DE2044866A1

DE2044866A1 - Peptidoglutaminase flavour additive prodn - by fermentation of bacillus circulans atcc 21590

Info

Publication number: DE2044866A1
Application number: DE19702044866
Authority: DE
Inventors: Mamoru Nagareyama; Sakaguchi Kenji Kashiwa; Nakano Eiichi Noda; Kikuchi (Japan). P
Original assignee: Noda Institute for Scientific Research; Kikkoman Shoyu Co., Ltd.; Noda (Japan)
Priority date: 1970-09-10
Filing date: 1970-09-10
Publication date: 1972-03-30
Also published as: DE2044866C3; DE2044866B2

Description

Peptidoglutaminase, Verfahren zu ihrer Gewinnung und ihre Verwendung" Die.Erfindung betrifft eine neue Peptidoglutaminase, die Glutaminsäure zu Peptiden zu desamidieren vermag, und ein Verfahren zur Gewinnung dieser neuen Peptidoglutaminase sowie ihre Verwendung zur Steigerung der Schmackhaftigkeit von dieses Enzym enthaltenden Getränken und Nahrungsmitteln.
Glutaminase ist ein Enaym, das Glutamin zu Glutamin.äure und Ammoniak zu hydrolisieren vermag, Es ist bekannt, daß die Glutaminase von Tieren, Pflanzen und Mikroorganismen erhalten wird. Dieses Enzym wirkt jedoch typischerweise nur auf freies Glutamin und ist nicht in der Lage, die g Amidgruppe des Glutamins zu desamidieren, über die das Glutamin an Peptide gebunden ist.
Bei der Erzeugung von Glutaminsäure unter Verwendung von Glutaminase hat man deshalb bisher ein Verfahren angewendet, bei dem das Protein zuerst unter Verwendung solcher Enzyme, wie Protease oder Peptidase, abgebaut wird, um Glutamin freizusetzen~. Das freigesetzte Glutamin läßt man dann mit Glutaminase reagieren, um die - Amidgruppe des freigesetzten Glutamins au desamidieren.
wobei man die gewünschte Glutaminsäure erhält.
Wenn jedoch nach dem vorgenannten Verfahren Protein zuerst durch die Einwirkung von Protease oder Peptidase hydrolisiert wird, wird freies Glutamin oder ein solches Glutamin erzeugt, dessen endständige Aminogruppe an Peptid gebunden ist. Derartige Glutamine neigen zur Bildung von geschmacksfreier Pyroglutaminsäure, da sich die X und α-Stellungen des Glutamins miteinander zyklisch verbinden können. Ist das zuletzt genannte Glutamin an die endständige Aminogruppe des so wird Peptids gebunden, / dieses nicht desamidiert, sogar wenn Glutaminase gleichzeitig mit vorliegt, sondern bildet peptidgebundene, Pyroglutaminylpeptide und kann daher nicht in Glutaminsäure umgewandelt werden.
Demgemäß war es bisher bei der Erzeugung von Getränken und Nahrungsmitteln, wie Sojasoße, MiBo" (Pasteaus Reis und Bohnen, vgl. H.-J.Rehm "Industrielle Mikrobiologie", Springer-Verlag, 1967, S. 570) oder Käse, unter Verwendung von Protein enthaltenden Substanzen als Rohmaterial bekannt, proteolytische Enzyme, wie Protease oder Peptidase, auf das Rohmaterial einwirken zu lassen, um dadurch Peptide oder Aminosäuren zu erhalten. Wenn, wie oben erwähnt, Protein durch proteolytische Enzyme abgebaut wird, um eine höhere Ausbeute an Glutaminsäure und den Glutamylpeptiden zu erhalten, wird Glutamin als freies Glutamin in Freiheit gesetzt oder wird in Glutaminylpeptide Uberführt, wenn Glutamin mit der endständigen Aminogruppe des Peptids verbunden ist. Derartige Glutamine werden sehr leicht in Pyroglutaminsäure in saurer oder neutraler Lösung überrührt, in der sich die g- und α-Stellungen schnell miteinander zu einer ringförmigen Substanz verbinden. Ein derartiges Peptidglutamin wird nicht desamidiert, auch nicht in Gegenwart einer üblichen Glutaminase. Insbesondere wird ,ãmlnoendständig peptide peptidgebundene bundene,s,Gldamin in/Pyroglutaminsäure überführt, während sie in einem Peptidglutamin-Zustand verbleibt, und wird geschmacksfreil~ da die übliche Glutaminase nur mit freiem Glutamin reagiert.
Wenn ferner Glutamin einmal in Freiheit gesetzt ist, bildet sich sehr rasch Pyroglutaminsäure. Aus diesem Grunde werden vorzugsweise Glutaminylpeptide nach Möglichkeit so wie sie sind desamidiert, wodurch sie in Glutamylpeptide überführt werden.
In der Literatur ist trans-Glutaminase als Enzym beschrieben, das mit peptidgebundenem Glutamin reagieren kann (vgl. H. Waelsch et al., Archiv. Biochem. Biophys. 84, 528 (1959) und J. E. Folk und P. W. Cole, J. Biol. Chem. 240, 2951 (1965)).
Dieses Enzym zeigt bekanntlich eine schwache Desamidierungswirkung auf die #-Amidgruppe der Glutaminylpeptide. In erster Linie jedoch ist dieses Enzym kein hydrolytisches Enzym wie Glutaminase, doch weist es die Eigenschaft auf, beim Protein oder Peptid mit einer primären Aminogruppe die -Amidgruppe des Glutamin zu substituieren. Ferner besitzt es eine sehr schwache Hydrolyse-Aktivität Darüber hinaus reagiert es mit bestimmten Peptiden, wie Glycylglutamin, Glutaminyl-glycin oder Glycyl-glutaminyl-glycin, überhaupt nicht.
;Nus diesem Grunde ist wie trans-Glutaminase zur Erzeugung von Glutaminsäure unter Verwendung von Protein als Ausgangsmaterial oder bei der herstellung von Getränken oder Nahrungsmitteln, bei dnen der Gehalt an Glutaminsäure hinsichtlich ihrer Schmackhaftigkeit bedeutsam ist, ungeeignet. Darüber hinaus ist die Beschaffungsmöglichkeit der trans-Glutaminase begrenzt, da sie aus Meerschweinchenleber gewonnen wird.
Die Aufgabe vorliegender Erfindung liegt in der Auffindung eines Enzyms, das in Peptiden ungeachtet der benachbarten Aminosäuren die -Amidgruppe des Glutamins zu desamidieren vermag. Ferner soll eine höhere Ausbeute an Glutaminsäure aus den Protein enthaltenden Ausgangsmaterialien ohne Bildung von Pyroglutaminsäure erhalten werden. Ferner soll das Enzym die Menge der in Getränken und Nahrungsmitteln enthaltenden L-,lutaminsäure oder Glutamylpeptiden erhöhen, die durch Ilydrolyse der Protein enthaltenden Ausgaiigsmaterialien erzeugt werden und die die erhaltellen Peptide oder Aminosäuren als Teil ihrer geschmacksgebenden Bestandteile thalten, wobei man die Getränke und Nahrungsmittel auch unmittelbar mit dem Enzym reagieren lassen kann.
Es wurde nun gefunden, daß ein neuer Stamm des Bacillus circulans ein derartiges Enzym zu erzeugen vermag. Dieser Stamm ist bei der American Type Culture Collection, rockville, Maryland, V.St.A., hinterlegt und unter der Nummer ATCC 21590 registriert worden. Dieses Enzym reagiert unmittelbar mit Glutamin, das als solches an Peptide gebunden ist, und desamidiert die -Amidgruppe des Glutamins, ohne die Peptidbindung zu spalten. Da dieses @@@aym bisher noch nicht bekannt gewesen ist, wird es Peptidoglutaminase genannt (im folgenden kurz als PGase bezeichnet).
