und
zwar sogar dann, wenn Casein, Hämoglobin oder Albumin als Substrat verwendet wird,
und aus diesem Grunde ist es klar, daß diese Protease eine alkalische Protease ist.
So wird also gemäß der Erfindung eine neue alkalische Protease vorgeschlagen, die
durch Kultivierung von Stämmen, die zur Art Bacillus licheniformis gehören, erhalten
wird. Die neue alkalische Protease hat viele Verwendungen, wie z.B. bei der Herstellung
von Nahrungsmitteln, bei der Verbesserung von Meerprodukten, Häuten und Nahrungsmitteln,
in der Textilindustrie und bei der Herstellung von tlaschprodukten und auch in anderen
industriellen Bereichen.
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Gemäß der Erfindung kann die alkalische Protease dadurch hergestellt
werden, daß man Bakterien des Stammes Bacillus licheniformis (FERM-P Nr. 387, ATCC
Nr. 21471) auf herkömmlichen Kulturmedien kultiviert, wobei sich die genannte
alkalische
Protease im erhaltenen Kulturmedium ansammelt, und daß man hierauf die alkalische
Protease aus dem Kulturmedium in an sich bekannter Weise gewinnt.
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Der verwendete Stamm wurde sowohl beim Fermentation Reseach Institute,
Agency of Industrial Science & Technology in Tokio (Hinterlegungs-Nr. FERM -
P Nr. )87) als auch bei der American Type Culture Collection in Rockville-(ATCC
Nr. 21471) hinterlegt.
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Die folgenden Komponenten werden im Kulturmedium verwendet: Glukose
und Stärke als KohleSstoffquelle; Pepton und Casein als Stickstoffquelle; nattirliche
Nährstoffe, wie z.B. Hefeextrakte und Fleischextrakte; -sowie anorganische Salze.
Es können aber auch ein Extrakt eines entfetteten Sojabohnenkuchens, Reiskleie und
Maiskleie als natürliches Kulturmedium verwendet werden.
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Es wird bevorzugt, eine Kulturtemperatur von 30 bis 35°C bei einem
pH von ungefähr 7 unter Belüftung 40 bis 72 Stunden lang aufrechtzuerhalten, um
die maximal aktive Protease zu erzielen. Die maximale Aktivität kann bei 55 0C während
eines Zeitraums bis zu 40 Stunden erhalten werden.
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Die alkalische-Protease, die sich in der Kulturlösung ansammelt, wird
dadurch gereinigt, daß aufeinanderfolgend die in der Folge angegebenen Schritte
ausgeführt werden: Entbakterisierung, Konzentrierung, Aussalzung, Dialyse, Entfärburig,-Kolonnenchromatographie
unter Verwendung einer Ionenaustauschcellulose und eines Ionenaustausch-Sephadex,
und Gelfiltrierung.
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Nun werden die Zeichnungen erläutert.
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Fig. 1 zeigt das Chromatogramm, welches dadurch erhalten wird, daß
die Kulturlösung einer Entbakterisierung, Aussalzung, Dialyse und Entfärbung unterworren
wird, um eine gereinigte alkalische Protease einer Kolonnenchromatographie durch
Carboxymethylcellulose unterworfen wird. In Fig. 1 zeigt die Kurve 1 die Proteinkonzentration,
die Kurve 2 zeigt die Aktivität der Protease, und die gerade Linie 3 zeigt die Natriumchloridkonzentration.
Wie in Fig. 1 gezeigt ist, ist die Aktivität der Protease in der Spitzenfraktion
C konzentriert. Die Aktivität einer kleinen Proteasemenge kann in der Fraktion D
beobachtet werden. Die Protease, die in der Fraktion C konzentriert ist, ist die
alkalische Protease von Bacillus licheniformis, die durch die Erfinder gefunden
wurde. Es wurde im übrigen keine Fraktion gefunden, die die Proteaseaktivität wie
in Fig. 1 zeigt. Diese Tatsache läßt erkennen, daß die Reinigung der rohen Protease
leicht durchgeführt werden kann und daß durch die Erfindung in vorteilhafter Weise
alkalische Protease hergestellt werden kann.
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Die Charakteristiken der alkalischen Protease, die gemäß der Erfindung
hergestellt worden ist, sind in den Figuren 2 bis 5 gezeigt. Fig. 2 zeigt im Zusammenhang
zwischen der Aktivität der alkalischen Protease und dem pH-Wert. Wie in Fig. 2 zu
sehen ist, liegt der optimale pH-Wert im Bereich von 10 bis 10,5, wenn Casein als
Substrat verwendet wird, und dieser optimale pH-Wert ändert sich auch nicht, wenn
Hämoglobin oder Albumin als Substrat verwendet wird. Fig. 3 zeigt den Zusammenhang
zwischen der Aktivität der alkalischen Protease und der Temperatur. In Fig. 3 zeigt
die Kurve 1 die Aktivität der alkalischen Protease, wenn das Substrat Calciumacetat
in einer Menge von 5 x 10113 Mol enthält. Die Kurve 2 zeigt die Aktivität der alkalischen
Protease, wenn das Kulturmedium kein Calciumacetat
enthält. Die
Fig. 5 zeigt, daß die optimale Kulturtemperatur bei 600 C zu finden ist und daß
die Protease bei 0 80 C deaktiviert wird. Die Aktivität der Protease wird bemerkenswert
erhöht, wenn Calciumacetat im Reaktionsgemisch enthalten ist, wie dies durch die
Kurve 1 dargestellt ist, aber die optimale Kulturtemperatur wird nicht wesentlich
verändert, Die Aktivität der alkalischen Protease wurde durch ein Verfahren getestet,
das im-Buch "Method for the Investigation of Enzyme", Band 2, Seite 240 von Hagihara
(gedruckt durch Asakura Bookshope) angegeben ist. Die Protease wurde mit einer Lösung,
die Cäsein enthielt; bei einem pH-Wert von 10,0 und bei einer~Temperatur von 59
C gemischt. Das Casein wurde in Tyrosin hydrolisiert und das nicht-hydrolisierte
Casein wurde unter Verwendung des Fällungsmittels B ausgefällt, bei welchem es sich
um ein Gemisch aus 0,11 Mol CC13COOH, 0,22 Mol CH5COONa und 0,3) Mol CH3COOH handelt.
