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Verfahren und Vorrichtung zur Trennung gelöster Teilchen mit Hilfe
der zweidimensionalen Gel-Elektrophorese.
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Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Durchführung
dieses Verfahrens zur Trennung gelöster Teilchen mit Hilfe der zweidimensionalen
Gel-Elektrophorese.
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Das Hauptanwendungsgebiet der Erfindung liegt in der biochemischen
Borschung, wie z.B. in der Trennung von Eiweißen und eiweißähnlichen Stoffen. In
einem ebenfalls möglichen Anwendungsgebiet der Medizin werden die elektophoretisohe
T:r>ennrng von Proteinen urd Proteiden in Körper:fltissigkeit besonders im Blutserum
vorgerommen. Als Trenngele können alle Medien verwendet werden, die in flüssiger
Form eingebracht werden können und anschließend zum Gel erstarren, wie z.B. Agar-Gel,
Starkegel und inabesondere Polyacrylamidgel.
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Es sind schon zweidimensionale Elektrophoresesysteme bekannt geworden,
in denen in der ersten und zweiten Dimension der gleiche Puffer und das gleiche
Acrylamidgel verwendet werden.
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Mit diesen Verfahren können jedoch nur unzureichende Auftrenzungen
erzielt werden, da Uberlagerungen und Überlappungen yon Proteinen nicht vermieden
werden können. Auch konnten bisher Proteine verschiedener Bakterienstämme und verschiedener
Mutanten durch zweidimensionale Gel-Elektrophoreseverfahren nicht verglichen werden.
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Es istdaher Ziel der Erfindung, ein Verfahren zu entwickeln, das eine
weitest mögliche Auftrennung ähnlicher Teilchen, insbesondere von Eiweißen und eiweißähnlichen
Stoffen, ermöglicht, und eine Vorrichtung zur Durchführung dieses Verfahrens zu
entwickeln, die es ermöglicht, beliebig viele Teilchen unter absolut identischen
Bedingungen bei leichter Entnehmbarkeit der Gele gleichzeitig auf zutrennen.
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Dieses Ziel wird erfindungsgemäß dadurch erreicht, daß man die Stoffkonzentration,
die die Vernetzung des Gels bestimmt, und die Konzentration der Pufferlösung der
ersten Dimension ebenso wie diejenige des Probengels gegenüber dem Trenngel geringer
hält als die Stoffkonzentration und die Konzentration der Pufferlösung. der in dieser
Hinsicht entsprechend der ersten Dimension zueinander unterschiedlichen Proben-
und Trenngele der zweiten Dimension, daß man die Anpassung des gesamten Gels (Proben-
und Trenngel) der ersten Dimension an das Trenngel der zweiten Dimension in einem
an sich bekannten Dialyseverfahren so durchführt, daß man bei mindestens zweimaligem
Pufferwechsel mindestens dreimal gegen einen neuen Auftragpuffer dialysiert, daß
man das gesamte dialysierte Gel der ersten Dimension auf die Schmalseite einer Gelplatte,
die
mit einem Puffer gemischt ist, horizontal auflegt und mit dieser
polymerisiert und daß der Raum über und unter der Gelplatte mit Pufferlösungen gefüllt
wird.
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Die erMndungsgem.Vorrichtung zur Durchführung dieses Verfahrens ist
dadurch gekennzeichnet, daß der obere Teil der Vorrichtung aus hochkant gestellten,
kastenförmigen,in lösbarer Verbindung stehenden Einsätzen besteht, deren Schmalseiten
durch schmale Streifen gebildet werden, die in ihrer Mitte durch einen Zwischenboden
verbunden werden. Die eine große Fläche wird durch eine Trennwand gebildet, deren
Außenfläche bündig mit den Kanten der. schmaleii otreifea abschneidet, während die
gegenüberliegende Flache durch eine Trennwand gebildet wird, deren Außenflächen
gegen d>e Außenkanten der schmalen Streifen um einen Betrag zurückspringt, der
geringer ist als der Durchmesser der Probengele der ersten Dimension, wobei beide
Trennwände sich vom Boden soweit erstrecken, daß die Probengele von Pufferlösungen
bedeckt sind, und daß die außen liegenden Abschlußeinsätze zur seitlichen Begrenzung
des Anodenpuffergefäßes eine sich von detn Zwischenboden bis zu vorllen Höhe der
Einsätze erstreckende Gefäwand aufweisen.
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Damit die bei der Elektrophorese entstehenden Elektrolysegase entweichen
können,und für den zur Kühlung des Puffers nötigen Konvektionstrom sind die Schmalseiten
der kastenförmigen Einsätze bis dicht unterhalb des Zwischenbodens mit Löchern versehen.