Es ist weiter gefunden worden, daß dieses Enzym aus zwei Faktoren zu bestehen scheint, die auch einzeln isoliert werden können. Ein Faktor des Enzyms reagiert nämlich mit solchem Glutamin, das an eine endständige Carboxylgruppe des Peptids gebunden ist, doch greift es im wesentlichen nicht solches Glutamin an, das an einer endständigen oder auch inneren Anttnruppe des Peptids gebunden ist. Der andere Faktor des Enzyms reagiert im wesentlichen nicht mit solchem Glutamin, das an einer endständigen Carboxylgruppe des Peptids steht, sondern nur mit G¢utamin, das an endatändige Aminogruppen des Peptids oder innerhalb des Peptids gebunden vorliegt. Das vorstehend zuerst genannte Enzym wird nachstehend als Peptidoglutaminase-I (PGase-I) und das als letztgenannte/Peptidoglutaminase-II (PGase-II) bezeichnet.
Gegenstand der Erfindung ist somit Peptidoglutaminase.
Des weiteren bildet den Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zur Gewinnung der Peptidoglutaminase, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen Peptidoglutaminase erzeugenden Mikroorganismus der Gattung Bacillus circulans ATCC 21590 unter aeroben Bedingungen in einer Kulturflüssigkeit züchtet und die in den Zellen des Mikroorganismus und/oder in der Kulturflüssigkeit vorliegende Peptidoglutaminase isoliert.
Die bakteriologischen Eigenschaften des Bacillus circulans ATCC 21590 sind auf der Grundlage der in "Manual of Microbiological Methods" (Society of American Bacteriologists, 1957) beschriebenen Methoden untersucht und danach entsprechend dem Schlüssel in "»ergey's Manual of Determinative Bacteriology", 7. Auflage, 1957, klassifiziert worden. Aufgrund der Untersuchungsergebnisse, daß der Stamm gram-negativ ist, Sporen bildet und bei 650C kein IPachstum zeigt, wurde er als zur Gattung Bacillus circulans gehörig eingestuft. Jedoch iin hinblick auf die Tatsache, daß der Stamm ziemlich aerob ist und eine Kohlenstoffquelle zum Wachstum benötigt und auch Peptidoglutaminase erzeugt, wird der Stamm als circulans neuer, zur Gattung Bacillus/g-hörender Stamm eingeordnet.
Die bakteriologischen Eigenschaften des Bacillus circulans ATCC 21590 sind nachstehend angegeben.
(A) Züchtungseigenschaften: Fleischbrühe: geringes Wachstum.
Fleischbrühagar: Wachstum bei 300C in 7 Tagen.
Lactose-Fleischbrühagar: gutes Wachstum, kreisförmig, klebrige Konsistenz, kolonienbildend, durchsichtiges Aussehen, farblos.
Gelatinsstich : kein wachstum.
Pepton-Wasser:. geringes Wachstum.
Lackmusmich: kein wachstum.
(B) Morphologische Eigenschaften: Form: Stäbchen der Gtöße 0,4 bis 0,6 x 2,2#4 µ.
Geißeln: umfänglich, mobil.
Sporenbildung: Sporen werden gebildet.
, Physiologische eigenschaften: Gramfärbung : nagativ Methylrot-Reaktion: negativ.
Indolbildung: negativ.
Schwefelwasserstoff: geringe Bildung.
Ammoniak: geringe Bildung.
Nitratreduktion: negativ.
Katalase: positiv.
Gelatineverflüssigung ; negativ.
Stärkeverflüssigung: positiv.
Milch: koaguliert nicht.
Lackumusmilch-Reducktion : negativ.
Verwendungsmöglichkeit von Ammoniumsalzen: kann wachsen unter Verwendung von Ammoniumsulfat und Ammoniumchlorid als Stickstoffquelle.
(D) Verwendungsmöglichkeit von Zucker: Glucose W +++ @ Mannil + Fructose ++ Glycerin + Galactose +++ Dextrin ++ Mannose +++ Stärke Xylose +++ Inulin + Asabinose +++ Glycogen +++ Saccharose ++ Rhamnose -Lactose +++ Salicin ++ Trehalose +++ o-Methylglucosid Raffinose Maltose +++ Sorbit + Bemerkungen: - : nicht verwendbar.
+ : mäßig verwendhar.
++ : gut verwendbar.
+++ : sehr gut verwendbar.
Außer dem vorstehend charakterisierten Stamm sind auch dessen Varianten und/oder Mutanten verwendbar, wenn sie Peptidoglutamlnase erzeugen.
Diese Stämme werden hauptsächlich in einem flüssigen Medium gezüchtet. Die Kulturflüssigkeit kann zahlreiche Nährstoffquellen enthalten, die üblicherweise bei der Züchtung von Mikroorganismen verwendet werden. Insbesondere verwendet man bei Bacillus circulans ATCC 21590 Lactose, Stärke odcr Saccharose als bevorzugte Kohlenstoffquelle. GJucose ist nicht so bevorzugt. Als Stickstoffquelle kann man beliebige anorganische und organische Stickstoff enthaltende Verbindungen, z. n. Ammoniumsalze, wie Ammoniumsulfat oder Ammoniumchlorid, Pepten, Kaseinaminosäure, @@@fextrakte oder Sojabohnenmehl, verwenden. Außerdem können zweckmäßigerweise anorganische Salze, wie Phosphate, Magnesiumsalze und/oder geringe Mengen anderer Nährstoffe mitverwendet werden.
Die Bebrütungstemperatur liegt bei 25 bis 350C, vorzugsweise um etwa 300C. , Das Optimum des pH-Wertes liegt bei etwa 7,-0. Die Bebrütung wird entsprechend den üblichen Methoden durchgeführt, vorausgesetzt, daß sie unter aeroben Bedingungen erfolgt. Besonders bevorzugt ist eine belüftete Kultur. Wirtschaftlich bevor-~ugt ist die Anwendung eines mit einer Belüftungsvorrichtung ausgerüsteten Fermentationsgetäßes, um die Züchtung zu bewirken. Nach etwa 8 bis 20 Stunden ist die Züchtung gewöhnlich beendet, doch kann man sie erforderlichenfalls zusätzlich etwa weitere 8 Stunden fortsetzen, um den Zellen des Stamms eine Selbstverdauung zu ermöglichen, wobei'das' angereicherte Enzym anus den Zellen aus tritt.
Nach der Beendigung der Bebrütung kann die gewünschte Peptidoglutaminase nach üblichen Enzymgewinnungsverfahren aus der Kulturflüssigkeit gewonnen werden. Da jedoch das Enzym in erster Linie intrazellular vorliegt, wird vorzugsweise das nachstehend beschriebene Verfahren angewendet. Das Enzym wird durch Suspendieren der gesammelten Zellen in einer Pufferlösung, z. B. in einer Phosphat-Pufferlösung, und Zerkleinern der Zellen mittels einer Mahlvorrichtung, z. B. einem Ultraschall-Zerkleinerer, einem Hochdruck-Homogenisator oder einer anderen geeigneten Vorrichtung, z. B. French presz", oder durch Auflösen der Zellen unter Verwendung eines bakteriolytischen Enzyms, wie Lysozym, extrahiert.
Gegebenenfalls werden die Zellen geschüttelt oder in Gegenwart eines Lösungsmittels, wie Toluol, eine geeignete Zeitdauer stehen gelassen, damit sie sich selbst verdauen, um das angesammelte Enzym aus den Zellen auszuscheiden. Die erhaltene Lösung wird dann filtriert oder zentrifugiert, um die Feststoffe abzuscheiden und dabei eine rohe Lösung des Enzyms zu erhalten.
Weiterhin wird in dem Falle, wenn das gesamte~gezüchtet Produkt als Enzymprodukt ohne Abtrennung der Zellen, wie vorstehend angegeben, verwendet wird, crYugsweise die Züchtung weiter etwa 8 Stunden unter Belüftung oder stationär fortgesetzt, um die Zellen sich selbst verdauen zu lassen und das angesammelte Enzym &us den Zellen so weit wie möglich auszuscheiden.
