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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 7-Aminocephalosporansäure (7-ACA) und-ester der Formel
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worin Ri für Wasserstoff oder einen Esterrest steht, durch chemische Abspaltung der Acylseitenkette von Cephalosporinderivaten, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Cephalosporinderivat der Formel
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worin Rl obige Bedeutung besitzt, R2 und Rs gleich oder verschieden sein können und jeweils für Wasserstoff, die Nitro-, die Cyano- oder eine niedere Alkoxycarbonylgruppe stehen, verwendet.
Die Verbindungen der Formel (II) sind neu und können erhalten werden, indem man eine Verbindung der Formel
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worin R, obige Bedeutung besitzt, mit einer Verbindung der Formel
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worin R2 und Ra obige Bedeutung besitzen und R, für eine niedere Alkylgruppe steht, umsetzt.
Dieses Verfahren kann in einem unter den Reaktionsbedingungen inerten Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch, z. B. in wässerigem Medium oder in einem Gemisch von Wasser und einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel wie Alkohol oder Aceton, vorzugsweise in Wasser bei einer
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so kann die Verbindung auch als Salz, z. B. als Alkalimetallsalz eingesetzt werden. Steht R, für eine Estergruppierung, so kann dies beispielsweise die Trialkylsilyl-oder Benzhydrylgruppe sein.
Wie an sich bekannt, bereitet die Gewinnung und Isolierung stark hydrophiler Antibiotika, wie Cephalosporin C, Schwierigkeiten. Das Antibiotikum muss entweder durch eine Reihe von aufwendigen Adsorptions- und/oder Chromatographieschritten gereinigt oder durch chemische Derivierung an der freien Aminogruppe der Seitenkette in ein bei saurem PH-Wert extrahierbares Derivat überführt werden. Die chemische Derivierung wird in der Regel durch Acylierung mit Säurechloriden
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durchgeführt, die wegen der vorliegenden wässerigen Lösung in grossem Überschuss eingesetzt werden müssen. Dadurch können Nebenreaktionen eintreten und die Isolierung reiner Antibiotika muss mit grossem Aufwand erfolgen.
Es wurde nun gefunden, dass die Verbindungen der Formel (II) aus Kulturfiltraten rasch und in ausgezeichneten Ausbeuten erhalten werden können. Von besonderem Vorteil dabei ist, dass die Olefine der Formel (IV) gegen Hydrolyse mit Wasser weitgehend stabil sind, so dass nicht wie bei den bisher üblichen Verfahren ein grosser Überschuss eingesetzt werden muss. Dadurch treten, wenn überhaupt, Nebenreaktionen nur in sehr geringem Ausmass ein. Die Verbindungen der Formel (II) lassen sich nun in ausgezeichneten Ausbeuten isolieren und nach an sich bekannten Verfahren zur 7-Aminocephalosporansäure spalten.
Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemässen Verfahrens liegt vor allem in den Gesamtausbeuten, ausgehend von Cephalosporin C im Kulturfiltrat bis zur isolierten 7-ACA, welche bei 72 bis 75% betragen im Gegensatz zu den bisher bekannten Verfahren, deren Ausbeuten bei maximal 45 bis 55% liegen.
In den nachfolgenden Beispielen, die die Erfindung erläutern, ihren Umfang aber in keiner Weise einschränken sollen, erfolgen alle Temperaturangaben in Celsiusgraden.
Beispiel 1 : 7-Aminocephalosporansäure (7-ACA)
2, 85 g N- (2-Nitro-2-carbäthoxy) vinyl (1) cephalosporin C werden in 150 ml trockenem Dichlormethan suspendiert und zu dieser Suspension werden 3, 02 ml Pyridin zugesetzt, wobei Lösung eintritt. Nun werden 5, 02 ml Trimethylchlorsilan zugegeben und 2 h bei 300 weitergerührt. Anschliessend wird auf -120 gekühlt und weitere 6, 34 ml Pyridin zugesetzt. Nun wird eine Lösung von 4, 15 g Phosphorpentachlorid in 50 ml trockenem Dichlormethan so zugetropft, dass die Tempera-
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tur nicht über -100 steigt. Es wird hierauf noch 30 min bei -100 und 30 min bei Raumtemperatur weitergerührt.
