DE2038996A1 - Verfahren zum Schutz von Aminoresten mit einer Pyridylmethyloxycarbonylgruppe oder einem ihrer Derivate - Google Patents
Verfahren zum Schutz von Aminoresten mit einer Pyridylmethyloxycarbonylgruppe oder einem ihrer DerivateInfo
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Description
Dr. F. Zumstein sei;. - Cv. Li. Assmann
Dr. Jt Koenigiberger --Di1JLF'iiyj.-R. Holibeuer
• MOaehan 2, lrauhauMtnrB«.4/ill
SC 3507/3735
KIONE-POULENC S.A., Paris/Prankreich
Verfahren ziim Schutz von Aminoresten mit einer
Pyridylmethyloxycarbonylgruppe oder einem ihrer Derivate
Hie vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren
zum Schützen von Aminogruppen.
Es ist bekannt, dass es bei Synthesen, bei denen polyfunktionelle
Aminoverbindungen eingesetzt werden, und insbesondere bei den Peptidsynthesen,erforderlich ist,
die Aminoreste, die nicht an der Reaktion teilnehmen, vorübergehend zu schützen, um speziell die gewünschten Produkte
zu erhalten. Zahlreiche Schutzgruppen für Aminoreste
werden üblicherweise in der Peptidchemie verwendet, wie
beispielsweise Benzyloxycarbonyl-, tert.-Butyloxycarbonyl-»
p-Soluolsulfonyl- und 2-Nitrosulfenylgruppen usw.
Alle diese Schutzgruppen, die sich an die Aminoreste in
kovalenter Weise binden, setzen die Polarität der erhaltenen Verbindungen beträchtlich herab und verhindern auch
deren Salzbildung, wobei auch deren Löslichkeit in Wasser stark herabgesetzt ist und sogar völlig ausgeschaltet sein
kann. .
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2038991
Eb kann nun von Bedeutung sein, die Löslichkeit einer Verbindung, deren Aminorest oder Aminoreste vorübergehend
geschützt ist bzw. sind, in Wasser aufrechtzuerhalten« Wenn man die go geschützte Verbindung einer enzymatischen
Einwirkung aussetzen will, so ist diese Löslichkeit sogar unerlässlich.
Es wurde nun gefunden, dass Schutzgruppen der allgemeinen Formel
Py-CH- OCO -
I (D
in der Py einen gegebenenfalls durch einen Methylrest substituierten
Pyridyl- oder Pyridyl-N-oxydrest bedeutet und
R ein Wasserstoffatom, einen geradkettigen oder verzweigten
Alkylrest mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen oder einen Phenylrest
darstellt, Schutzgruppen sind, die ermöglichentgewisse
Reaktionen leicht durchzuführen.
Die Vorteile dieser neuen Schutzgruppen sind die folgenden:
1. Die nach Schützen der Aminoreste erhaltenen Produkte sind im allgemeinen in Wasser löslich· Sie haben in wässrigem
Medium eine grosse Stabilität und ermöglichen, Reaktionen bei pH-Werten zwischen 3 und 11 und insbesondere
enzymatisch^ Reaktionen durchzuführen·
2. Die Reste ermöglichen die Anwendung der üblichen
Synthesemethoden in der Peptidchemie, beispielsweise Kondensationen
nach der Methode mit aktivierten Estern, Aziden, gemischten Anhydriden, Carbodiimid und dergleichen. Sie ermöglichen
auch die Durchführung der Kondensationen in fester Phase (Methode nach Merrifield)·
3· Die Entfernung der neuen Schutzgruppen der Formel I
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erfolgt glatt und unter Aufrechterhaltung der Peptidbindungen
durch Hydrogenolyse und insbesondere durch Einwirkung
von Wasserstoff in Anwesenheit von Palladium oder durch Einwirkung von Natrium in flüssigem Ammoniak. Die
Acidolyse greift die neuen Schutzgruppen nicht an, und man ktinn daher differentielle Ent block ie runge η bezüglich anderer
Schutzgruppe^, wie beispielsweise der Benzyloxycarbony]oder
tert.-Butyloxycarbonylgruppen, die durch Acidolyse entfernt werden, vornehmen» ·
Die Einführung der neuen Gruppen in eine Verbindung, die
eine oder mehrere Aminoreste aufweist, wird durch Anwendung
an eich bekannter Methoden vorgenommen, beispielsweise durch Einwirkung eines Chlorformiats, Azids oder
gemischten Carbonate, das von dem Best der allgemeinen
Formel I staiimt, mit der Verbindung, die einen oder
mehrere Aminoreste aufweist. Man arbeitet vorzugsweise durch Umseteung mit einem gemischten Carbonat der
allgemeinen Formel
Py - CH - O CO O T
I (II)
in der Py und R die oben angegebenen Bedeutungen besitzen
und T einen Phenyl- oder substituierten Phenylrest, wie
beispielsweise p-Nitrophenyl oder 2,4,5-Trichlorphenyl,
oder einen von einem Heterocyclus abgeleiteten Rest, wie beispielsweise Chinolyl-(8) oder 2,5 —Dioxopyrrolidinyl-(i),
darstellt· Die Reaktion wird vorteilhafterweise
in einem organischen Lösungsmittel, wie beispielsweise Dimethylformamid, oder in einem wässrig-organischen Lösungsmittel,
wie beispielsweise einem Gemisch tert.-Butanol-Wasser,
bei einer Temperatur zwischen 15 und 60 0C
durchgeführt.