Die derart erhaltene rohe Lösung' des Enzyms kann'als solche oder in Form eines rohen Pulvers des Enzyms nach einer Lyophilisierung oder einer Acetonbehandlung verwendet werden.
Die rohe Lösung oder das rohe Pulver des nach vorstehender Weise erhaltenen Enzyms PGase wird gegebenenfalls mit Streptomycin versetzt, um Nucleinsäuren auszufällen und zu entfernen. Danach wird es durch Zugabe von Ammoniumsulfat, Alkohol oder Aceton fraktioniert. Die fraktionierten Niederschläge werden gesammelt, mit Wasser dialysiert und unter vermindertem Druck lyophilisiert, um ein Standardprodukt des Ammoniumsulfat-fraktionierten rohen Enzyms zu erhalten.
Das Standardprodukt des derart erhaltenen rohen Enzyms kann weiter mittels zahlreicher, an sich bekannter Reinigungsverfahren behandelt werden, um eine hoch gereinigte Standardenzym-Zubereitung zu erhalten. Beispiele derartiger Reinigungsverfahren sind Gelfiltration, z. B. mittels "Sephadex G-200" der Firma Pharmacia Co., Schweden, oder "Bio Gel P-150" der Firma Bio Rod Co., V.St.A., ein Absorptions- und Eluttonavorfahren unter Verwendung von Ionenaustsuschern, wie "DEAE-Sephadex" oder "Diäthylaminoäthyl-Sephadex" der Firma Pharmacia Co., Schweden, "TEAE-Cellulose" (Triäthylaminoäth?lcellulose) der Firma Brown Co., V.St.A., oder Hydroxylapatit, z. z. B. der Firma"Bio Rod Co;,.V.St.;,., oder eine Elektrophorese unter Verwendung von z. B. Polyacrylamid.
Die Reinigung der durch Züchten von Bacillus circulans ATCC 21590 erhaltenen PGase wird nachstehend anhand eines Beispiels näher erldutërt. -Die rohe Lösung des Enzyms, das die PGase-I und PGase-II enthält, wird mit Ammoniumsulfat, Alkohol oder Aceton fraktioniert. Es wird ein Ammoniumsulfat-fraktioniertos Enzymgemisch der PGase-I und PGase-II erhalten. Dieses Enzymgemisch wird in einer Pufferlösung gelöst, die durch Vermischen einer 0,01 molaren Phosphat-Pufferlösung (pH 7,6), 0,1 Mol Xallumchlorid und 0,002 Mol Äthylendiamintetraacatat hergestellt worden ist. Die erhaltene Lösung des Enzyms wird auf eine Säure gegeben, die zuvor mit in der gleichen Pufferlösung aufgeschlämmtem "Sephadex G-200" beschickt ist. Dann wird die gleiche Pufferlösung zur Gelfiltration verwendet. Die Praktionen Nr. 50 bis etwa 70 (jeweils 10 ml) werden gesammelt, wobei ein teilweise gereinigtes Enzymgemisch von PGase-I und PGase-Ii erhalten wird.
Anschließend wird das teilweise gereinigte Enzymgemisch an einer Säule mit "DEAE-Sephadex" chromatographiert. Die Säurc wurde zuvor mit einer Pufferlösung beschickt, die durch Mischen von 0,01 molarer Phosphat-Pufferlösung (pH 8,0), 0,1 Mol Kaliumchlorid und 0,002 Mol Äthylendiamintetraacetat hergestellt worden war.
Hierbei wird die PGase-I und die PGase-II absorbiert. Die absorbierten PGase-I und PGase-II werden nach demkatiumchloridkonzentrationsgradienten einer Pufferlösung mit der gleichen Zusammensetzung und der gleichen Konzentration, wie vorstehend angegeben, eluiert.
Bei der vorstehend genannten Verfahrensstufe werden die PGase-I bei einer Kaliumchlorid-Konzentration von 0,17 bis 0,21 Mol und die PGase-II bei einer Kaliumchlorid-Konzentration von 0,22 bis 0,27 Mol eluiert.
Die wirksamen Fraktionen der beiden derart erhaltenen Eluate werden gesammelt, und man erhält Lösungen der jeweils teilweise gereinigten Enzyme PGase-I und PGase-II.
Anschließend werden die Lösungen der Enzyme an einer Säule chromatographiert, die mit Hydroxyphaptit ("Bio Gel HT") gefüllt ist.
Die Lösung des teilweise gereinigten Enzyms PGase-I wird mit 0,01 Mol Kaliumhydrogenphosphat auf pH 7,0 eingestellt und dann auf die Säule gcgehen, die zuvor mit 0,01 molarer Phosphatlösung gepuffert worden war. Die PGase-I wird absorbiert. Die absorbierte PGase-I wird entsprechend dem linearen Konzentrationsgradienten der gleichen Pufferlösung eluiert, mit der die Säule behandelt worden war. Die wirksamen Fraktionen des PGase-I-Eluats werden gesammelt, und man erhält eine Zubereitung des gereinigten Enzyms PGase-I.
Die Lösung des teilweise gereinigten Enzyms PGase-II wird nach einem ähnlichen Verfahren gereinigt.
Die Verfahrensstufen der Extraktion, Abtrennung und Reinigung der Peptidoglutaminase-I und Peptidoglutaminase-II sind in der nachstehenden Tabelle zusammen mit den entsprechenden Ergebnissen zusammengefaßt.
Enthaltene Spezifische Aus-PGase-I Enzymmenge Aktivität beute (Einheiten) (Einheiten/ (%) mg Protein)+) rohe Enzymlösung 935 0,14 100 Ammoniumsulfat-Fraktion (der bei einer Sättigung von 0,38 - 0,54 gebildete Niederschlag) 954 1,00 102 Gelfiltration an "Sephadex G-200" (hoch gereinigte Fraktion) @ 540 27 57 Chromatographie an "DEAE Sephadex" (hoch gereinigte Fraktion) 309 16X3 33 Chromatographie an Hydroxylapátit (hoch gereinigte Fraktion) 129 64,5 unter Verwendung von Carbobenzoxy-glutamin als Substrat.
Enthaltene Spezifische Aus-,PGase-II Enzymmenge Aktivität beute (Einheiten) (Einheiten/ (%) mg Protein)+) rohe Enzymlösung 1203 0,18 100 Ammoniumsulfat-Fraktion (der bei einer Sättigung von 0,38 - 0,54gebildete. Niederschlag) 858 0,9 96 Gelfiltration an "Sephadex G-200" (hoch gereinigte Fraktion) 784 39 65 Chromatographie an "DEAE Sephadex" (hoch gereinigte Fraktion) 638 33,6 53 Chromatographie an Hydroxy lapatit (hoch gereinigte Fraktion) 256 73,2 21 unter Verwendung von Carbobenzoxy-glutaminyl-prolin als Substrat.
Das P@üfungsv@@fah@@n auf die PGas@n @@@ wi@ @ol@t: Entsp@echende Substr@te w@@den in einer Konzent@ation v@@ 10 m@@@l in @iner 40 mmolaren Phosphat-Pufterlös@@g vom pH 7,5 g@löst.
Dann fügt man eine in g@@igneter Weise verdünnte PGase-Lösun@ oder -Suspension von Zellen des Bacillus circulans bis zum Gesamtvolumen von 1,0 ml @inzu. Es wird 10 Minuten bei 30°C bebrütet. Durch Zugabe von 0,1 ml 50 %-@ger T@ichlor@ssigsäure wird die Reaktion beendet und das freigesetzte Ammoniak in üblicher Weise bestimmt.
0,5 ml des Reaktionsgemisches werden mittels 1 n NaOH auf pH 6,@ eingestellt und in ein kl@ines Glasg@fäß gegeben. Entsp@@@@@@@ dem Verfahren von C@drangoro et al. (@@nzymologia, 29 (1965). Seiten 3 - 5) wird in das Glasgefäß 1 ml Borat-P@fferlösung vom pH 10,8 gegeben, das fr@igesetzte Ammoniak in 5 n S@hw@f@l@r@ absorbiert und das Gemisch zur Farbbil@@@@@ mit Nessler's R@@@gen.
versetzt. Die Absorption der entstandenen Farbe wird bei 420 mµ gemessen. Die M@nge des Enzyms wird durch @ine Einheit aus@@@ drückt, die der Menge Enzym entspricht, die @ µMol/Minute Ammoniak unter den vorstehend genannten Reaktionsbedingungen @@ @@ug@.