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Um eine kompakte Bauweise der Vorrichtung zu erreichen, springen
die Schmalseiten der kastenförmigen Abschlußeinsätze zur Aufnahme der lösbaren Verbindungselemente
sämtlicher Einsätze unterhalb des Zwischenbodens zurück Damit für sämtliche Proben
möglichst gleiche Bedingungen herrschen, sind die Elektroden im Deckel so angeordnet,
daß sie genau über den Trennkammern sich über die ganze Breite des Anodenpuffergefäßes
erstrecken und bis dicht an die aufzutrennenden Proben heranreichen. Dagegen sind
die Elektroden
des Kathodenpuffergefäßes zur Vermeidung der Festsetzung
von Elektrolysegasen unter den mit Trenngel gefüllten Trennkammern jeweils versetzt
zwischen zwei Trennkammern dicht unterhalb des oberen Teils der Vorrichtung angeordnet.
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Die Speicherung und Auswertung der Gelplatten der zweiten Dimension
geschieht erfindungsgemäß in Auswertschablonen in Form von flachen horizontal übereinander
stapelbaren Kästen, in deren Boden ein Netzwerk angeordnet ist. Zur gleichzeitigen
Dialyse mehrerer Gelproben der ersten Dimension ist bevorzugt ein kammförmiger Einsatz,dessen
Zähne so ausgebildet sind, daß die Gelproben der ersten Dimension darin gehalten
werden, in einem Dialysierkasten vorgesehen.
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Die Vorteile der Erfindung bestehen insbesondere darin, daß duh die
geringere Stoffkonzentration (Acrylamidkonzentration)und -e ktrolytdie - konzentration
(Konzentration der Pufferlösung) der ersten Dimension gegenüber der Stoffkonzentration
und der Elektrolytkonzentration der zweiten Dimension eine Feinauflösung ermöglicht
wird, durch die geringste Unterschiede im Molekulargewicht und in der Aminosäurezusammensetzung
der Proteine zum Tragen kommen. Ein weiterer Vorteil besteht darin, daß durch die
Vorrichtung die gleichzeitige Auftrennung von mehreren Proben unter absolut identischen
Bedingungen möglich wird.
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Ein Ausführungsbeispiel der Erfindung ist in den Zeichnungen dargestellt
und wird im foigenden näher erläutert. Es zeigen: Fig. 1 eine der bisher bekannten
Vorrichtungen für die Elektrophorese in der ersten Dimension.
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Zig. 2 eine Dialysiervorrichtung.
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3 3 drei kastenförmige Einsätze des Oberteils iür die ^1eatrophorese
in der zweiten Dimension.
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Fig. 4 die Gel-Eiektrophoresevorrichtung für die zweite Dimension
mit 5 Trennkammern.
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Fig. 5 fünf stapelbare Einsatzrahmen für die Bärbung,Bntfärbung und
Lagerung der Gelplatten der zweiten Dimension.
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Fig. 1 zeigt eine an sich bekannte l-D-Gel-Elektrophoresevorrichtung,
in der mehrere Röhrchen 5 gleichzeitig elektrophoresiert werden können.
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Fig. 2 zeigt einen Dialysierkaslen 22, in den ein kammartiger Einsatz
21 und ein Maschenwerk 23 eingesetzt werden können. -Die Zähne des kammartigen Einsatzes
21 sind so angeordnet, daß mehrere Proben aus den Röhrchen 5 der l-D-Elektrophorese
darin getrennt voneinander liegen.
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In Fig. 3 sind drei kastenförmige Einsätze 1, 7 und 8 der 2-D-Vorrichtung
in auseinandergebautem Zustand dargestellt.
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Jeder der nach dem Baukastenprinzip zusammenzusetzenden kastenförmigen
Einsätze besteht aus zwei Schmalseiten 11 und 12, einer mit diesen abschließenden
Breitseite 4, einer um einen Betrag,der geringer ist als der Durchmesser der Probengele
sind der ersten Dimension, zurückspringenden Breitseite 3 und einem Zwischenboden
2. Die Schmalseiten 11 und 12 besitzen Bohrungen 24,für die sämtliche Einsätze zusammenhaltenden
lösbaren Verbindungselemente 13. Die Schmalseiten der Abschlußeinsätze springen
unterhalb des Zwischenbodens soweit zurück, daß die lösbaren Verbindungselemente
13 nur soweit über die Kante der Schmalseite hinausragen, daß das Oberteil in das
Kathodenpuffergefäß eingestellt werden-kann. Gefäßwände 9 und 10 dienen neben der
Verstärkung der Abschlußeinsätze 7 und 8 als Gefäßwand für das nnodenpuffergefäß.