Die gemischten Carbonate der allgemeinen Formel II können
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durch Umsetzung eines Chlorfonniato der allgemeinen Formol
Cl CO O T (III)
in der T die oben angegebene Bedeutung besitzt, mit einem Alkohol der allgemeinen Formel
Pv - CH - OH
I (IV)
in der Py und R die oben angegebenen Bedeutungen besitzen, hergestellt werden· Diese Reaktion erfolgt in einem organischen
Lösungsmittel, wie beispielsweise Pyridin oder
einem Pyridin-Methylenchlorid-Gemisch, bei einer Temperatur zwischen 0 und 20 0C.
einem Pyridin-Methylenchlorid-Gemisch, bei einer Temperatur zwischen 0 und 20 0C.
Wenn das Symbol Py einen Pyridyl-N-oxydrest darstellt,
können die gemischten Carbonate der allgemeinen Formel II auch aus Carbonaten der allgemeinen Formel II, für welche' Py einen Pyridylrest bedeutet, durch Oxydation mit einem geeigneten Oxydationsmittel, wie beispielsweise p—Nitroperbenzoesäure, erhalten werden. Man kann gegebenenfalls die Oxydation des Stickstoffs des Pyridylrests nach der
Kondensation der neuen Schutzgruppe mit einem Aminorest
vornehmen. Die Oxydation wird unter den oben beschriebenen Bedingungen vorgenommen.
können die gemischten Carbonate der allgemeinen Formel II auch aus Carbonaten der allgemeinen Formel II, für welche' Py einen Pyridylrest bedeutet, durch Oxydation mit einem geeigneten Oxydationsmittel, wie beispielsweise p—Nitroperbenzoesäure, erhalten werden. Man kann gegebenenfalls die Oxydation des Stickstoffs des Pyridylrests nach der
Kondensation der neuen Schutzgruppe mit einem Aminorest
vornehmen. Die Oxydation wird unter den oben beschriebenen Bedingungen vorgenommen.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken«
Beiapiel 1
Zu einer auf 0 0C abgekühlten Löeung von 109,1 g
3-Hydroxymethylpyridin in 500 cnr Pyridin setzt man
in kleinen Anteilen innerhalb von etwa 1 1/4 Stunden
201,54 g p-Nitrophenylchlorformiat zu. Man setzt das
3-Hydroxymethylpyridin in 500 cnr Pyridin setzt man
in kleinen Anteilen innerhalb von etwa 1 1/4 Stunden
201,54 g p-Nitrophenylchlorformiat zu. Man setzt das
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Rühren des Reaktionsgemisches eine Stunde bei O 0G fort,
lässt die Temperatur auf 20 0C ansteigen und setzt das
Rühren noch 16 Stunden "bei dieser Temperatur fort.
Man gibt dann 1,6 liter Methylenchlorid zu und wäscht dreimal mit je 500 em destilliertem Wasser und dann mit
500 cm einer gesättigten Natriumchloridlösung. Die organische Lösung wird über Natriumsulfat getrocknet
und dann unter vermindertem Druck (20 Dim Hg) bei 50 C
zur Trockne eingeengt. Das erhaltene Öl wird in 1,6 Liter Äthanol gelöst, und die Lösung wird 16 Stunden bei 0 0C
stehen gelassen. Der erhaltene Niederschlag wird abfiltriert, mit 100 cm Äthanol gewaschen und unter vermindertem
Druck (0,3 mm Hg) getrocknet. Man erhält 128 g
Pyridyl-(5)-methyl-p-nitrophenyl-carbonat vom P = 93°C
(augenblicklicher Schmelzpunkt, Kofier).
Rf = 0,73 ^Silicagelj Methanol-I^-Dichloräthan (2:8
VoluminaJ|7
| Analyse; | berechnet: | C | = 56, | 94 | H = | 3 | ,67 | N = | 10, | 21 % |
| gefunden; | 57, | 58 | 3 | ,86 | 9, | 89 #. | ||||
| Beispiel |
Zu einer Lösung von 5,45 g 3-Hydroxymethylpyridin in einem
Gemisch von 3,95 g Pyridin und 25 cm Methylenchlorid setzt man tropfenweise innerhalb von 1/2 Stunde eine Losung
von 10,08 g p-Nitrophenylchlorformiat in 20 cm
Methylenchlorid zu» Das Reaktionsgemisch wird bei einer Temperatur unter 35 0C gehalten. Nach beendeter Zugabe
rührt man das Reaktionsgemisch noch 18 Stunden bei 20 0C
weiter. Das Reaktionsgemisch wird anschliessend zweimal
3 3
mit je 20 cm Wasser, zweimal mit je 20 cm einer wäss
rigen 5 $-igen (Gewicht/Volumen) Natriumbicarbonatlösung
3
und zweimal mit je 20 cm einer wässrigen gesättigten Natriumchloridlösung gewaschen· Die organische Lösung wird über Natriumsulfat getrocknet und dann unter ver-
und zweimal mit je 20 cm einer wässrigen gesättigten Natriumchloridlösung gewaschen· Die organische Lösung wird über Natriumsulfat getrocknet und dann unter ver-
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mindertem Druck (15 mm Hg) bei 50 0C eingeengt. Der erhalfcene
feste Rückstand wird in 80 cm Äthanol aufgenommen, und das unlösliche Material wird abfiltriert, mit
25 cm Äthanol gewaschen und unter vermindertem Druck
(0,3 mm Hg) bei 20 0O getrocknet. Man erhält so 8,2 g
Pyridyl-(3)-methyl-p-nitrophenyl·carbonat vom P = 92 0C
(augenblicklicher Schmelzpunkt, Kofier), das mit dem Produkt von Beispiel 1 identisch ist.