Die spezifische Aktivität wird durch die Anzahl Enzym@in@@i@en pro mg Protein ausgedrückt. In di@s@m Falle wird die @enge des Prot@ins nach der Biuret-Methode oder d@m Ultravi@lett-Absorptionsverfahren ("Method in Enzymology", Bd. III, Seiten 450 - 451, 1957) bestimmt.
Die vorstchend genannt@n Enzymfraktionen, die bei der Endr@inigungsstufe @rhalten worden sind, werden mit einer geeigneten Pufferlösung dialysiert, dann lyophilisiert und getrocknet, wobei die gereinigte PGase-I und PGase-II in Form weißer Pulver erhalten werden. Weiterhin werden die PGase-I und die PGase-II an einer "Sephadex G-100"-Säule chromatographiert. Beide zeigen ein einziges Maximum.
Die Eigenschaften der PGase-I und derPGase-II, die als neue Enzyme nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten worden sind, werden nachstehend erläutert.
(I) Aktivität: Die vorliegenden Enzyme besitzen eine Aktivität, Glutaminylpeptide zu Glutamylpeptiden zu desamidieren. Unter diesen Enzymen kann die PGase-I die Desamidierung von Glutamin bewirken, das an die endständige Carboxygruppe der Peptide gebunden ist, ohne die Peptidbindung zu spalten. Demgegenüber reagiert die PGase-II lediglich mit der -Amidgruppe des Glutamins, das sowohl an einer cndständigen Aminogruppe des Peptids als auch innerhalb der Peptidkette gebunden vorliegen kann. Die Aktivitäten der Enzyme werden unter Bezugnahme auf die nachfolgenden Beispiele näher erläutert. Im Falle der PGase-I wird Carbobenzoxy-L-glutamin (im folgenden kurz als "CBz-L-Gln" bezeichnet) als Substrat verwendet, während im Falle der PGase-II Carbobenzoxy-L-glutaminyl-glycin (im folgenden kurz als "CBz-L-Gln-Gly" bezeichnet) als Substrat dient. Die entsprechenden Aktivitäten werden, wie in der anschließenden Tabelle gezeigt ist, dadurch bestimmt, daß man die entsprechenden Substrate mit den Enzymen reagieren lcint und dann eine Dünnschicht-Chromatographle und eine Filterpapier-Elektrophorese anschließt, Dünnschicht-Chromato- Elektrophorese (2) graphit, (Abstand vom Aus-Verbindung Lösungsmisttelsystem gangspunkt der (Rf-Wert) (1) Elektrophorese in crn) A B C D erhalten durch Reaktion der PGase-I auf CBz-L-Gln 0,96 0,91 0,44 0,19 12,8 CBz-L-Gln 0,83 0,81 0,26 0,08 3,2 CBz-L-Glu(3) 0,96 0,91 0,44 0,19 12,8 erhalten durch Reaktion der PGase-II auf CBz-L-Gln-Gly 0,80 0,85 0,13 0,03 12,6 CBz-L-Gln-Gly 0,66 0,72 0,04 0,01 8,8 CBz-L-Glu-Gly(3) 0,80 0,85 0,13 0,03 12,7 Bemerkungen: (1) Lösungsmittelsystem: A: n-ButanollEssigsäure : Masser = 4:1:1 B: n-Butanol:Essigsäure:5 %-igem wäßrige Ammoniak = 5,5:3:1,5 C: Äthylacetat: Wenzol : Essigsäure = 50:50:2 D: Chloroformsäethanol:Essigsäure = 95:5:3 (2) Elektrophorese: Pufferlösung: Pyridin:Essigsäure:Wasser 25:1:225; 2000 V; 70 Minuten (3) CBz-L-Glu: Carbobenzoxy-L-glutaminsäure CBz-L-Glu-Gly: Carbobenzoxy-L-glutamyl-glycin Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, daß CBz-L-Glu und CBz-L-Glu-Gly erzeugt werden. Da freies Glutamin, freie Glutaminsäure und freies Glycin nicht festgestellt werden konnten, zeigt dies an, daß sowohl PGase-I als auch PGase-II Glutaminylpapoide zu Glutamylpeptiden desamidieren können.
(II) Spezifische Wirksamkeit des Substrats: In der nachstehenden Tabelle stellen die Zablenwerte mMole freigesetztes Ammoniak pro mg Enzym in 1 Minute dar.
PGase-I PGase-II Substrat NH3 mMol/min. NH3 mMol/min.
Carbobenzoxy-L-glutamin 62,2 1,7 Glycyl-L-glutamin 61,2 0,4 L-Tyrosyl-L-glutamin 61,0 0,6 N-Acetyl-L-glutamin 53,8 0,7 Phtllaloyl-DL-glutamin 27,0 0,4 L-Prolyl-L-glutamin L-Leucyl-glycyl-L-glutamin 48,5 0,1 PGase-I PGase-II Substrat NH3 mMol/min. NH3 mMol/min.
Carbobenzoxy-L-glutaminyl-L-prolin 0 73,0 Carbobenzoxy-L-glutaminyl-glycin 0 52,4 tert. -Amyloxycarbonyl-L-glutaminyl-L-prolin 0 39,2 L-Phenylalanyl-L-glutaminyl-glycin 0 33,5 Pyroglutaminyl-L-glutaminyl-L-alanin 0 26,2 L-Glutaminyl-glycin 0,98 27,8 L-Glutamin 4,8 1,5 L-Asparagin O 0 Carbobenzoxy-L-asparagin 0 0 Glycyl-L-asparagin O 0 L-Leucinamid 0 0 Glycyl-L-phenylalaminamid 0 0 PGase-I PGase-II (III) Optimaler pH-Bereich 7,0 - 8,0 6,5 - 8,0 (IV) Stabiler pH-Bereich 6,0 - 11,4 @ 6,0 - 11,4 (16 Std. ei 4 C) (16 Std. bei 4 C) PGase-I PGase-II (V) Optimaler Reaktionstemperaturbereich 10 - 450C 10 - 400C (VI) Inaktivierungsbedingungen vollständig inakti- dto, viert bei pH,5, 16 Std. bei 4°C 30 %-ige Inaktivie- 5 %-ige Inaktivierung bei pH 560, rung bei pH 5,0, 16 Std. bei 4 C 16 Std. bei 40C vollständige Inakti- vollständige Inaktivierung bei pH 10,8, vierung bei pH 10,0, 2 Std. bei 370C 2 Std. bei 370C ! vollständige Inakti- vollständige Inaktivierung bei pH 7,6, 'vierung bei pH 7,6, 10 Minuten bei 550C 10 Minuten bei 50°C 50 %-ige Inakti- 40 %-ige Inaktivierung bei pH 7,6, vierung bei pH 7,6, 10 Minuten bei 500C 10 Minuten bei 45°C (VII) Inhibierung 30 bis 60 %-ige dto.
Inaktivierung in Gegenwart von Hg oder Cu mit 20 $-iger NaCl- dto.
Lösung bei pH 7,5, 50 %-ige Inhibierung (VIII) Aktivierung geringe Aktivierung dto.
durch Glutathion PGase-I PGase-II (IX) Stabilität keine wesentliche dto.
Inaktivierung durch Lyophilisierung gnd Lagerung bei -20 C (X) Molekularge- 80.000 - 90.000 130.000 - 140.000 wicht (bestimmt nach der Andrews-Methode in Biochem. 7. 91, 222 (1964) unter Verwendung von "Sephadex G-100") Die von Bacillus circulans ATCC 21590 erzeugten Peptidoglutaminasen, nämlich die PGase-I und die PGase-II, besitzen die vorenannten Eigenschaften. Jedoch ist die Peptidoglutaminase vorliegender Erfindung nicht nur auf die vorgenannte PGase-I oder PGase-II beschränkt. Selbstverständlich liegen alle anderen enzyme innerhalb des Umfangs vorliegender Erfindung, sofern sie eine funktionelle Aktivität besitzen, Glutaminylpeptide zu Glutamylpeptiden zu desamidieren.
Bisher sind zahlreiche Enzyme bekannt geworden, die die -Amidgruppe des Glutamins hydrolisieren können. Diese Enzyme werden aus zahlreichen Tieren oder Pflanzen gewonnen. Z. fl. umfassen diese Enzyme Glutaminase ("The Enzymes" Bd. 4 (1960), 285) und trans-alutaminaseZ (J. Biol. Chem. 240 (1965), 2951). Die erfindungsgemäßen Enzyme sind jedoch1 wie vorstehend gezeigt worden ist, völlig von diesen bekannten Enzymen hinsichtlich ihrer Substratwirksamkeit verschieden. Dies bedeutet, daß Glutaminase keine $-Amidgruppe eines an Peptide gebundenen Glutamins zu desamidieren vermag. Im Gegensatz hierzu können die erfindungsgemäßen Enzyme dank ihrer Reaktionsfähigkeit mit an Peptide gebundenem Glutamin die Desamidierung bewirken.
Obwohl weiterhin die trans-Glutaminase eine geringe Desamidierungsreaktion von peptidgebundenem Glutamin zeigt, wie früher erwählt worden ist, besitzt dieses Enzym inherente Eigenschaften und eine Aktivität, ein primäres Amin mit der Amidgruppe des Glutamins innerhalb des Peptids oder Proteins auszutauschen.