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In Fig. 4 ist die 2-D-Vorrichtung mit Ober- und Unterteil dargestellt.
Das Oberteil besteht aus vier kastenförmigen Einsätzen 1 und zwei Abschlußeinsätzen
7 und 8, die die fünf Trennkammern 16 bilden. Die Trennkammern 16 liegen jeweils
zwischen einer gegenüber den Schmalseiten zurückspringenden Breitseite eines Einsatzes
und der daneben liegenden mit den Schmalseiten des anderen Einsatzes glatt abschließenden
Breitseite. Über den Trennkammern 16 liegen die im Deckel 15 angeordneten Elektroden
14. Das Unterteil besteht aus einem Kathodenpuffergefäß, in das das Oberteil bis
etwa in Höhe der Zwischenböden 2 eintaucht. Am Boden des Kathodenpuffergefäßes sind
die Elektroden 17 so angeordnet, daß sie jeweils'zwischen zwei Trennkammern 16 sich
über die gesamte Breite des Gefäßes erstrecken.
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In Fig. 5 sind die Einsatzrahmen 18 für die Geiplatten der zweiten
Dimension übereinandergestapelt. Sie bestehen aus einem Rahmen 19, der von einem
mit einem Netzwerk 20 versehenen Boden verstärkt wird.
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Das Prinzip des Verfahrens beruht auf der Überlegung, daß die Beweglichkeit
der Proteinteilchen bei der Elektrophorese von und der Eigenladung, der Molekülgröße
und -brm dir Proteine. abhängt.
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Die Eigenladung der Proteine hängt von dem pH-Wert des Puffers ab.
Dieses Verhalten ist durch die Dissoziationskurve des Proteins definiert. Das bedeutet:
ein Protein in Puffern verschiedener pH-Werte hat unterschiedliche Ladungen und
damit unterschiedliche Beweglichkeiten.
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Die Molekulgröße und Form ihrerseits haben eine definierte Beziehung
zur Acrylamiddichte- und -vernetzung des Gels. Bei Veränderung des Acrylamidgels
ergibt sich eine davon abhängige
Veränderung der Teilchenbeweglichkeit.
Ein großes Teilchen wird davon stärker als ein kleines betroffen. Bei zwei unterschiedlichen
Acrylamidkonzentrationen wird also ein Teilchen, bestimmt durch seine Größe und
Form, unterschiedlich beweglich sein.
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Die 2-D-Elektrophorese nützt die unterschiedlichen Trenneigenschaften
durch die Variation der oben geschilderten Parameter aus und macht damit eine Feinauflösung
möglich. So werden zum Beispiel ribosomale Proteine in der ersten Dimension bei
pH = 8.6, 4 - 8% Acrylamidgel, in der zweiten Dimension bei pH = 4.6, 18% Acrylamidgel
aufgetrennt.
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Eine Voraussetzung für gute Trennung im Acrylamidgel ist die "Schärfung"
der aufgetragenen Proteine in einer möglichst dünnen Startzone. Diese Konzentration
der Proteine aus dem gesamten Probengel in einer dünnen Schicht in der oberen Zone
des Trenngels wird durch zwei Faktoren erreicht 1. Die Acrylamidkonzentration des
Probengels ist geringer als die des Trenngels.
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2. Die Elektrolytkonzentration des Probengels ist geringer als die
des Trenngels.
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Diese Unterschiede zwischen Proben- und Trenngel bewirken, daß die
Proteine sich in dem Probengel mit höherer Geschwindigkeit als im Trenngel bewegen.
Damit wird ein Konzentrationseffekt der aufgetragenen Proteine in der oberen Zone
des Trenngels erreicht.
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Für die erste Dimension sind die Acrylamidkonzentrationen und Puffer
der Trenn- und Substanzgele leicht nach den geschilderten Gesichtspunkten auszuwählen
und zu präparieren.
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Für die zweite Dimension wird das gesamte Gel der ersten Dimension
(Probengel und die beiden Trenngele) als Startgel benutzt. Entsprechend wird die
Acrylamidkonzentration des Trenngels der ersten Dimension niedriger als die des
Trenngels der zweiten Dimension gewählt. Die Anpassung an den richtigen Puffer,
in Bezug auf den pH-Wert und die Leitfähigkeit wird durch Dialyse des l-D-Gels gegen
den neuen Auftragpuffer erreicht. Bei dieser Dialyse werden die Ionen des Puffers
ausgetauscht, die Proteine bleiben jedoch im 1-1)-Gel fixiert.