Die Mutterlaugen v/erden unter vermindertem Druck (15 mm Hg) bei 50 0O zur Trockne eingeengt. Der erhaltene feste Rückstand
wird in 20 cm Äthanol aufgenommen, und das unlösliche Material wird abfiltriert, mit 10 crr Äthanol gewaschen
und unter vermindertem Druck (0,3 mm Hg) bei 200C
getrocknet. Man erhält so zusätzlich 1,02 g Pyridyl-(3)-methyl-p-nitrophenyl-carbonat·
Zu 4,36 g 4-Hydroxymethylpyridin in einem Gemisch von
3» 16 g Pyri'din und 35 cm Methylenchlorid fügt man tropfenweise unter Halten des Reaktionsgemische bei 0 0C eine
3 Lösung von 8,06 g p-Nitrophenyl-chlorformiat in 40 cm
Methylenchlorid zu· Nach beendeter Zugabe rührt man das Reaktionsgemisch noch 18 Stunden bei 0 0C weiter· Das
Reaktionsgemisch wird zweimal mit je 20 cm Wasser, zweimal
mit je 20 cm5 einer wässrigen 5 ?i-igen (Gewicht/Volumen)
Natriumbicarbonatlösung und zweimal mit je 20 cm einer wässrigen gesättigten Natriumchloridlösung gewaschen.
Die organische Lösung wird unter vermindertem Druck (15 mm Hg) bei 30 0C zur Trockne eingeengt· Das erhaltene
zurückbleibende Öl wird in 600 cm Äther aufgenommen· Der unlösliche Bestandteil wird durch Filtrieren
entfernt. Nach Einengen des Filtrate unter vermindertem Druck (30 mm Hg) bei 20 °C zur Trockne erhält man 4,1 g
Pyridyl-(4)-methyl-p-nitrophenyl-carbonat vom F = 83 0O
(augenblicklicher Schmelzpunkt, Kofier)·
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Rf = 0,61 ^Silicagel; Hethanol-1,2-Dichloräthan
(5 : 95 Volumina J7
Durch Arbeiten in der gleichen Weise, ausgehend von
2,46 g 2-Hydroxymethyl-6-methylpyridin und 4,03 g p-Hitrophenyl-chlorformiat erhält man 1,30 g 6-Methylpyridyl-(2)-methyl-p-nitrophenyl-carbonat·
säure-Pyridin-Cyclohexan (5:15:5:10:15 VoluminaJ7·
Zu einer Lösung von 5#45 g 3-Hydroxymethyl-pyridin in
einem Gemisch von 3,95 g Pyridln und 45 cm Methylenchlorid setzt man tropfenweise innerhalb 20 Hinuten unter Halten des Reaktionsgemische bei einer Temperatur
unter 35 0O eine Lösung von 13 g 2,4,5-TrichUorphenylchlorformiat in 20 cm' Hethylenchlorid zu. Einige
Hinuten nach beendeter Zugabe dee Chlorformiats tritt
ein gelber niederschlag auf« Man setzt das Rühren des
Reaktionsgemische 20 Stunden bei 20 0C fort. Dann gibt
man 20 cm destilliertes Wasser zu· Der Niederschlag löst Qiche Die organische Phase wird abgetrennt und zweimal
mit je 25 cm destilliertem Wasser, 25 cn5 einer 5 Taigen (Gewicht je Volumen) Natriumbicarbonatlösung und
25 cm einer gesättigten Natriumchloridlösung gewaschen·
Die organische Lösung wird über Natriumsulfat getrocknet und dann unter vermindertem Druck (20 mm Hg) bei
50 0C zur Trockne eingeengt· Der erhaltene feste Rückstand wird in der minimalen Menge siedendem Methanol
(30 our) gelöst, und die Lösung wird eine Stunde bei
20 0C stehengelassen« Der gebildete Niederschlag wird
abfiltriert, mit 30 cm Methanol gewaschen und unter verminderten Druck (0,3 am Hg) bei 20 0C getrocknet·
Man erhält 7,8 g Pyridyl-(3)-«ethyl-2>4,5-trichlorphenyl-
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carbonat vom P = 95 0C (augenblicklicher Schmelzpunkt,
Kofier). Durch Einengung der Mutterlaugen erhält man eine zweite Fraktion an Produkt von 0,7 g, das bei 95 0C
schmilzt (augenblicklicher Schmelzpunkt,Kofbr).
Analyse:
berechnet: C = 46,95 II = 2,42 N = 4,21 Cl = 31,98 $
gefunden: 47,69 2,8 4,11 31,41 #
Zu einer auf 0 0C abgekühlten Lösung von 1 g 3-Hydroxy-
methylpyridin-ll-oxyd in 14 cm Pyridin setzt man in kleinen Anteilen innerhalb von 30 Minuten 1,61 g p-Nitrophenylchlorformiat
zu. Man hält das Rühren des Reaktionsgemisches 17 Stunden bei etwa 20 0C aufrecht. Der gebildete
Niederschlag wird abfiltriert, zweimal mit je 4 cm Pyridin gewaschen und unter vermindertem DrucK (0,3 mm Hg)
bei 20 0C getrocknet. Man erhält so 1,2 g N-0xopyridyl-(3)·
methyl-p-nitrophenyl-carbonat vom F= 160 0C (augenblicklicher
Schmelzpunkt, Kofier).