Außerdem ist seine Hydrolysetähfgkeit sehr schwach. Im Gegensatz hierzu besitzen beide erfindungsgemäßen PGasen keinerlei Austauschaktivität des primärem Amins, sondern zeigen Hydrolyseaktivität und sind in diesen vorstehend genannten Punkten offensichtlich von trans-Glutaminase verschieden.
Weiterhin reagiert trans-Glu'taminase keineswegs mit den -Amidgruppen eines peptidgebundenen Glutamins, wie Glycyl-glutamin, Glutaminyl-glycin oder Glycyl-glutaminyl-glycin. Andererseits reagieren die erfindungsgemäßen Enzyme mit diesen Peptiden mit C-endständig gebundenem Glutamin, N-endständig gebundenem'Glutamin und solchem Glutamin ii Inneren der Peptidkette sehr stark.
Darüber hinaus benötigt trans-Glutaminase unbedingt Calciumionen zu seiner Aktivität, äred die erfindunqsgemäßen Enzyme nicht diese Eigenschaft aufweisen.
Weiterhin ist Gegenstand vorliegender Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen Enzyme in Getränken und Nahrungsmitteln.
Ein Verfahren zur Erzeugung von Getränken und Nahrungsmitteln, bei dem die erfindungsgemäßen Enzyme verwendet werden, ist nachstehend beschrieben.
Die Menge des zuzufügenden Enzyms, die zur Durchführung der Enzymreaktion erforderliche Zeit und andere Bedingungen können in Abhängigkeit der proteinhaltigen endprodukte variieren. Bei der herstellung von Würzen, wie Sojasoße, die als Ilauptbestandteil Aminosäure, insbesondere Glutaminsäure, enthält, wobei ein Protein enthaltendes Ausgangsmaterial in an sich bekannter Weise behandelt und das Protein abgebaut wird, wird das erfindungsgemäße Enzym unter Rühren dem Ausgangsmaterial unmittelbar vor oder während der Fermentation und Reifung zugegeben, so daß die Menge des erfindungsgemäßen Enzyms, entweder in Form eines Zellen enthaltenden Enzyms, eines flüssigen rohen Enzymextraktes oder einer gereinigten Enzymzubereitung, 0,01 bis 100 Einheiten je ml, der Fermentationsbrühe betragen kann. Anschließend können üblicherweise bei der Erzeugung von Getränken und Nahrungsmitteln angewendete Verfahren durchgeführt werden.
Im Falle von festen Nahrungsmitteln, wie "iso" oder Käse, können die erfindungsgemäßen Enzyme in einer der vorstehend genannten Pormen unter grUndlichem Vermischen in einer Menge von etwa 0,01 bis etwa 100 Einheiten je 1 g festes Ausgangsmaterial unmittelbar vor oder während der üblichen Reifungsstufe zugefügt werden. Anschließend kann man ein übliches Verfahren anwenden, um zum Endprodukt zu gelangen.
Infolge der Zugabe der erfindungsgemäßen Enzyme in der vorbeschriebenen Weise bildet sich Glutaminsäure vom Peptidtyp, wodurch das Endprodukt eine bessere Schmackhaftigkeit im Vergleich zu jenen Produkten erfährt, die nach üblichen Verfahren ohne das Erfordernis einer weiteren Beschleunigung der Ilydrolyse zur Bildung von Aminosäuren, wie im Falle der Protease, erhalten werden.
Die erfindungsgemäßen Enzyme reagieren mit Glutaminylpeptiden, die mit Protcase aus Protein erzeugt werden, unter Bildung von Glutamylpeptiden, die in Gegenwart von Peptidase weiter zu freier Glutaminsäure hydrolysiert werden. Bei der Erzeugung von Getränken und Nahrungsmitteln unter Verwendung eines Protein enthaltenden Ausgangsmaterials mit einem hohen Molekulargewicht ist die Anwesentheit von Protinase unerlänlich, um derartige Glutamylpeptide oder freie Glutaminsäure durch die Wirkung des erfindungsgemäßen Enzyms zu bilden. Im Falle der Erzeugung von Getränken und Nahrungsmitteln nach vorliegender Erfindung kann jedoch das erfindungsgemäßc Enzym gewöhnlich seine Fähigkeit ausreichend und wirksam zeigen, wenn eine solche Menge Proteinase oder Peptidase, wie sie üblicherweise bei der Erzeugung solcher Getränke und Nahrungsmittel verwendet wird, vorliegt.
Um gegebenenfalls das erfindungsgemäße Enzym wirksam werden zu lassen,.kann die Zugabe von Peptidase oder Proteinase bei der Erzeugung von Getränken und Nahrungsmitteln zweckmäßig sein.
Im allgemeinen kann die Menge des zuzufügenden erfindungsgemäßen Enzyms 0,01 Einheiten oder mehr je ml oder g Ausgangsmaterial sein.
Die Verwendung des erfindungsgemäßen Enzyms kann bei beliebigen Setränken und Nahrungsmitteln erfolgen, die Protein enthaltende Substanzen aufweisen, deren Schmackhaftigkeit auf Aminosäuren beruht, so dan der Geschmack derartiger Getränke und Nahrungsmittel verbessert wird. Beispiele derartiger Getränke und Nahrungsmittel mit Aminosäuren als geschmacks gebenden Substanzen sind Würzen, wie Sojäsoße, "Mirin" oder Essig, Getränke, wie Alkohole. Mysoll und Käse, die als geschmacksgebende Stoffe Aminosäuren zusammen mit Peptiden enthalten.
In den Zeichnungen gibt Fig. 1 ein Diagramm wieder, das die Ergebnisse der an einer "DEAE-Sephadex"-Säule eluierten PGase-I und PCase-II nach dem Kaliumchlorid-Konzentrationsgradienten zeigt. Fig. 2 zeigt die Elutionskurve einer gereinigten Enzymzubereitung von PGase-I mittels "Sephadex G-1O0". Fig. 3 zeigt die Elutionskurve einer gereinigten Enzymzubereitung der PGase-II.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1 Es wird ein Kulturmedium hergestellt, das 75 g Lactose, 150 g Pepton, 45 g Hefeextrakt, 3,4 g Magnesiumsulfat, 150 mg Eisen(II)-sulfat, 4,1 g Kaliumhydrogenphosphat, 25 g Dinatriumhydrogenphosphat, 10 ml Siliconöl und 15 Liter destilliertes Wasser enthält. Es wir,d auf pH 7,2 eingestellt. Das Kulturmedium wird dann in ein 30 Liter fassendes Fermentationsgefäß gefüllt und 15 Minuten bei 1200C sterilisiert. Getrennt hiervon werden in einen 3 Liter fassenden konische Xolben 750 ml eines Mediums der gleichen Zusammensetzung wie vorstehend gefüllt und darin der Bacillus circulans ATCC 21590 unter 12-stündigem Schütteln bei 300C gezüchtet.
Die sterilisierte Kulturflüssigkeit wird mit dem gezüchteten Stamm beimpft. Nach der Impfung wird die Züchtung bei 300C unter Belüftung mit einer Geschwindigkeit von 8 Litern/Minute und unter Rühren mit 350 UpM durchgeführt. Nach etwa 8 Stunden erreicht das Wachstum des Stammes eine stationäre Phase, doch wird das Züchten weitere 8 Stunden fortgesetzt. Nach dieser Zeit erreicht die Anhäufung der Peptidoglutaminase ein Maximum, d. h. der Gehalt an peptidoglutaminase-i und Peptidoglutaminase-II beträgt 0,312 Einheiten bzw. 0,334 Einheiten je ml Fermentations-Stammes flüssigkeit. Die züchtung wird beendet, und die Zellen des /werden abgetrennt. Das Naßgewicht der abgetrennten Zellen beträgt etwa 200,g. Die feuchten Zellen können in Form einer gemischten Enzyme zubereitung von PGase-I und Püase-II als solche oder in Form sin durch /die Verwendung von Aceton daraus hergestellten Fulvers verwendet werden. 200 g Zellen enthalten 2,340 Einheiten PGase-I und 2,510 Eigheiten PGase-II als Gesamtenzymgehalt.