Da's Filtrat wurde auf die Lichtabsorption bei 257 v geprüft. Die Aktivität der
Protease wird durch die "Einheit" angegeben, bei der es sich um die Menge Tyrosin
( ) handelt, die in einer Minute gebildet wird.
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Fig. 4 zeigt die thermische Stabilität der alkalischen Protease.
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In Fig. 4 zeigt die Kurve 1, daß die Protease bei einer Temperatur
bis zu 550c 15 Minuten lang stabil ist, wenn das Reaktiongemisch Calciumacetat in
ether Menge von 5 x 10 1 Mol enthält und ein pH von 10,0 verwendet wird. Die Kurve
2 zeigt, daß die Protease bei einer Temperatur bis zu 500C stabil ist und daß die
Aktivität der Protease bei einer Temperatur oberhalb 5500 rasch verringert wird,
wenn das Kulturmedium kein Calciumacetat enthält, aber im übrigen unter den gleichen
Bedingungen wie bei Kurve 1 gehalten wird.
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Fig. 5 zeigt den Zusammenhang zwischen der Aktivität der alkalischen
Protease und dem pH-Wert, wenn das Reaktionsgemisch 22 Stunden auf 30°C gehalten
wird. Die Kurve 1 zeigt die Aktivität der Protease, wenn das Reaktionsgemisch Calciumacetat
in einer Menge von 5 x 10 3 Mol enthält, und die Kurve 2 zeigt die Aktivität der
Protease, wenn das Reaktionsgemisch kein Calciumacetat enthält. Aus den Kurven 1
und 2 geht hervor, daß die Protease bei einem pH-Wert im Bereich von 5,0 bis 11,0
stabil ist.
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Die Aktivität der alkalischen Protease der vorliegenden Erfindung
wird durch Schwermetallionen, wie z, B. Hg- und Cu-Ionen und insbesondere durch
Oxydationsmittel, wie z.B.
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Jod oder Diisopropylfluorophosphat (DEP) und Kartoffelinhibitor (potato-inhibitor)
beeinträchtigt. Die Aktivität der alkalischen Protease wird jedoch nicht durch Reddktionsmittel,
wie Cystein, Chelierungsmittel wie EDTA, Monojodessigsäure und einem SH-Reagenz
beeinträchtigt.
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Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele erläutert.
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Beispiel 1 Bacillus licheniformis (FERM-P 387, ATCC Nr. 21471) wurde
in 1 1 eines wäßrigen Kulturmediums (pH = 7,2) inkubiert, welches 1 ß Gluccose,
1 ffi Pepton, o,i ç Hefeextrakt, 0,2 % Natriumchlorid, 0,2 % Calciumchlorid, 0,05
% Kaliumphosphat, 0,01 % Magnesiumsulfat und 0,001 % von jeweils Eisen(II)-sulfat
und Mangansulfat enthielt. Der Bacillus licheniformis wurde unter Schütteln bei
50°C 72 Stunden lang kultiviert. Das erhaltene Kulturmedium enthielt die alkalische
Protease, die eine
Aktivität von 1.930 Einheiten je ml aufwies.
Das Kulturmedium wurde durch Verwendung einer Zentrifuge oder eines Filters entbakterisiert,
und dann wurde das Filtrat mit einer zu 80 ffi gesättigten Lösung von Ammoniumsulfat
gemischt, und das Gemisc; wurde ausgesalzt und dialysierte Die dialysierte Lösung
wurde durch eine Kolonne hindurchgeführt, die mit Duolite A-2-Harz (oder einem Anionenaustauschharz)
bepackt war, um Färbestoffe abzutrennen. Die entfärbte Lösung wurde einer Kolonnenchromatographie
unterworfen, wobei Carboxymethylcellulose und DEAE-Sephadex verwendet wurde. Hierauf
wurde die rohe Protease durch. das Gelfilblerungsvelfahren unter Verwendung von
Sephadex-75 abgetrennt, und die rohe Protease wurde durch ein Ausfällungsverfahren
behandelt, wobei Aceton verwendet wurde, um die gereinigte Protease herzustellen.
Die gereinigte Protease wurde getrocknet und gewogen. Es wurden 47 mg getrocknete
Protease mit einer Aktivität von 4.110 Einheiten je mg erhalten.
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Beispiel 2 Bacillus licheniformis des in Beispiel 1 angegebenen Stammes
wurde in 1 1 eines Kulturmediums (pH = 7,2) inkubiert, welches einen Extrakt enthielt,
der dureh Extrahieren von etfettetem Sojabohnenkuchen mit einer Lösung, die 4 ß
Alkali und 1 % lösliche Stärke enthielt, erhalten worden war. Der Bacillus licheniformis
wurde 40 Stunden lang bei 350 C unter Belüftung und Rühren kultiviert. Das erhaltene
Kulturmedium enthielt die alkalische Protease, die eine Aktivität von 4.400 Einheiten
je ml aufwies. Das Kulturmedium wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 behandelte
wobei 1,07 g der gereinigten Protease erhalten wurde die eine Aktivität von 4.110
Einheiten/ mE aufwies