Das als Ausgangesubstanz verwendete 3-Hydroxymethylpyridin-N-oxyd
kann auf folgende Weise erhalten werden:
Zu einer auf 0 0C abgekühlten Lösung von 10,9 g 3-Hydroxymethyl-pyridin
in 200 cm Äthylacetat setzt man 21,96 g p-Nitroperbenzoesäure zu» Nach 15-minütigem Rühren bei
0 C und anschliesoendem fortschreitenden Erwärmen des
Reaktionsgemische auf etwa 20 0C wird der erhaltene Niederschlag
abfiltriert, mit 100 cm Äthylacetat gewaschen und unter vermindertem Druck (0,3 mm Hg) bei etwa 20 0C
getrocknet. Das erhaltene Produkt wird dann in 200 cm
destilliertem Wasser suspendiert. Zu dieser Suspension setzt man 90 cnr Harz Amberlite IRA 402 in Carbonatform
zu und rührt das Gemisch 25 Minuten bei etwa 20 0C. Das Harz wird abfiltriert und zweimal mit je 100 cm
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destilliertem Wasser gewaschen. Das Filtrat und die
Waschflüssigkeiten werden vereinigt und unter vermindertem
Druck (20 mm Hg) bei 55 °C zur Trockne eingeengt» Das erhaltene Öl wird in 80 cm siedendem Äthylacetat
gelöst. Nach fortschreitender Abkühlung auf 20 0C und
15-minütigem Halten bei dieser Temperatur wird der gebildete
Niederschlag abfiltriert und mit 50 cm5 Ithylacetat
gewaschen.
Nach Trocknen unter vermindertem Druck (0,3 mm Hg) bei 20 0C erhält man 11,6 g 3-Hydroxymethylpyridin-N-oxyd
vom F= 90 0C (augenblicklicher Schmelzpunkt, Kofier),
Analysei berechnet: N —>
0 23,98 °/o gefunden: 23,70 ^,
Zu einer auf 0 0O abgekühlten Lösung von 1,39 g 2-Hydroxymethyl-6-methylpyridin-N-oxyd
in 20 cm Pyridin setzt man 2,02 g p-Nitrophenylchlorformiat zu. Nach beendeter Zugabe
setzt man das Rühren des Reaktionsgemische 17 Stunden bei etwa 20 0C fort· Der gebildete Niederschlag wird
•5 abfiltriert, zweimal mit Je 4 cm Pyridin gewaschen und
unter vermindertem Druck (0,3 mm Hg) bei 20 0O getrocknet.
Man erhält so 0,49 g N-0xo~6-methylpyridyl-(2)-methylp-nitrophenyl-carbonat·
Analyse:
| berechnet: | G — | 55 | ,27 | H = | 3, | 97 | N s | 9, | 21 |
| gefunden: | 55 | ,17 | 4, | 04 | 9, | 11 |
Das Ausgangsprodukt wird durch Arbeiten wie in Beispiel 5,
jedoch ausgehend von 3,08 g 2-Hydroxymethyl-6-methylpyridin und 5,49 g p-Nitroperbenzoesäure erhalten. Man er-
109808/22 7 3
hält so 2,31 g 2-Hydroxymethyl-6-methylpyridin-N-oxyd
vom P= 114 0C (augenblicklicher Schmelzpunkt, Kofier).
| Analyse: | 7 | berechnet: | N | —> O | 11 | ,5 |
| gefunden: | 11 | ,2 | ||||
| .Beispiel | ||||||
Zu einer auf 0 0C abgekühlten Lösung von 1,25 g
4-Hydroxymethyl-pyridin-N-oxyd in 20 cm Pyridin setzt
man 2,02 g p-Nitrophenyl-chlorformiat zu# Nach beendeter
Zugabe rührt man das Reaktionsgemisch noch 17 Stunden bei etwa 20 °C weiter. Der gebildete Niederschlag wird abfiltriert,
zweimal mit je 4 cm Pyridin gewaschen und unter vermindertem Druck (0,3 mm Hg) bei 20 0C getrocknet·
Man erhält so 0,67 g N-0xopyridyl-(4)-methyl-p-nitrophenylcarbonat.
Analyee: berechnet: C = 53t80 H = 3,47 N = 9,65 1°
gefunden: 52,90 3,70 9f68 #
Das Auegangsprodukt wird durch Arbeiten wie in Beispiel 5, jedoch ausgehend von 2,72 g 4-Hydroxymethylpyridin
und 5,49 g p-Nitroperbenzoesäure hergestellt.
Man erhält so 1,74 g 4-Hydroxymethyl-pyridin-N-oxyd vom F = 125 0C (augenblicklicher Schmelzpunkt|Kofler)#
Analyses berechnet: N —£ 0 12,8 #
gefunden: 13,0 $>.
Zu einer Lösung von 5 g Pyridyl-(3)-methyl-2,4,5-trichlorphenyl-carbonat
(hergestellt gemäss Beispiel 4) in 80 car Chloroform setzt man 3,3 g p-Nitroperbenzoesäure.
Nach 16-Stündigem Rühren bei 200C wird der gebilde -
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te niederschlag durch Filtrieren abgetrennt und mit 20 cm
Chloroform gewaschen· Die vereinigten organischen Lösungen werden tint er vermindertem Druck (13 mm Hg) bei 50 0C
auf 50 car eingeengt· Das Konzentrat wird 10 Minuten mit einer wässrigen 15 jk-igen (Gewicht/Volumen) Natriumcarbonatlösung
gerührt· Die wässrige Phase wird abgetrennt und mit 20 cm Chloroform gewaschen· Die organischen Phasen
■5
werden vereinigt und nacheinander mit 20 cm einer wässrigen
15 #-igen (Gewicht/Volumen) Natriumcarbonatlösung,
20 cm destilliertem Wasser und 20 cm einer gesättigten
Natriumchloridlösung gewaschen· Die organische Lösung wird Ulcer Natriumsulfat getrocknet und dann unter vermindertem
Druck (13 mm Hg) bei 50 0C zur Trockne eingeengt« Man erhält
so 4,2 g N-0xopyridyl-(3)-methyl-2,4,5-trichlorphenyl-carbonat
vom P s 169 0C (augenblicklicher Schmelzpunkt,
Kofier)· Eine aus Methanol umkristallisierte Probe schmilzt bei 171 0C (augenblicklicher Schmelzpunkt, Kofier)«
Analyse!