Der Ansatz wird einrotiert, der Rückstand in 10 ml 50% Ameisensäure aufgenommen, deren PH-Wert vorher durch Zugabe von Triäthylamin auf 2 eingestellt worden war. Es wird nun 45 min bei Raumtemperatur weitergerührt, dann durch Zugabe von Triäthylamin ein PH-Wert von 3, 3 eingestellt und mit wenig 7-ACA angeimpft. Die Titelverbindung kristallisiert beim Stehen im Kühlschrank über Nacht aus, sie wird abgesaugt, mit Dichlormethan und Äther gewaschen und im Exsikkator getrocknet. Ausbeute : 86% d. Th.
Beispiel 2 : 7-Aminocephalosporansäure (7-ACA)
In gleicher Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben, werden 2, 93 g N- (2, 2-Dicarbäthoxy) vinyl- (l) cephalosporin C zu 7-Aminocephalosporansäure gespalten. Man erhält die Titelverbindung in ausgezeichneter Reinheit. Ausbeute : 97% d. Th.
Beispiel 3 : 7-Aminocephalosporansäurebenzhydrylester
4, 46 g bis-Benzhydrylester des N-92-Nitro-2-carbäthoxy)vinyl(1)cephalosporin C werden in 35 ml trockenem Dichlormethan gelöst und 4, 03 ml Pyridin zugesetzt. Diese Lösung wird auf-20 gekühlt und unter Rühren eine Lösung von 2, 4 g Phosphorpentachlorid in 50 ml trockenem Dichlor-
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mal zugesetzt, wobei die Temperatur auf 00 ansteigt. Es wird nun 30 min bei-10 und 1 h bei Raumtemperatur nachgerührt. Zu diesem Ansatz werden in einem Guss 100 ml eisgekühlte 1 n Salzsäure gegeben und 45 min bei 00 weitergerührt. Durch Zugabe von 2 n NaOH wird nun ein PH von 8 eingestellt und die wässerige Phase abgetrennt.
Die organische Phase wird getrocknet und
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:N- (2, 2-Dicarbäthoxy) vinyl (l) cephalosporin C zu 7-Aminocephalosporansäurebenzhydrylester gespalten. Ausbeute : 83% d. Th.
Beispiel 5 : 7-Aminocephalosporansäure (7-ACA)
2, 79 g N- (2-Nitro-2-carbäthoxy) vinyl (l) cephalosporin C werden in 30 ml trockenem Methylen-
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chlorid suspendiert und durch Zugabe von 0, 7 ml Triäthylamin gelöst. Zu dieser Lösung werden 1, 5 ml N, N-Dimethylanilin und 1, 27 ml Trimethylchlorsilan gegeben und 1 h bei Raumtemperatur weitergerührt. Anschliessend wird auf -150 gekühlt und 1, 25 g Phosphorpentachlorid in Portionen zugegeben. Es wird 2 h bei 150 weitergerührt und dann 15 ml Butanol so zugetropft, dass die Tempe- ratur-100 nicht übersteigt. Nach zweistündigem Rühren bei-10 werden 30 ml Wasser zugesetzt.
Die Phasen werden getrennt, die wässerige Phase auf PH 3, 5 gestellt und mit 10 ml Methylisobutylketon überschichtet. Die entstandene Fällung wird über Nacht gekühlt, dann abgesaugt und mit Isopropanol nachgewaschen. Ausbeute : 87% d. Th.
