DE2056538A1

DE2056538A1 - In organischen Losungsmitteln los hches Derivat von Cephalosporin C und seine Herstellung aus Cephalosporin C

Info

Publication number: DE2056538A1
Application number: DE19702056538
Authority: DE
Inventors: Harold Bernard Huff Gerald Lee Indianapolis Ind Hayes (V St A) P
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1969-12-17
Filing date: 1970-11-17
Publication date: 1971-06-24
Also published as: FR2073473B1; AT301028B; IE34559L; GB1324419A; CA968350A; SU423303A3; IE34559B1; ES385447A1; BE759064A; US3739002A; IL35682A0; RO56806A; ZA706649B; NL7016789A; CS161893B2; IL35682A; CH548418A; FR2073473A1

Description

DR. I. MAAS

DR. W. PFEIFFER DR. F-VOfTHENLEITNER

8 MÜNCHEN 23 UNQERERSTR. 25 - TEL 39 02 36

83 622 ^-^

Eli Lilly and Company, Indianapolis, Indiana/ V.St.A.

In organischen Lösungsmitteln lösliche! Derivat von Cephalosporin C und seine Herstellung aus Cephalosporin C

Die Erfindung betrifft ein Verfahren, durch das Cephalosporin C durch Acylierung der Aminogruppe in der Adipoy!seitenkette mit einer alpha-Halogen- oder alpha,alpha-Dihalogen-C₂-C,-alkanoylgruppe in ein in organischen Lösungsmitteln lösliches Derivat Übergeführt wird. Dieses in Lösungsmitteln lösliche Derivat kann dann aus der wässrigen Fermentationsmischung leicht und wirksam durch Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel gewonnen werden.

. Die löslich machende niedere Halogenalkanoylgruppe, die für die erfindungsgemäßen Zwecke verwendet wird, stammt von einer C₂-C^-Carbonsäure mit einem oder zv/ei Halogenatomen an dem alpha-Kohlenstoffatom. Das bevorzugte Halogen ist Chlor, andere Halogene, zum

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Beispiel Brom und Fluor, können jedoch ebenfalls verwendet werden. Zu Beispielen für geeignete löslich machende Gruppen gehören die Chloracetyl-, Dichloracetyl-, Bromacetyl-, Fluoracetyl-, alpha-Chlorpropionyl-, alpha,-alpha-Dichlorpropipnyl-, alpha-Chlorbutyryl- und alpha-Chlor-alpha-methylpropionylgruppe. Die Chloracetylgruppe wird bevorzugt.

Um die löslich machende Gruppe an der Seitenkettenaminogruppe von Cephalosporin C anzubringen, werden übliche Acylierungsmethoden angewandt, die dem Fachmann bekannt sind. Die Acylierung kann mit einem Halogenalkanoylhalogenid oder einem Anhydrid der Halogensäure durchgeführt werden. Besonders gute Ergebnisse wurden mit einem Halogenalkanoylchlorid wie Chloracetylchlorid erzielt, überraschenderweise wird bei Verwendung eines gemischten Anhydrids von Chloressigsäure, zum Beispiel Essigsäure-Chloressigsäure-Anhydrid, fast ausschließlich N-Chloracety!cephalosporin C erhalten.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Umwandlung von Cephalosporin C in ein in organischen Lösungsmitteln lösliches Derivat, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die Aminogruppe in der Adipoylseitenkette von Cephalosporin C mit einer alpha-Halogen- oder alpha,alpha-Dihalogen-C^-C^-alkanoylgruppe acyliert.

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein in organischen Lösungsmitteln lösliches Derivat von Cephalosporin C der Formel

O S

HO C-CH	(CH₂)	I CO₂H	CH₂	0
I		I	11
RNH		C-CH	₂OCCH₃

ι₃CNH-CH-CH
I I
O=C-N>.

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worin R eine alpha-Halogen- oder alpha,alpha-Dihalogen-C₂-C.-alkanoylgruppe bedeutet.