berechne** C =44,79 H = 2,31 N = 4,02 Cl = 30,51 *
gefunden* 44,9 2,6 3,75 30,6 *
Zu einer Lösung von 15,1 g Pyridyl-(3)-methyl-p-nitrophenyl-carbonat
(hergestellt wie in Beispiel 1 oder 2) in 400 cm Chloroform setzt man 12,1 g p-Hitroperbenzoesäure
zu· Nach 16-stündigea Rühren bei 20 0C wird der gebildete
Niederschlag abfiltriert und zweimal nit je 100 cm5 Chloroform
gewaschen· Das PiItrat und die Waschflüssigkeiten werden
vereinigt und unter vermindertem Druck (17 mm Hg) bei 30 0C zur Trockne eingeengt«
Der feste Rückstand wird in 600 cm - Äther suspendiert,
und die Suspension wird 10 Minuten kräftig gerührt«
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Das unlösliche Material wird abfiltriert und erneut in 600 cm Äther suspendiert· Nach 10-minütigem Rühren wird
das unlösliche Material abfiltriert, mit 100 cm Äther gewaschen und unter vermindertem Druck (0,3 mm Hg) bei
20 °0 getrocknet· Man erhält so 14,9 g N-Oxopyridyl-(3
)Hnethyl-p-nitrophenyl-carbonat ·
Rf = 0,4 ^3ilicagelf Methanol-I^j-Dichloräthan
(2 ι 8 Voluminaj7·
Zu einer Lösung von 25 g N-OT-tert-Butyloxycarbonyl-K-^-
benzyloxycarbonyl-L-lysin in 250 cm Äthanol setzt man
9,2 cm' Triäthylamin zu. Man rührt 3 Minuten bei 20 0C
und engt dann unter vermindertem Druck (20 mm Hg) bei 50 0C sur Trockne ein· Das erhaltene Öl wird in 220 cnr
Äthanol gelöst· Zu der erhaltenen Lösung gibt man 150 g zuvor chlormethyliertes Styrol-Divinylbenzol-Harζ (da3 im
folgenden chlormethyliertes "Polymeres11 genannt wird) mit
einem Gehalt von 0,70 Milliäquivalenten Chlor je Gramm zu.
Man hält da3 Reaktionsgemisch 48 Stunden bei 78 0C in Bewegung·
Das Polymere wird abfiltriert, nacheinander viermal mit je 250 cm Äthanol, viermal mit je 250 cnr destilliertem
Wasser und viermal mit je 250 cm Methanol gewaschen und dann unter vermindertem Druck (0,3 mm Hg) bei
20 0C getrocknet. Man erhält 161 g N-d-tert.-Butyloxycarbonyl-N-6-benzyloxycarbonyl-L-lysyl-"Polymeresn
(L-Lysin : 0,15 mMol je g Polymeres).
Die beiden Aminosäuren, N-d-tertr-Butyloxycarbonyl-II-^-
pyridyl-( 3) -methyl oxycarbonyl-L-e*, ^ -diaminobuttersäure
und N-tert.-Butyloxycarbonylglycin, werden nacheinander
an das erste Zwischenprodukt, N-at-tert.-Butyloxycarbonyl-N-£-benzyloxycarbonyl-L-lysyl-"Pclymere"
gebunden, indem man die folgende Reihe von Arbeitsgängen durchführt:
109808/2273
1. Man wäscht das Zwischenprodukt "blockierte-Aminosäure—"Polymeres"
dreimal mit je 10 cm Eisessig, jeder Säurezugabe folgt ein 3-minütiges Rühren und dann ein
Absaugen.
2, Die Schutzgruppe desoC-Aminorests der Aminosäure
"λ
wird anschliessend durch Zugabe von 10 cm einer InChlorwasserstoff
lösung in Essigsäure, 30-minütiges Rühren und anschliessendes Absaugen entfernt,
3 ο Das erhaltene Produkt wird nacheinander mit :
a) dreimal 10 cm Essigsäure
b) dreimal 10 cnr Äthanol
c) dreimal 10 cnr Chloroform
gewaschen, wobei nach jeder Reagenszugabe 3 Minuten gerührt
und jedesmal abgesaugt· wird.
4· Man neutralisiert dann das erhaltene Produkt durch Zugabe von 10 cm eines Gemische Chloroform-Triäthylarain
(9 : 1 Volumina), 20-minütiges Rühren und anschliessendes Absaugen·
5· Man wäscht das erhaltene Produkt aufeinanderfolgend mit χ
a) dreimal 10 ora Chloroform
b) dreimal 10 cnr Äthanol
c) dreimal 10 cnr Methylenchlorid
wobei man nach jeder Beagenszugabe 3 Minuten rührt und
jedesmal absaugt«
6. ! Man setzt dann nacheinander die folgenden Reagentien
zu ι
109808/2273
-14- 2038998
a) die folgende Aminosäure, deren Aminorest oder
deren Aminoreste geschützt iat bzw. sind, in
Lösung in K
10 Minuten;
10 Minuten;
•5
lösung in 10 cm Methylenchlorid und rührt
•2
b) Dicyclohexyloarbodiimid in 5 cm Methylenchlorid,
rührt 17 Stunden und saugt abj
7· Man wäscht dann das erhaltene Produkt nacheinander mit χ
a) dreimal 10 cm Methylenchlorid
b) dreimal 10 cm Äthanol
wobei man nach jeder Reagenazugabe 3 Minuten rührt und
jedesmal absaugt.