Beispiel 6 : 7-Aminocephalosporansäure (7-ACA)
1, 61 g Phosphorpentachlorid werden in 20 ml trockenem Dichlormethan suspendiert, unter Rühren 0, 63 ml Pyridin zugesetzt und der Ansatz 1/2 h bei 300 gerührt. Es wird nun auf 0 gekühlt und 4, 46 g bis-Benzhydrylester des N- (2-Nitro-2-carbäthoxy) vinyl (1) cephalosporin C in mehreren Portionen zugesetzt. Der Ansatz wird 1/2 h bei 50 gerührt, dann auf -150 gekühlt und unter Rühren langsam 9 ml Butanol zugesetzt. Es wird 30 min bei -100 und 30 min bei Raumtemperatur weitergerührt und mit 10 ml Eiswasser versetzt. Die Dichlormethanphase wird mit Wasser nachgewaschen und zur Trockne eingedampft.
Der Rückstand wird in 4 ml Ameisensäure gelöst und 1 h bei 500 gerührt. Die Ameisensäure wird schonend im Vakuum abgezogen. Der Rückstand wird zwischen 25 ml 0, 2 n Salzsäure und Essigester verteilt. Die wässerige Phase wird auf PH 3, 5 gestellt, wobei die Titelverbindung kristallisiert. Ausbeute : 78% d. Th.
Beispiel 7 : 7-Aminocephalosporansäure (7-ACA)
30 l eines nach Denaturierung und Filtration gewonnenen Kulturfiltrates einer Fermentation von Cephalosporin C mit einem Gehalt von 9, 35 g Natriumsalz. dihydrat des Cephalosporin C pro Liter werden bei 20 mit 50% iger Natronlauge auf PH 8, 5 gestellt und mit 540 ml Äthoxymethylenmalonsäurediäthylester versetzt. Durch fortlaufende Zugabe von 50%iger Natronlauge wird der PH-Wert konstant auf 8, 5 gehalten. Nach etwa 60 min bleibt der PH-Wert ohne weiteren Natronlaugenzusatz konstant und der Umsatz ist vollständig. Nun werden 15 l Methylisobutylketon zugesetzt und der PH-Wert unter kräftigem Rühren mit 65%iger Schwefelsäure auf 1, 8 bis 2, 0 eingestellt.
Dann werden die Phasen getrennt und die wässerige Phase erneut mit 7, 5 I Methylisobutylketon extrahiert. Die vereinigten Extrakte werden nun im Vakuum bei maximal 600 Innentemperatur eingedampft. Der Rückstand (etwa 1, 2 kg) enthält 320 g N- (2, 2-Dicarbäthoxy) vinylcephalosporin C (92% d. Th.). Dieser wird nun in 2, 5 kg Dichlormethan aufgenommen. Die so erhaltene Lösung wird filtriert und das Filtrat mit Dichlormethan auf 4 l aufgefüllt. Die so erhaltene Lösung wird direkt für die Iminohalogenidspaltung zur 7-ACA eingesetzt. Dazu werden die 4 l Dichlormethanlösung, die 320 g N- (2, 2-Dicarbäthoxy) vinylcephalosporin C enthalten, mit 800 ml Trimethylchlorsilan zersetzt.
Dann wird unter kräftigem Rühren gasförmiger Ammoniak in das Reaktionsgemisch eingeleitet, wobei die Temperatur auf etwa 420 ansteigt. Sobald die Silylierung vollständig ist, wird
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fortlaufende Kühlung unter 0'gehalten wird. Anschliessend wird das Gemisch auf 1, 2 I Eiswasser gegossen, gut durchgemischt und anschliessend die Phasen getrennt. Die wässerige Phase wird mit Aktivkohlezusatz filtriert und das Filtrat mit 25%iger Ammoniaklösung auf PH 3, 5 gestellt, wobei die Titelverbindung in Form eines weissen kristallinen Niederschlags anfällt. Dieser wird isoliert, mit Wasser und Methanol gewaschen und im Vakuum getrocknet. Ausbeute : 120 g (75% über alle Stufen).