Die Umwandlung von Cephalosporin C in ein in organischen Lösungsmitteln lösliches Derivat dient hauptsächlich dazu, die Isolierung von Cephalosporin C aus der Fermentationsmischung zu erleichtern. Zu diesem Zweck ist es erforderlieh, die Acylierungsreaktion in der Fermentationsmischung durchzuführen, was leicht erreicht'werden kann. Die Fermentationsflüssigkeit wird vor der Acylierungsstufe vorzugsweise filtriert und kann außerdem eingeengt werden, um den Umgang mit großen Volumenmengen Wasser zu vermeiden.

Dieses N-Halogenalkanoylcephalosporin C kann nunmehr aus der Fermentationsflüssigkeit mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel extrahiert werden. Mit dem Ausdruck "mit Wasser nicht mischbar" ist ein Lösungsmittel mit begrenzter Löslichkeit in Wasser und nicht notwendigerweise ein völlig unlösliches gemeint. Beispielsweise ist Äthylacetat, das in Wasser etwas löslich ist, ein ausgezeichnetes Lösungsmittel für diese Extraktion. Die Extraktion wird vorzugsweise bei einem sauren pH-Wert durchgeführt.

Organische Lösungsmittel, die in der Extraktionsstufe verwendet werden können, sind niedere Ester, zum Beispiel Äthylacetat, n-Propylacetat, Isopropylacetat und sec.-Butylacetat. Manchmal ist es vorteilhaft, den Ester mit 1/10 bis 1 Volumenteil eines niederen Alkanols, zum Beispiel Äthylalkohol oder n-Butylalkohol, zu vermischen. Andere geeignete Lösungsmittel sind Nitrile, zum Beispiel Butyronitril und Adiponitril, und Ketone, zum Beispiel Cyclohexanon und Methylisobutylketon. Die bevorzugten Lösungsmittel sind Äthylacetat, Butyronitril und Cyclohexanon.

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Das N-Halogenalkanoylcephalosporin C kann von dem organischen Lösungsmittel nach jeder bekannten Methode getrennt werden; Beispielsweise kann die Lösung alkalisch gemacht werden, um ein Salz des Cephalosporin C-Derivats zu erzeugen, das sich aus dem organischen Lösungsmittel beim Rühren, vorzugsweise unter Kühlen der Lösung, abscheidet. Mit diesem isolierten Derivat kann dann eine Seitenkettenabspaltungsreaktion zur Gewinnung von 7-Aminocephalosporansäure durchgeführt werden. Es ist auch möglich, die Spaltungsreaktion in dem für die Extraktion verwendeten organischen Lösungsmittel durchzuführen, so daß eine Isolierung des N-Halogenalkanoylcephalosporins C nicht notwendig ist.

Durch die folgenden Beispiele wird die Herstellung der löslichen Cephalosporin C-Derivate und ihre Extraktion aus der wässrigen Fermentationsflüssigkeit erläutert. Für diese Versuche wurden zwei Methoden zur Analyse der Cephalosporin C-Aktivität angewandt. Die erste Methode ist eine Ultraviolettmethode, die nicht nur Cephalosporin C, sondern auch andere verwandte Stoffe erfaßt, die mit dem Acylierungsreagens reagieren. Die zweite Methode ist eine Nikotinamidmethode, die für Cephalosporin C spezifischer ist. Die Ergebnisse dieser zweiten Methode werden zur Berechnung von Ausbeuten verwendet.