Diese Folge von 'Arbeitsgängen wird für die Kondensation
jeder Aminosäure wiederholt. Nach der Kondensation der abschliessenden Aminosäure (Arbeitsgang 6) führt man die
Arbeitsgänge 7a und 7b durch«
Zusammenfassend führt man für die Kondensation jeder Aminosäure alle in der nachfolgenden Tabelle angegebenen
Stufen durch t
109800/2273
|
Arbeite
gang |
I
m Reagens |
Zähl
der Ar beits gänge |
Vol.
des Rea gens cm |
Dauer des
Bewegens für jed. Arbeits gang in Minuten |
Zweck |
| 1 | Essigsäure | 3 | 10 | 3 | Waschen |
| 2 |
In-Chlorwas-
serstofflö sung in Essigsäure |
1 | 10 | 30 |
Entfernung
von Schutz gruppen |
| 3a | Essigsäure | 3 | 10 | 3 | Waschen |
| 3b | Äthanol | 3 | 10 | 3 | Waschen |
| 3c | Chloroform | 3 | 10 | 3 | Waschen |
| 4 | CHCl3 + | ||||
| 9U (Vol.) | 1 | 10 | 20 | Neutralisatlon | |
| 5a | Chloroform | 3 | 10 | 3 | Waschen |
| 5b | Äthanol | 3 | 10 | 3 | Waschen |
| 5c |
Methylen-
chlorid |
3 | 10 | 3 | Waschen |
| 6a |
blockierte
Aminosäure in CH2Cl2 |
1 | 10 | 10 | Mischen |
| 6b |
Bicyclohexyl-
carbodiimid in CH2Cl2 |
1 | 5 | 17 Btd. | Kondensation |
| 7a |
Methylen
chlorid |
3 | 10 | 3 | Waschen |
| 7b | Äthanol | 3 | 10 | 3 | Waschen |
Man saugt zwischen jedem Arbeitsgang auseer zwischen den Arbeitsgängen 6a und 6b ab* Alle Arbeitsgänge werden bei einer Temperatur in der Nähe von 20 0C durchgeführt.
109808/2273
Herstellung von N-terfr ,-Biityloxycapbonylfclycyl-II-jif-pyrid.yl- (3 j-netiiyloxycarbonyl-L-^o} -diam nobutyryl-N-^r-frensyloxycarbonyl-I-lysyl-hydragid
In ein Eeaktionsgefäss, das mit einem Rührer und an
seinem unteren' Teil mit einem Glacfrittenfilter ausgestattet
ist, bringt man 1, 67 g N-oC-tert.-Butyloxycarbonyl-H-S-benzyloxycarbonyl-L-lysyl-^Polymeres11,
das wie oben hergestellt ist und 0,25 mMol blockiertes Lysin enthält, ein. Nach Durchführung der Arbeitsgänge
1 des Acetatst der fa e
1 bis 5 setzt man 413 mg/N-.x-tert.-Butyloxycarbonyl-N-
^-pyridyl-(3)-methyloxycarbonyl-L-o',3?-diaminobuttersäure
(hergestellt wie in Beispiel 18) in 10 cm Methylenchlorid zu. Nach 10-minütigem Rühren setzt man 206 mg
N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid in 5 cm Methylenchlorid zu.
Man führt den Arbeitsgang 6b wie oben angegeben durch und führt dann nacheinander die Arbeitsgänge 7 und 1 bis
5 durch. Während des Arbeitsgangs 2 entfernt man den tert.-Butyloxycarbonylrest, der die ot- -Aminofunktion der
θί,^-Diaminobuttersäure schützt, ohne Angriff des Pyridyl-(3)-methyloxycarbonylrests,
der die ^-Aminofunktion derselben
Säure schützt, selektiv.
Man setzt dann 175 mg N-tert.-Butyloxycarbonylglycin in
10 cnr Methylenchlorid zu. Man rührt 10 Minuten und gibt dann 206 mg N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid in Lösung
in 5 cnr Methylenchlorid zu. Man führt den Arbeitsgang 6b wie oben angegeben durch und nimmt dann nacheinander
die Arbeitsgänge 7a und 7b vor.
Man erhält so N-tert.-Butyloxycarbonylglycyl-N-tf-pyridyl-(3)-methyloxycarbonyl-L-<t,f-diaminobutyryl-N-f'-benzyloxycarbonyl-L-lysyl-"Polymeres".
Dieses Produkt wird dreimal mit je 10 cm' Dimethylformamid
gewaschen und dann in 20 cm einer Dimethylformamid-
109808/2273
lösung mit 22 <fo (Vol/Vol) Hydrazinhydrat suspendiert.
Man rührt das Reaktionsmedium 20 Stunden bei 20 0C.
•χ
Dann filtriert man und wäscht mit 10 cxr Dimethylformamid.
Man engt unter vermindertem Druck (0,3 mm Hg) bei 50 0C zur Trockne ein. Man erhält N-tert.-Butyloxycarbonylglycyl-N-^-pyridyl-(3
)-me thyloxycarbonyl-L-flt, $-
diaminobutyryl-N-E-benzyloxycarbonyl-L-lysyl-hydrazid.
Rf = 0,61 (Silicagelj Methanol).
Nach vollständiger Hydrolyse zeigt die Analyse in einem Technicon-Autoanalysiergerät das Vorhandensein, der
folgenden Aminosäuren :
Lys = 1,14 (Theorie 1) Dab = 1,0 (Theorie 1) GIy = 1,0 (Theorie 1).