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Wenn verschiedene Protelngemische elektrophoretisch verglichen werden
sollen, so geschieht das am einfachsten. in einem System, das den gleichzeitigen
Auftrag von mehreren Gemischen gestattet. Das Elektrophoresesystem wird mit Acrylamid
des gleichen Ansatzes gefüllt. DieElektrophoresierzeit--- und -spannung sind dann
für alle Startgemische identisch. Damit werden die Elektropherrcgramme absolut vergleichbar.
Diese Bedingungen sind mit der Mehrkammervorrichtung nach der Erfindung erfüllt.
Je nach der Anzahl der Proben kann die Vorrichtung auf die entsprechende Kammerzahl
durch Herausnehmen von kastenförmigen Einsätzen reduziert oder durch Hinzufügen
auf z.B. 5 Kammern, erweitert werden.
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Die Wirkungsweise der Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens
ist die folgende; Erste Dimension In einer bekannten , abgewandelten Apparatur wird
die erste Dimension in 18 cm langen Glasröhren elektrophoresiert.
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Das Probengel wird in der Mitte der Trenngele einpolymerisiert.
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Nach 36 h bei 90 V wird der Lauf abgebrochen und das Gel durch Glycerineinspritzen
aus dem Glasrohr entfernt.
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Dialyse: Das Gel aus der ersten Dimension wird danach in einer mit
einem kammförmigen Einsatz 21 versehenen Dialysevorrichtung 22 gegen den neuen Auftragpuffer
3 x 45 Minuten bei zweimaligem Pufferwechsel dialysiert.
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Zweite Dimension Die einzelnen kastenförmigen Einsätze 11, 7 und
8 des Oberteils der Vorrichtung werden durch Schraubenbolzen 13 so fixiert, daß
die einzelnen Einsätze zwischen sich Trennkammern 16 für Gelplatten bilden. Das
gesamte Oberteil wird in ein flaches Gießgefäß gestellt, das vorher ca. 1 cm hoch
mit dem Trenngel der zweiten Dimension gefüllt wurde. Nach dem Polymerisieren des
Gels sind die Trennkammern des Oberteils nach unten fest verschlossen. Nun können
mit Hilfe eines Trichters und Schlauches die Trennkammemmit Acrylamidpuffer-Gemischn
gefüllt werden. Dabei ist auf ein luftblasenfreies Einfüllen zu achten. Nach diesem
Vorgang wird das dialysierte Gel der ersten Dimension als Startgel der zweiten Dimension
horizontal auf die Trennkammem aufgelegt. Dabei kann das dialysierte Gel der ersten
Dimension nicht in die Trennkammernhineinfallen, da der Innendurchmesser der Röhrchen
aus der ersten Dimension etwas größer dimensioniert ist als die Dicke der Trennkammern
16. Nachdem die Startgele an die Trenngele anpolymerisiert sind, entnimmt man das
Oberteil der 2-D-Apparatur.Eathoden- und Anodenpuffergefß werden mit Puffer gefüllt.
Der Deckel 15 m1t den Anoden 14 werden aufgesetzt und anschließend bei einer Spannung
von 105 V wird 26 Stunden lang elektrophoresiert.
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Die Kathoden im Unterteil sind so angeordnet, daß aufsteigende Elektrolysegase
sich nicht unter den Gelen festsetzen können. Durch Bohrungen an den Schmalseiten
der kastenförmigen Einsätze unterhalb der Zwischenböden 3 kann das Elektrolysegas
entweichen. Größere Öffnungen an den Schmalseiten der Einsätze
gestatten
eine Umwälzung des Puffen durch Konvektionsströmung.
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Auf ein Umwälzen des Puffers kann verzichtet werden, da die Volumina
so gewählt worden sind, daß die Pufferkapazität für einen Lauf ausreicht. Eine Kühlung
des Systems wird aufgrund der niedrigen Spannung nicht notwendig. Nach Beendigung
des Laufes werden die Bolzen 13 aus dem Oberteil entfernt und die Gelplatte durch
Abheben der einzelnen Einsätze entnommen. In Einsätzen stapelbaren werden die Gelplatten
aufgenommen, gefärbt, entfärbt und aufbewahrt. Mit Hilfe einer Auswertschablone,
die am Boden der Kästen angebracht ist, kann die Position der angefärbten Proteinflecke
bestimmt werden.
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Die Auftrennung in der zweiten Dimension kann auch in SDS (Sodiumdodecylsulfat)
- Gelen erfolgen. Zu diesem Zweck inkubiert man die Gele der ersten Dimension in
SDS-Auftragspuffer. Wenn gleichzeitig Referenz-Proteine angesetst-werden, ist daraus
eine Molekulargewichtsbestimmung möglich.