Beispiel 1

Durch Ultraviolettanalyse wird nachgewiesen, daß ein Liter Cephalosporin C-Fermentationsflüssigkeit, die filtriert und mit Ionenaustauschharz behandelt worden ist, 89 g Cephalosporin C-ähnliches Material enthält und durch Nikotinamidanalyse wird ein Gehalt von 75,25 g Cephalosporin C gefunden. Dieser Liter

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Fermentationsflüssigkeit· wird mit einem Liter gesättigter Natriumbicarbonatlösung, die 25 ml 25 prozentige Natriumhydroxidlösung enthält, und 500 ml Aceton ver-i setzt. In einer Zeit von 15 Minuten werden 500 ml einer Lösung von 72 ml Chloracetylchlorid in Aceton zugegeben. Während dieser Zugabedauer wird der pH-Wert zwischen 8,0 und 8,7 gehalten, und die Temperatur der Reaktionsmischung wird mit einem Eisbad im Bereich von 20 bis 28 Grad C gehalten.. Nach beendeter Zugabe wird die Reaktionsmischung weitere 15 Minuten lang gerührt. Das Gesamtvolumen der Reaktionsmischung beträgt 3070 ml.

1520 ml dieser ursprünglichen Reaktionsmischung werden mit 300 ml Benzol versetzt, und der pH-Wert der Mischung wird durch Zugabe von 135 ml 6n Salzsäure auf 3,5 eingestellt. Die Phasen werden getrennt, und das Benzol wird verworfen, wobei 1220 ml wässrige Lösung zurückbleiben. Dieses Volumen von 1220 ml wird in zwei gleiche Anteile geteilt, die als Lösung Al und A2 bezeichnet werden sollen.

Lösung Al wird mit einer gleichen Volumenmenge Äthylacetat versetzt, und der pH-Wert wird durch Zugabe von 6n Salzsäure auf 2,0 eingestellt. Die Phasen werden getrennt, und es wird eine zweite Extraktion mit dem gleichen Volumen Äthylacetat durchgeführt. Nach Vereinigen der Äthylacetatextrakte und Trocknen über Natriumsulfat liegen 1200 ml Äthylacetatlösung vor, die aufgrund der Ultraviolettanalyse 11,5 g Aktivität enthalten. Die Äthylacetatlösung wird mit 16,6 ml Chinolin versetzt, und die Mischung wird angeimpft. Die Mischung wird über Nacht bei Raumtemperatur ge~ rührt und dann vor dem Filtrieren abgekühlt. Das feste Produkt wird mit 25 ml Aceton gewaschen und in einem Vakuumofen getrocknet, wodurch 18,9 c/ des c:..ir.oLLnr:c.l-oj vor. Ii Ti >.r .- <.-: . · y «..-iiplui i^^os: La C or-

BAD ORIGINAL

Lösung A2 wird mit 200 ml Aceton und 810 ml Äthylacetat versetzt. Der pH-Wert wird mit 6n Salzsäure auf 2,0 eingestellt, und die Phasen werden getrennt. Nach Trocknen der Äthylacetatlösung über Natriumsulfat liegen 1080 ml Äthylacetatextrakt vor, die aufgrund der Ultraviolettanalyse 12,9 g Aktivität enthalten. Diese Lösung wird mit 18,6 ml Chinolin versetzt, und die Mischung wird angeimpft. Die Mischung wird über Nacht gerührt und vor dem Abfiltrieren der Feststoffe abgekühlt. Das feste Produkt v/ird mit Aceton gewaschen und in einem Vakuumofen getrocknet, wodurch 17,8 g des Chinolinsalzes von N-Chloracetylcephalosporin C erhalten werden.

Weitere 1520 ml der ursprünglichen Reaktionsmischung werden mit einem gleichen Volumen Äthylacetat behandelt, der pH-Wert wird durch Zugabe von 235 ml 6n Salzsäure auf 2,0 eingestellt, und die Phasen werden getrennt. Mit einer gleichen Volumenmenge Äthylacetat wird eine zweite Extraktion durchgeführt. Die vereinigten Äthylacetatextrakte haben ein Volumen von 3000 ml und enthalten aufgrund der Ultraviolettanalyse 30,9 g Aktivität.