Die als Ausgangsprodukte benötigten Verbindungen können folgendermassen erhalten werden :
A) N- (2-Nitro-2-carbäthoxy) vinyl (l) cephalosporin C
14, 2 g Mononatriumsalz. dihydrat des Cephalosporin C werden in 30 ml Wasser gelöst. Hierauf werden 2, 52 g Natriumbicarbonat in kleinen Portionen unter Rühren zugesetzt. Nach Beendigung der Gasentwicklung wird das restliche Kohlendioxyd aus der Lösung durch Erwärmen auf etwa 350 entfernt. Es werden noch 10 ml Wasser zugesetzt und hierauf 5, 7 g Äthoxymethylennitroessig-
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säureäthylester, gelöst in 15 ml Aceton, zugegeben. Nach 1 h Rühren bei Raumtemperatur wird das Aceton abgedampft und die wässerige Phase mit Essigester extrahiert. Die wässerige Phase wird auf PH 2 gestellt und mit frischem Essigester extrahiert.
Die Essigesterphase wird mit Wasser gewaschen und getrocknet. Nach Abziehen des Lösungsmittels wird der Rückstand mit Diisopropyl- äther verrieben und im Exsikkator getrocknet. Fp. : 95 bis 100 (Zers. ). Ausbeute : 93% d. Th.
B) N- (2-Nitro-2-carbäthoxy) vinyl (1) cephalosporin C
Es wird wie unter A) beschrieben gearbeitet, jedoch werden 14, 2 g Mononatriumsalz. dihydrat des Cephalosporin C in 300 ml Wasser gelöst und hierauf mit 1 n NaOH der PH-Wert auf 8 gestellt.
Der Äthoxymethylennitroessigester wird in 150 ml Aceton gelöst. Die Aufarbeitung gestaltet sich gleich wie unter A) angegeben. Die Titelverbindung wird in guter Reinheit erhalten. Ausbeute : 91% d. Th.
C) N- (2-Nitro-2-carbäthoxy) vinyl (1) cephalosporin C
1000 ml eines in der üblichen Weise von antibiotisch nicht aktiven Begleitstoffen gereinigten
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werden 5, 7 g Äthoxymethylennitroessigester, gelöst in 150 ml Aceton, gegeben. Nach 2stündigem Rühren bei Raumtemperatur wird, wie unter A) angegeben, aufgearbeitet. Ausbeute : 88% d. Th.
D) N- (2, 2-Dicarbäthoxy) vinyl (l) cephalosporin C
14, 2 g Mononatriumsalz. dihydrat des Cephalosporin C werden in 30 ml Wasser gelöst und, wie unter A) angegeben, die Lösung des Dinatriumsalzes bereitet. Zu dieser Lösung werden 6 ml Äthoxymethylenmalonsäurediäthylester in 15 ml Aceton gegeben und der Ansatz bei Raumtemperatur 6 h gerührt. Die Aufarbeitung erfolgt wie unter A) angegeben, die Titelverbindung wird mit Diisopropyläther angerieben und im Vakuum über Phosphorpentoxyd getrocknet. Fp. : ab 80 (Zers. ). Ausbeute : 96% d. Th.
E) N - (2, 2-Dicarbäthoxy) viny l (1) cephalosporin C
14,2 g Dinatriumsalz des Cephalosporin C werden in 150 ml Wasser gelöst und mit 1 n NaOH der PH-Wert auf 8, 2 eingestellt. Zu dieser Lösung werden 6 g Äthoxymethylenmalonsäurediäthylester in 50 ml Aceton gegeben und der Ansatz bei 30 5 h gerührt. Die Aufarbeitung erfolgt wie unter A) angegeben. Ausbeute : 94% d. Th.