Zu einer Suspension von 12g Colistin in 900 cm Dimethylformamid
setzt man 30 g gemäss Beispiel 5 hergestelltes
N-0xopyridyl-(3)-methyl-p-nitrophenyl-carbonat
zu. Nach 64 stündigem Rühren bei 20 0C wird das unlösliche
Material durch Filtrieren abgetrennt. Das Filtrat wird auf 2/3 seines Volumens unter vermindertem Druck
(0,3 mm Hg) bei 50 0G eingeengt. Zu dem Konzentrat setzt
man 500 cnr Äther zu. Es scheidet sich ein öl ab, das man
abtrennt und in 500 cm Methanol löst. Zu der erhaltenen
■z
Lösung setzt man 500 cmr Äther zu. Es scheidet sich ein
öl ab, das dann kristallisiert. Nach 15-stündigem Stehenlassen
bei 20 0C werden die Kristalle abfiltriert, mit
100 cnr Äther gewaschen und unter vermindertem Druck (0,3 mm Hg) bei 20 0O getrocknet. Man erhält so 16,8 g
Penta-N-^N-oxopyridyl-(3)-methyloxycarbonylZ-colistin.
Rf = 0,32 /Silicagel·, n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser
(50 : 20 s 6 : 24 Volumina]^ Analyse: berechnet: N —^ 0 7,79 Ί»
gefunden: 7,60 #.
109808/22 73
■χ
Zu einer Lösung von '3*51 g Colistin in 140 cm Dimethylformamid
setzt man 16,5 g gemäss Beispiel 1 oder 2 hergestelltes Pyridyl-(3)-methyl-p-nitrophenyl-carbonat zu.
Nach 48-Btündigem Rühren bei etwa 20 0C wird das unlösliche
Material durch Filtrieren abgetrennt und das FiI-trat unter vermindertem Druck (0,3*mm Hg) bei 55 0C zur
Trockne eingeengt. Der glasige Rückstand wird in 18O cnr sie
dendem Nitromethan gelöst. Eine geringe Menge an unlöslichem Material wird durch Filtrieren abgetrennt. Das Filtrat
wird anschliessend zweieinhalb Stunden bei 0 0C gehalten.
Dann wird der gebildete Niederschlag abfiltriert, mit 10 cm eiskaltem Nitromethan gewaschen und dann unter
vermindertem Druck (0,3 mm Hg) bei 50 0C während 16 Stunden
getrocknet..Man erhält so 3,85 g Penta-N- [pyridyl-(3)-methyloxycarbonyl3-colistin.
Rf = o,74 ^ilicagelj n-Butanol-Pyridin-Eisaissäure-Wasser
(50 : 20 t 6 : 24 VoluminaJ7
Analyse: berechnet: C « 57,28 H = 6,82 N =* 15,94 1»
.gefunden: . 57,70 6,67 15,78 #.
Zu einer Lösung von 1,3 g gemäss Beispiel 11 erhaltenem Penta-N-/pyridyl-(3)-methyloxycarbonyl7-colistin in
150 cm5 Methanol setzt man 1,3 g p-Nitroperbenzoesäure zu. Das Reaktionsgemisch wird bei etwa 20 0C während
16 Stunden gerührt und dann unter vermindertem Druck (20 mm Hg) bei 50 0C zur Trockne eingeengt. Der feste
Rückstand wird dreimal mit je 20 cm Aceton von 2O°C und dann
dreimal mit je 20 cnr Aceton von 50 0C gewaschen.
Nach Trocknen unter vermindertem Druck (0,3 mm Hg) bei
20 0C erhält man 959 mg Penta-N-^-oxopyridyl-(3)~
methoxycarbony 1/-CoIiStin, das mit dem gemäss Beispiel
11 erhaltenen Produkt identisch ist.
109808/2273
1·Γ * ,
Rf - 0,32 /pilicagel; n-Butanol-pyridin-Essigsäure-Wasser
(50 : 20 : 6 : 24 Volumina)J.
Zu einer Suspension von 1,169 g Colistin in 80 cm Dimethylformamid setzt man 2,1 g gemäss Beispiel 8
hergesteiltee N-Oxopyridyl-(3)-methyl-2,4,5-trichlorphenyl-carbonat
zu. Nach 44-stündigem Rühren bei 50 0C
wird das unlösliche Material durch Filtrieren abgetrennt. Das Piltrat wird unter vermindertem Druck
(0,3 mm Hg) bei 60 0C zur Trockne eingeengt. Zu dem
erhaltenen öligen Rückstand setzt man 60 cm Äther zu. Es tritt ein kristallisiertes Produkt auf, das man abfiltriert,
mit 20 cnr Äther wäscht und unter vermindertem Druck (0,3 mm Hg) bei 20 0C trocknet. Man erhält
so 1,5 g Penta-N-^-oxo pyridyl-^ 3 )-methyloxycarbonyl7-colistin,
das mit den Produkten der Beispiele 11 und 13 identisch ist.
Rf = 0,32 /JJilicagelj n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasee.r
(50 ι 20 : 6 ϊ 24 Volumina^J.
Analyse: berechnet: C « 54,90 H = 6,54 N = 15,28 £
gefundenί 55,31 6,8 14,90 i»
Zu einer Suspension von 200 mg Colistin in 10 cur Dimethylformamid
eetzt man 400 mg gemäss Beispiel 6 hergestelltes N-Oxo-6-methyl-pyridyl-(2)-methyl-p-nitrophenyl-carbonat
zu.
Nach 48-stündigem Rühren bei 20 0C wird die Lösung unter
vermindertem Druck (0,3 mm Hg) bei 50 0C zur Trockne eingeengt.