Beispiel 2

Ein Liter mit Harz behandelte Cephalosporin C-Fermentationsflüssigkeit, die 32,5 g Aktivität aufgrund der Ultraviolettanalyse und 26,15 g Aktivität aufgrund der Nikotinamidanalyse enthält, wird mit 300 ml Aceton und 100 g trockenem Natriumbicarbonat versetzt, während die Mischung in einem Eisbad bei 10 Grad C gehalten wird. Der pH-Wert wird durch Zugabe von 25 prozentiger Natriumhydroxidlösung auf 8,5 eingestellt. Unter fortgesetztem Kühlen wird eine Lösung von 45 ml Dichloracetylchlorid in 255 ml Aceton während einer Zeit von 15 Minuten zu der Reaktionsmischung gei/:.:'^:,■ >»-,. '-/"hren-i ..'^-r .iwa:>'·:-.. -.Mr-I .-!■.■■' ■,■,ix-Vi^rt durch Zusatz

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von 25 prozentiger Natriumhydroxidlosiing bei 8,0 bis 8,8 gehalten. Nach beendeter Zugabe wird die Mischun-g aus dem Eisbad herausgenommen und 20 Minuten bei 20 Grad C gerührt. Dann wird der pH-Wert mit 6n Salzsäure auf 3,5 eingestellt und werden 1700 ml Äthylacetat zur Extraktion zugegeben, während der pH-Wert, mit 6n Salzsäure weiter auf 1,9 eingestellt wird. Diese Mischung wird 15 Minuten lang gerührt und zur Trennung zentrifugiert. Die Äthylacetatphase hat ein Volumen von 1940 ml und enthält aufgrund der Ultraviolettanalyse 12,8 g Aktivität. Der Äthylacetatextrakt wird ä mit 41 ml Chinolin in zwei ungefähr gleichen Anteilen versetzt, und die Mischung wird angeimpft. Nach Stehen im Kühlschrank über das Wochenende wird die Mischung filtriert. Die Feststoffe werden mit Aceton gewaschen und" bei 35 Grad C in einem Vakuumofen getrocknet, wodurch 20,6 g des Chinolinsalzes von N-Dichloracetylcephalosporin C erhalten werden.

Beispiel. 3

Die Arbeitsweise von Beispiel 2 wird unter Austausch des Dichloracetylchlorids gegen 2-Chlorpropionylchlorid wiederholt. Die Temperatur steigt während der Zugabe auf 40 Grad C, und der pH-Wert ist schwer zu steuern und schwankt zwischen 7,5 und 9,3. Als Produkt der Umsetzung wird das Chinolinsalz von N-(2-Chlorpropionyl) cephalosporin C erhalten.

Beispiel 4

Nach der Arbeitsweise von Beispiel 2 werden mit 4400 ml Fermentationsflüssigkeit, die aufgrund der Ultraviolettanalyse 145 g Aktivität enthält, und

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133 ml Chloracetylchlorid 11800 ml Äthylacetatextrakt erhalten, der 123,4 g N-Chloracetylcephalosporin C enthält.

Beispiel 5

Vier Liter filtrierte Fermentationsflüssigkeit mit einem pH-Wert von 4,4, die aufgrund der Nikotinamidanalyse 5,77 mg Cephalosporin C pro ml enthält, werden in einem Eisbad abgekühlt. Diese kalte Flüssigkeit wird

P mit 20 g Natriumboratdecahydrat und 1200 ml Aceton versetzt. Der pH-Wert dieser Mischung wird durch Zugabe von 25 prozentiger Natriumhydroxidlösung auf 8,5 eingestellt. Die abgekühlte Mischung wird langsam mit einer Lösung von 74 ml Chloracetylchlorid in 600 ml Aceton versetzt, wobei der pH-Wert bei 8,5 gehalten wird. Nach beendeter Zugabe wird die Mischung weitere 30 Minuten lang gerührt und dabei bei pH 8,5 gehalten. Der pH-Wert wird durch Zugabe von 25 prozentiger Schwefelsäure auf 4,5 vermindert, 6800 ml Äthylacetat werden zugesetzt, und durch Zugabe von weiterer Schwefelsäure wird der pH-Wert auf 2,0 gesenkt. Nach 15 Minuten