Beispiel 2 110 g der feuchten Zellen (1,287 Einheiten PGase-I und 1,375 Einheiten PGase-II) werden in einer 0,05 molaren Phosphat-Pufferlösung vom pH 7,2 suspendiert. Die Zellen werden mittels wird Schall zerkleinert und die Suspension/mit sehr hoher Gescharindigkeit zentrifugiert. Die erhaltene überstehende Lösung wird ab-3 getrennt. Es werden 400 cm rohe Enzymlösung erhalten, die 935 Einheiten PGase-I und 1203 Einheiten PGase-II, entsprechend 75 % bzw. 88 %, enthält.
Zu dieser Lösung wird nach und nach eine Lösung gegeben, die 400 mg Streptomycin enthält. Der dadurch gebildete Niederschlag von Nucleinsäuren wird abgetrennt. Eine weitere Ausfällung erfolgt mit Ammonfumsülfat einer Sättigung von 38 bis 54 %. Die ausgefallenen Proteinfraktionen werden abgetrennt. Hierbei wird ein durch Ammoniurlsulfat gelöstes Enzym erhalten, das 950 mg PGase-I als Protein bzw. 954 Einheiten als Enzym (entsprechend einer Ausbeute von 102 %, bezogen auf die rohe Enzymlösung) und 954 mg PGase-II als Protein bzw. 858 Einheiten als Enzym (entsprechend einer Ausbeute von 98 %, bezogen auf die rolle Enzymlösung) enthält.
Dieses wieder gelöste Enzym kann als solches oder in Form eines Pulvers nach Dialyse mit einer geeigneten Pufferlösung und Lyophilisierung verwendet werden.
Beispiel 3 Das in Beispiel 2 erhaltene, durch Ammoniumsulfat gelöste Enzym wird zuerst in einer wäßrigen Lösung von 0,01 Mol Phosphat-Pufferlösung vom pH 7,6, 0,1 Mol Kaliumchlorid und 0,002 Mol Äthylendiamintetraacetat gelöst. Die wäßrige Lösung durchläuft dann eine Säule (4 cm x 90 cm), die mit "Sephadex G-200" beschickt war, das zuvor mit einer Pufferlösung der gleichen Zusammensetzung wie bei der vorstehenden wäßrigen Lösung gepuffert worden war. Dann wird mit der gleichen Pufferlösung eluiert. Aus dem Eluat (jeweils 10 ml-Fraktionen) werden die 50. bis 70. Fraktion gesammelt und hierbei die PGase-I und PGase-II erhalten.
In diesem Falle sind die wirksamen Fraktionen beider Enzyme beinahe identisch. Es werden 200 mg des Enzyms PGase-I als Protein bzw. 540 Einhelten PGase-I als Gesamtenzymgchalt (entsprechend einer Ausbeute von 57 %, bezogen auf die rohe Enzymlösung) und 200 mg des Enzyms PGase-II als Protein bzw. 784 Einheiten als Gesamtenzymgehalt erhalten (entsprechend einer Ausbeute von 65 %, bezogen auf die rohe Enzymlösung).
Eine Lösung des teilweise gereinigten Enzymgemisches aus PGase-I und PGase-II, die nach der vorstehend genannten Arbeitsweise erhalten worden war, wird an einer "DEAE-Sephadox"-Säule (2,0 cm x 40,0 cm) adsorbiert, die zuvor mit einer wäßrigen Lösung von 0,01 Mol Phosphat-Pufferlösung vom pll 8,0, 0,1 Moi,Kaltumchlo"r'id' und 0,002 Mol Xthylendiamintetraacetat gepuffert worden war. Die absorbicrte Enzymlösung wird nach der KCl-Konzentrationsgradienten-Elutionsmethode innerhalb eines Bereichs von 0,1 Mol bis zu 0,5 Mol eluiert. IIierbei wird die PGase-I bei einer KCl-Konzentration von 0,17 Mol bis 0,21 Mol und die PGase-II bei einer KCl-Konzentration von 0,23 Mol bis 0,27 Mol eluiert.
Diese gereinigten Fraktionen werden gesammelt. Es werden 19 mg PGase-I als Protein hz. 309 Einheiten als Gcsamtenzymgehalt (entsprechend einer Ausbeute von 33 %, bezogen auf die rohe Enzymlösung) und 19,6 mg PGase-II als Protein bzw. 638 Einheiten als Gesamtenzymgehalt erhalten (entsprechend einer Ausbeute von .» %). Die Ergebnisse dieser Elution sind in Fig. 1 veranschaulicht.
Anschließend werden die Lösungen der teilweise gereinigten Enzyme PGase-I und PGase-II an einer Säule chromatographiert, die mit Hydroxylapatit ("Bie Ge) HT") beschickt war. Zuvor wird die Lösung des teilweise gereinigten Enzyms PGase-I mit einer 0,01 molaren Phosphat-Pufferlösung auf pH 7,0 eingestellt und läuft dann durch die Säule mit Hydroxylapatit, der zuvor mit 0,01 molarer Phosphat-Pufferlösung vom pH 7,0 gepuffert worden war.
Das Enzym wird adsorbiert. Das adsorbierte Enzym wird nach der linearen Konzentrationsgradienten-Methode unter Verwendung der gleichen Pufferlösung bei 0,02 Mol'bis 0,04 Mol Phosphatkonzentration eluiert. Es werden 2 mg PGase-I als Protein bzw.
129 Einheiten als Gesamtenzymgehalt (entsprechend einer Ausbeute von 13 %, bezogen auf die rohe Enzymlösung) erhalten.
Anschließend wird nach dem gleichen Verfahren mittels 0,035 Mol bis 0,05 Mol Phosphatkonzentration die PGase-II eluiert. Es werden 3,5 mg PGase-II als Protein bzw. 256 Einheiten als Gesamtenzymgehalt eluiert (entsprechend einer Ausbeute von 21 %, bezogen,, auf die rohe Enzymlösung).
Die derart erhaltenen Enzyme werden mit destilliertem Wasser dialysiert und unter vermindertem Druck getrocknet. Es werden Standardprodukte der gereinigten Enzyme PGase-I bzw. PGase-II in Form weißer Pulver erhalten.
Diese Standardprodukte d" gereinigten Enzyme werden an "Sephadex G-100" chromatographiert. Die Fig. 2 und 3 zeigen, daß die einzelnen Produkte von PGase-I bzw. PGase-II jeweils ein einziges Maximum zeigen und deshalb homogen sind.
Beispiel 4 5 kg entfettete Sojabohnen, die mit einer Menge von 125 % Wasser versetzt worden sind, werden 40 Minuten unter Dampfdruck von 1 kg/ cm² gekocht. Die gekochten Sojabohnen werden mit 5 kg geröstetem und pulverisiertem Weizen vermischt und mit Sojasoßen-"Koji"-Sporen besprüht, Die Züchtung wird in an sich bekannter Weise 4, Tage durchgeführt, und es werden 12 kg "Koji" von ausgezeichneter Qualität erhalten. Das erhaltene 1,Xoji" wird in 12 Liter eines 24 zeigen Salzwassers gegeben und die "Koji"-Salzbrühe in an sich bekannter Weise 3 Monate bei etwa 300C unter zeitweiliger Belüftung fermentiert und gereift.