F) N- (2, 2-Dicarbäthoxy) vinyl (1) cephalosporin C
1000 ml eines in der üblichen Weise von antibiotisch nicht aktiven Begleitstoffen gereinigten Kulturfiltrats einer Fermentation von Cephalosporin C, enthaltend 12 g Wirkstoff/l, werden durch azeotrope Destillation mit Butanol im Vakuum auf 150 ml eingeengt. Die wässerige Lösung wird
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6 ml Äthoxymethylenmalonsäurediäthylester in 50 ml Aceton gegeben und der Ansatz 8 h bei 350 gerührt. Aufarbeitung nach den unter A) angegebenen Angaben ergibt die Titelverbindung. Ausbeute : 92% d. Th.
G) N- (2-Carbäthoxy-2-cyano) vinyl (1) cephalosporin C
14,2 g Mononatriumsalz. dihydrat des Cephalosporin C werden in 30 ml Wasser gelöst und die äquivalente Menge 1 n NaOH zugegeben. Zu dieser Lösung werden 4, 84 g Äthoxymethylencyanessigester in 15 ml Aceton gegeben und der Ansatz 4 h bei Raumtemperatur gerührt. Die alkalische Lösung wird mit Essigester extrahiert und die organische Phase verworfen. Die wässerige Phase wird auf PH 2 angesäuert und mit Essigester extrahiert. Der Essigesterextrakt wird mit Wasser nachgewaschen und getrocknet. Abziehen des Lösungsmittels und Verreiben mit Diisopropyläther ergibt die Titelverbindung. Fp. : 100 bis 1130 (Zers.). Ausbeute : 85% d. Th.
H) N- (2, 2-Dicyano) vinyl (1) cephalosporin C
14,2 g Mononatriumsalz. dihydrat des Cephalosporin C werden in 30 ml Wasser gelöst und 2,52 g Natriumbicarbonat in kleinen Portionen zugegeben. Nach Beendigung der Kohlendioxydentwicklung wird das restliche CO : aus der Lösung durch Anlegen eines Vakuums entfernt. Es werden noch 10 ml Wasser zugesetzt, hierauf 3, 66 g Äthoxymethylenmalonsäuredinitril, gelöst in 15 ml Aceton, zugegeben und der Ansatz 1 h bei Raumtemperatur gerührt. Aufarbeitung wie unter A) angegeben, ergibt die Titelverbindung. Fp. : 98 bis 110 (Zers. ). Ausbeute : 85% d. Th.
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I) bis-Benzhydrylester des N- (2-Nitro-2-carbäthoxy) vinyl (l) cephalosporin C
8, 62 g Benzophenonhydrazon werden in 86 ml Dichlormethan gelöst und mit 13 g Mn02 1 h gerührt. Vom Braunstein wird abgesaugt und zum Filtrat eine Lösung von 11, 16 g N- (2-Nitro- - 2-carbäthoxy) vinyl (1) cephalosporin C gegeben. Es wird nun bei Raumtemperatur nachgerührt, bis keine Gasentwicklung mehr zu beobachten ist, das Lösungsmittel wird zur Trockne eingedampft und der Rückstand mit Essigester aufgenommen. Die Essigesterphase wird zuerst mit NaHCOa-Lö- sung, dann mit Wasser extrahiert und mit Natriumsulfat getrocknet.
Nach Abziehen des Lösungsmittels verbleibt die Titelverbindung als honigartiger Rückstand, der beim Anreiben mit Diisopropyl- äther durchkristallisiert. Fp. 80 bis 83 . Ausbeute : 98% d. Th.
J) bis-Benzhydrylester des N- (2, 2-Dicarbäthoxy) vinyl (l) cephalosporin C
Die Titelverbindung wird, wie unter I) angeführt, aus 11, 72 g N- (2, 2-Dicarbäthoxy) vinyl- (l) cephalosporin C und 8, 62 g Benzophenonhydrazon erhalten. Fp. : 65 bis 68 . Ausbeute : 97% d. Th.