fc langem Rühren hat sich eine Emulsion gebildet, und es findet keine Trennung der Phasen statt. Die Emulsion wird mit 200 ml Aceton und 150 ml eines handelsüblichen Demulgators versetzt. Die Phasen werden getrennt, und es wird eine zweite Äthylacetatextraktion der wässrigen Phase mit 1 Liter Äthylacetat durchgeführt. Die vereinigten Äthylacetatextrakte haben ein Gesamtvolumen von 9,6 Liter. Dieses Volumen wird auf 4,5 Liter eingeengt und auf zwei Bechergläser verteilt. In jedes Becherglas werden 70 ml Chinolin gegeben, und die Mischung wird über Nacht gerührt. In einem Becherglas bilden sich Kristalle, während sich in dem anderen ein öl abgeschieden hat. Die überstehende Flüssigkeit

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) wird von dem öl abdekantiert und angeimpft. Dann wird ' die Lösung eingeengt, bis sich Peststoffe zu bilden, beginnen. Die Mischung wird mit der Hälfte vereinigt,

^: in der bereits vorher Kristallbildung stattgefunden hatte. Die Mischung wird eine Stunde lang gerührt und

ι gekühlt und dann filtriert. Das feste Chinolinsalz von ι N-Chloracetylcephalosporin C wird mit einer kleinen j Menge Aceton gewaschen und in einem 40 Grad C Vakuum- - ofen getrocknet, wodurch 15,3 g dieses Produkts erhalten werden.

Beispiel 6

10 Liter filtrierte Fermentationsflüssigkeit werden auf pH 6,2 eingestellt und in einem Schnellverdampfer auf 1,8 Liter eingeeengt. Die Ultraviolettanalyse ergibt, daß diese konzentrierte Flüssigkeit 46,5 g Cephalosporin C-Aktivität pro Liter enthält. Die konzentrierte filtrierte Flüssigkeit wird in einem Eisbad abgekühlt und mit 18 g Natriumboratdecahydrat und 54Q ml Aceton versetzt. Der pH-Wert wird mit 25 %-iger Natriumhydroxidlösung auf 8,5 eingestellt. Dann wird langsam eine Lösung von 56,5 ml Chloracetylchlorid in 4085 ml Aceton zugegeben, während der pH-Wert durch Zugabe von 25 prozentiger Natriumhydroxidlösung bei 8,5 bis 9,0 gehalten wird. Nach beendeter Zugabe wird die Mischung 15 Minuten lang gerührt. Die Mischung wird mit 1530 ml Äthylacetat versetzt, und dor pH~Wert wird mit 25 prozentiger Schwefelsäure auf 2,0 eingestellt. Die Mischung wird 15 Minuten lang gerührt, und die Phasen werden durch Zentrifugation getrennt. Es wird eine zweite Extraktion mit 1500 ml Äthylacetat durchgeführt, und die beiden Äthylacetatextrakte werden zu einem Gesamtvolumen von 3825 ml vereinigt. Die vereinigten Extrakte werden auf 750 ml eingeengt und mit 1 Liter Äthylacetat, das

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mit Wasser gesättigt ist, versetzt. Es werden 100 ml Chinolin zugegeben, die Mischung wird im Kühlschrank, ge-' kühlt und dann filtriert, und der Feststoff wird mit 200 ml Aceton gewaschen.und bei 40 Grad C in einem Vakuumofen über Nacht getrocknet, wodurch 51,8 g des Chinolinsalzes von N-Chloracety!cephalosporin C erhalten werden.