Getrennt hiervon wird Bacillus circulans ATCC 21590 in einer vom pil 7,2 Flüssigkeit/, die durch Zufüges von 0,3 % Hefeextrakt, 1 % Pepton, 0,5 % Lactose, 0,025 g Magnesiumenlaft, 0,001 % Eisen (11)-sulfat und 0,17 % Dikaliumhydrogenphosphat zu 400 Liter Nasser hergestellt werden war, 16 Stunden bei 30°C unter Belüftung gezüchtet, Die Zellen des Bacillus, in deben sich Poptidoglutaminase-I und Peptidoglutaminase-II angesammelt haben, werden mittels Schall zerkleinert und zentrifugiert. Die überstehende Lösung, (1. h, die rohe Enzymlösung, wird abgetrennt und naoli und nach mit einer Streptomycinlösung versetzt. Ein Sediment von Nucleinsäuren wird abgetrennt. @@@ Lösung wird dann mit Ammoniumsulfat bis zu einem Sättigungsgrad von 18 bis 54 % versetzt. Die ausgefallene Fraktion wird abgetrennt und l,yophilisiert. Es werden 4 g eines pulverförmigen rohen Enzyms erhalten, das 4300 Einheiten PGase-1 und 3650 Einheiten PGase-ll enthält. Die derart erhaltene pulverförmige Peptidoglutaminase wird in einer Menge von 2000 Einheiten PGase-II und 1800 Einheiten PGase-II zu der vorsichend hergestellten "Koji"-Salzbrühe unmittelbar vor der Fermentation und Reifung zugefügt und damit vermischt. Nach der 3-menatigen Reifung bei 300C wird die gereifte Nasse ausgepreßt, und es werden 23 Liter Sojasoße mit einem Gesamtstickstoffgchalt von 3- 1t7 % erhalten, wovon die Menge Glutaminsäure 18,9 mg/ml beträgt. Dieser Glutaminsäuregchalt stellt 10,56 % der Sojasoße dar, entsprechend einem bezogen auf den / Anteil des Stickstoffs der erhaltenen Glutaminsäure , / Gesamtstickstoffgehalt. Eine in gleicher Weise hergestellte Sojasoße, jedoch ohne Zusatz von Peptidoglutaminase, weist lediglich einen Glutaminsäure-Stickstoffgehalt von 7,69 %, bezogen auf den Gesamtstickstoffgehalt, auf. Es ist ersichtlich, daß erfindungsgemäß bedeutend mehr Glutaminsäure-Stickstoff gebildet worden ist.
Beispiel 5 Das Verfahren des Beispiels 4,wird wiederholt, wobei die gleiche l'Koji"-Salzbrühe erhalten wird. Getrennt davon wird ein mit Ammoniumsulfat ausgefälltes rohes Enzymgemisch von PGase-I und PGase-II nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 4 hergestellt. Das rohe Enzymgemisch wird an einer "Sephadex G-200"-Säule mit einer Puffer lösung chromatographiert, die 0,01 Mol Phosphat-Pufferfösung vom pH 7,6, 0,1 Mol Kaliumschlorid und 0,002 Mol Äthylendiamiat@@@@acetat enthält. Vom Eluat werden die 50 bis 70. Fraktion gesammelt und daraus ein Enzymgemlsch aus PGase-I urid PGase-II erhalten. Das Enzymgemisch wird an einer "DEAe-Sephadex"-Säule mit einer Puffer lösung adsorbiert, die 0,01 Mol Phosphat-Puffarlösung vom pH 8,0, 0,1 Mol Kaliumchlorid und 0,002 Mol Äthylendiamintetracetat enthält. Danach wird das adsorbierte Enzymgemisch unter Verwendung der gleichen Pufferlösung wie vorstehend nach der KCl-Konzentrationsgradienten-Elutionsmethode eluiert, wobei die KCl-Konzentration 0,1 bis, 0,5 Mol beträgt. PGase-I wird bei einer KCl-Konzontration von 0,17 bis 0,21 liol und PGase-II bei einer KCl-Konzentration von 0,22 bis 0,27 IIol erhalten. fleide Enzyme werden lyophilisiert, und es werden die entsprechenden gereinigten Enzyme erhalten.
1900 Einheiten des gereinigten Enzyms P(;ase-I und 1700 Einheiten des gereinigten Enzyms PGase-II werden zu einer "Koji"-Salzbrühe, die wie vorstehend beschrieben hergestellt worden ist, unmittelbar vor der Fermentierung und Reifung zugesetzt und damit vermischt. Das Verfahren des Beispiels 4 wird wiederholt, und es wird @ine qualitätsmäßig verbesserte Sojasoße von ausg@zeichneter Schm@ckha@tigkeit erhalten. In diesen Sojasoßen betragen die Werte des erhaltenen Glutaminsäure-Stickstoffs, bezogen auf den Gesamtstickstoffg@halt, 8,18 % bzw. 9,14 %. Ohne Zusatz der erfindungsgemäßen Enzyme beträgt der Glutaminsäure-Stickstoffgehalt 7,69 %.
Beispiel 6 100 g Weizengluten werden bis zum Gesamtvolumen von 380 ml mit wird L@itungswasser versetz@, @@s Ganze/gerührt und 30 Minuten unter @@r@@@druck gekocht. Danach wird die Masse mit 5 g eines proteoly-@@@@hen Enzyms (ein handelsüblich erhältliches Enzym, das von @@pe@@@illus oryzae erz@ugt wird und teilweise gereinigt ist; @ersteller: Sigma Co., V.St.A.) und 2,4 g des in Beispiel 4 er-@@@@@@@@, mit Ammoniumsulfat ausgefällt@n Peptido@@taminase-Pulvers versetzt. Das Gemisch wird 3 Tage bei 30°C in Gegenwart von Telaol unter einem'pH-Wert von 5,0 hydrolysiert.
N@@@ @er Beendigung der Hydrolyse wird das Reaktionsgemisch aus-@@@@@@@, und es werden 360 ml eines Glutenhydrolysats von bemerkenswert ausgezeichneter Schmackhaftigkeit erhalten. Die derart erha@@ene flüssige Würze enthält 30 mg/ml Glutaminsäure, wohin-@@gen @@n@ gleiche Würze, die jedoch ohne Zusatz von PGase hergestelle worden lst, lediglich @ mg/ml Glutaminsäure enthält.
@@@ @@@@enhydrolysat kann zur Herstellung von zahlreichen Würzen @@@@ @@@e@ entweder als solches oder n@ch Konzentrierung oder @@@@@@@@@@@lls Trocknung und Pu@ver@sierung in an sich bekannter Weise verwendet'werden.
Beispiel 7 1,3 kg Sojabohnen, die in an sich bekannter Weise 12 Stunden bei Raumtemperatur in Wasser eingetaucht worden sind, werden unter einem Dampfdruck von 0,3 mg/cm² 1 Stund und 40 Minuten gekocht.
Getrennt davon wird 1,5 kg Reis 12 Stunden bei Raumtemperatur in Wasser eingetaucht und unter Normaldruck 1 1/2 Stunden gedämpft.
Der gedämpfte Reis wird zur Rerstellung von "Mise" mit "Koji"-Sporen besprüht und 60 Tage bei etwa 30 0C einer gründlichen Fermenstation unterworfen. Das erhaltene Produkt wird mit 400 g Kochsalz vermischt. Zu diesem Gemisch werden 32 g feuchte Zellen zugegeben, die in an sich bekannter Weise aus gezüchteten Zellen hergestellt worden sind, die durch Flüssigkeitskultur des Bacillus circulans ATCC 21590 in der gleichen Weise wie in Beispiel 4 erhalten worden sind. Das Ganze' wird gründlich gemischt und durch 3-nonatiges Stehenlassen bei 300C gereift. Es wird eine Suspension des "Miso"-Produktes erhalten. Dieses Produkt enthält 46 % Wasser, 12 % rohes Protein, 9,5 % Kochsalz und 6,5 mg/g Glutamins,äure. Ein Kontrollprodukt enthält lediglich 5,1 mg/g Glutaminsäure. Aufgrund einer organoleptischen Untersuchung werden außerordentlich gute Ergebnisse erhalten.
Beispiel 8 10 Liter Kuhmilch werden in ein Käsegefäß gegeben und mit 1 % einer Starterlösung (einer Kultur von Milchsäure erzeugenden Streptokokken) bei 30°C nach d@n üblichen Verfahren z@@ He@stellung von Gouda-Käse vers@tzt. W@nn die Konzentration des Milchsäureg@halts 0,18 bis 0,27 % erreicht hat, wird Labferment zugefügt, so daß das Milchkasein in 10 bis 15 Minuten koagulieren kann. Dann wird 1 g einer Peptidoglutaminase-Zubereitung (mit Ammoniak gefälltes Pulver) zugegeben. Das Gemisch wird kräftig gerührt. Hierbei koaguliert das Protein. Danach wird die Molke abgetrennt. Der koagulierte Quark wird gesammelt, erwärmt, in an sich bekannter Weise verpreßt und dann mit Tafelsalz versetzt.
Das erhaltene Produkt wird 2 Monate bei 15°C ge@@@@@. Es werden 830 g Endprodukt erhalten, das 38,0 % Wasser, 25,5 % Fett, 28,0 % Protein und 3,5 mg/g Glutaminsäure enthält. Aufgrund einer organoleptischen Untersuchung ist das erhaltene Produkt geschmacklich besser als ein solches Endprodukt, das nach dem üblichen Verfahren hergestellt worden ist.