Beispiel ' 7

Der pH-Wert einer Lösung von 4,6 g des Natriumsalzes von Cephalosporin C mit einer Reinheit von 89 % in 30 ml Wasser wird durch Zugabe von 20 prozentiger Natriumhydroxidlösung auf 9,0 eingestellt. Eine Lösung von 1,3 ml Chloracetylchlorid in 8,7 ml Aceton wird tropfenweise zugegeben, während der pH-Wert durch Zugabe von 10 prozentiger Natriumhydroxidlösung bei 8,0 bis 9,3 gehalten wird. Die Zugabe erfordert etwa 15 Minuten, und die Mischung wird dann weitere 5 Minuten lang gerührt. Hierauf wird der pH-Wert mit 6 η Salzsäure auf 6,5 eingestellt, 80 ml Äthylacetat werden zugesetzt, und der pH-Wert wird mit 6n Salzsäure auf 2,0 vermindert. Nach 5 Minuten langem Rühren werden die Phasen getrennt, und die Äthylacetatphase wird über Natriumsulfat getrocknet. Eine gesättigte methanolische Lösung von Natriumacetat wird bis zu einem pH-Wert von 7,2 zugegeben, der beim Rühren auf 7,7 ansteigt. Der weiße Feststoff, der sich abscheidet, wird abfiltriert, gewaschen und in einem Exsikkator über Nacht getrocknet, wodurch 2,5 g des Natriumsalzes von N-Chloracetylcephalosporin C erhalten werden.

Die in organischen Lösungsmitteln löslichen Derivate von Cephalosporin C haben die Formel:

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HO₂C-CH(CH₂J₃CNH-CH-CH CH₂ 0 ι Ii ι ti

RNH O=C-Ν_ν ^C-CH_nOCCH.

CO₂H

worin R eine alpha-Halogen- oder alpha,alpha-Dihalogen-C₃-C₄-alkanoylgruppe bedeutet. Das bevorzugte Halogen ist Chlor, und die bevorzugte Halogenalkanoylgruppe ist die Chloracetylgruppe.

Außer in Form der freien Säuren, wie sie in der vorstehenden Formel dargestellt sind, wurden diese Derivate auch in Form von Salzen erhalten. Diese Salze können die Alkalimetall-, Erdalkalimetall- oder Aminsalze der Carbonsäuren sein. Typis'che Amine, die zur Salzbildung verwendet wurden, sind Chinolin, Cyclohexylamin, 5-Äthyl-2-methylpyridin, 2-Picolin, 3-Picolin, 4-Picolin, N-Äthylmorpholin, N-Methylmorpholin, 2,6-Lutidin, N,N-Diäthylcyclohexylamin, Hexamethylentetramin, N,N-Dimethylbenzylamin oder Ν,Ν'-Dibenzyläthylendiamin.

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Claims

Patentansprüche

IJ Verfahren zur Umwandlung von Cephalosporin C in ein in organischen Lösungsmitteln lösliches Derivat, dadurch gekennzeichnet, daß man die Aminogruppe in der Adipoylseitenkette von Cephalosporin C mit einer alpha-Halogen- oder alpha_/alpha-Dihalogen-C₂-C₄-alkanoylgruppe acyliert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Halogen Chlor verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Alkanoylgruppe die Chloracetylgruppe verwendet.
4. Verfahren nach Anspruch 1,2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Acylierung in der wässrigen Fermentationsflüssigkeit durchführt.

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5. In organischen Lösungsmitteln lösliches Derivat von Cephalosporin C, gekennzeichnet durch die Formel

HO₂C-CH(CH₂)₃CNH-CH-CH

"2 O

RNH O=C—N C-CH_nOCCH

C "
CO₂H

worin R eine alpha-Halogen- oder alpha,alphä-Dihalogen-C₂-C₄-alkanoylgruppe bedeutet.
6. Verbindung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß Chlor das Halogen ist.
7. Verbindung nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß R die Chloracety!gruppe bedeutet.

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