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e :

1. Peptidoglutaminase.

2. Peptidoglutaminaseo nach Anspruch 1 mit eden folgenden Eigenschaf ton: (a) mit einer Aktivität zur Desamidlerung von Glutaminylpeptiden zu Glutamylpeptiden, (b) boilständige Inaktlvierung durch 16-stündiges Aufrechterhalten eines pH 2,5 bei 4°C, (c) Inaktivierung ihrer Aktivilät um 30 bis 60 % in Gegenwart von Quecksilber und Kupfer und (d) Stabilität hei pH-Werten von 6,0 bis 11,4.

3. Peptidoglutaminase nach den Ansprüchen 1 oder 2, g e k e n n z e i c hn e t d u r c h eine Peptidoglutaminase-I mit den nachstchenden Elgenschaften: (a) Aktivität zur Desamidierung von Glutaminylpeptiden, bei denen Glutamin an eine endständige Carboxylgruppe gebunden ist, zu Glutamylpeptiden, (b) vollständige Inaktivlerung durch 16-stündiges Aufrechterhalten eines pH 2,5 bet 4°C.

(c) Inaktivierung ihrer Aktivität um 10 bis 60 % in Gegenwart von Quecksilber und Kupfer, (d) Stabilität bei pH-Werten von 6,0 bis 11,4, (e) Optimum des pH-Wertes bei 7,0 bis 8,0 und (f) einem Molekulargewicht von 80.000 bis 90.000.

4. Peptidoglutaminase nach den Ansprüchen 1 oder 2, gekennzeichne durch eine Peptidoglutaminase-II mit den folgenden Elgenschaften: (a) Aktivität zur Desamidierung von Glutaminylpeptiden, bei denen Glutamin an eine endständige Aminogruppe des Peptids oder im Inneren der Peptidkette angeordnet ist, zu Glutamylpeptiden, (b) vollständige Inaktivierung durch 16-stündiges Aufrechterhalten eines pH 2,5 bei 4°C, (c) Inaktivierung ihrer Aktivität um 30 bis 60 % in Gegenwart von Quecksilber und Kupfer, (d) Stabilität bei pH-Werten von 6,0 bis 11,4, (e) Optimum des pH-Wertes bei 6,5 bis 8,0 und (f) einem Molekulargewicht von 130.000 bis 140.000.

5. Peptidoglutaminase nach den Ansprüchen 1 bis 4, g e k e n n z e i c hn e t durch ein Gemisch von Peptidoglutaminase-I und Peptidoglutaminase-II.

6. Peptidoglutaminase nach den Ansprüchen 1 bis 5 aus einer Züchtung von Bacillus circulans ATCC 21590.

7. Verfahren zur Herstellung der Peptidoglutaminase nach den Ansprüchen 1 bis 6, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daß man einen Peptidoglutaminase erzeugenden Mikroorganismus der Gattung Bacillus circulans ATCC 21590 unter aeroben Bedingungen in einer Kulturflüssigkelt züchtet und die in den Zellen des Mikroorganlsmus und/oder in der Kulturflüsslgkelt vorllegende Peptidoglutaminase isoliert.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekenn'zeichnet, daus man im wesentlichen Peptidoglutaminase-l isoliert.

9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass man im wesentlichen Peptidoglutaminase-II isoliert.

10. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass man im wesentlichen ein Gemisch aus Peptidoglutaminase-I und Peptidoglutaminase-II isoliert.

11. Verwendung der Peptidoglutaminase nach den Ansprüchen 1 bis 10 in Getränken und Nahrungsmitteln.

12. Verwendung der Peptidoglutaminase nach Ansp,ruch 11 in einer Menge von 0,01 bix 100 Einheiten je Milliliter des Getrânks oder Nahrungsmittels.

13. Verwendung nach den Ansprüchen 11 und 12 in Form von Zellen des Bacillus circulans ATCC 21590, lyophilisierten Zellen und/oder Pulver von mit Aceton behandelten Zellen.

14. Verwendung nach den Ansprüchen 11 bis 13 bei Protein enthaltenden Nahrungsmitteln, insbesondere Sojabohnen, entfetteten Sojabohnen, Weizenmehl, Weizengluten, "Koji", "Miso" und Milch.

L e e r s e i t e