Der glasige Rückstand kristallisiert bei Zugabe von 10 cm* Xther. Die Kristalle werden abfiltriert und
109808/2273
3 ·-
dann zweimal mit je 3 cm Äther gewaschen.
dann zweimal mit je 3 cm Äther gewaschen.
Nach Trocknen unter vermindertem Druck (0,3 mm Hg)
bei 20 0C erhält man 220 mg Penta-N-^T-oxo-6-methylpyridyl-(2)-methyloxycarbonyl7-colistin.
Rf - 0,53 /Silicagel; n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser
(50 : 20 : 6 :24 Volumina}/.
Man löst 150 mg Glycin in einer Lösung, die 4 cnr
3 3
destilliertes Wasser, 6 cm tert.-Butanol und 0,7 cm
Triäthylamin enthält. Man setzt 630 mg des gemäsß Beispiel 1 oder 2 erhaltenen Pyridyl-(3)-methyl-p-nitrophenyl-carbonats
zu und riihrt das Reaktionsgemisch bei
60 0C 2 Stunden. Nach Einengen zur Trockne unter vermindertem
Druck (20 mm Hg) bei 55 0C erhält man ein Öl,
3 3
das man in einem Gemisch von 30 cm Wasser und 15 cm
Xthylacetat aufnimmt. Nach Rühren bzw. Schütteln dekantiert
man und wäscht die wässrige Phase mit 15 cnr Äthylacetat und zweimal mit je 15 cnr Äther. Man engt
die wässrige Phase unter vermindertem Druck (20 mm Hg) bei 55 0C zur Trockne ein. Nach Trocknen unter vermindertem
Druck (0,3 mm Hg) bei 20 0C erhält man 550 mg
Triäthylammonium-N-pyridyl-(3)-niethyloxycarbonylglycinat
in Form eines Öls.
Rf = 0,02 /Silicagel; n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser
(50 : 20 : 6 : 24 Volumina}/·
Man löBt diese 550 mg Triäthylammonium-N-pyridyl-(3)-rnethyloxycarbonylglycinat
in 30 cm destilliertem Wasser, Man rührt diese Lösung mit 10 cm Harz Dowex 1x2 (0H~)
eine Viertelstunde. Das Harz wird durch Filtrieren abgetrennt,
mit 50 cm destilliertem V/asser gewaschen und dann mit 25 cm 1n-Salzsäure eine Viertelstunde gerührt.
Das Harz wird erneut durch Filtrieren abgetrennt
10 9 808/22 7 3
und dann mit 50 cm destilliertem Wasser gewaschen. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck (13 mm Hg)
bei 50 0C zur Trockne eingeengt. Zu dem erhaltenen
Rückstand setzt man 30 cnr Äther zu. Nach 24-stündigem Stehenlassen bei 20 0C wird die gebildete Festsubstanz
abfiltriert. Man erhält so 371 mg N-Pyridylmethyloxycarbonylglycin-hydrochlorid.
Man löst 150 mg Glycin in einer Lösung, die 4 cm destilliertes
Wasser, 6 cm tert.-Butanol und 0,7 cm
Triäthylamin enthält. Man setzt 765 mg Pyridyl-(3)-methyl^^^-trichlorphenyl-carbonat,
das gemäss Beispiel 4 erhalten ist, zu und rührt das Reaktionsmedium
bei 60 0C zwei Stunden. Nach Einengen zur Trockne unter
vermindertem Druck (20 mm Hg) bei 55 0G erhält man ein
•X
öl, das man in einem Gemisch von 30 cm destilliertem
Wasser und 15 cm Äthylacetat aufnimmt. Man rührt bzw.
schüttelt, dekantiert, wäscht die wässrige Phase mit 15 car Äthylacetat und zweimal mit je 15 cnr Äther und
engt dann die wässrige Phase unter vermindertem Druck (20 mm Hg) bei 55 0C zur Trockne ein. Nach Trocknen unter
vermindertem Druck (0,3 mm Hg) bei 20 0G erhält man
480 mg Triäthylammonium-N-pyridyl-(3)-methyloxycarbonylglycinat
in Form eines Öls.
Rf = 0,82 ^"ilicagelj n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser
(50 : 20 : 6 s 24 Volumina}/.
Das Produkt ist mit dem in Beispiel 16 in Form eines Öls
erhaltenen identisch.
Man löst 1,4 g N-^-tert.-Butyloxycarbonyl-L-oU^-diaminobuttersäure
in einer Lösung, die 13 cm destilliertes
109808/2273
• 3 3
Wasser, 19 cm tert.-Butanol und 2,22 cm Triäthylamin
enthält. Han setsst 2,02 g Pyridyl-(3)-methyl-p-nitrophenyl-carbonat,
das wie in Beispiel 1 oder 2 erhalten ist, zu und rührt das Reaktionsgemisch 16 Stunden bei
50 0C. Nach Einengen zur Trockne unter vermindertem Druck
(20 mm Hg) bei 50 0C erhält man ein öl, das man in 5 cm
eines Gemische Methanol-1,2-Dichloräthan (10 : 90 Volumina)
aufnimmt. Die Lösung wird an einer Säule von 25 g Kieselsäure (Durchmesser der Säule: 1 cm, Höhe: 40 cm)
chromatographiert. Man eluiert mit einem Gemisch Methanol-1 ,2-Dichloräthan (10 t 90 Volumina). Die zunächst
eluierten 30 cm enthalten p-Nitrophenol und das Ausgangsmischcarbonat.
Die anschliessend eluierten 150 cm' werden unter vermindertem Druck (20 mm Hg) zur Trockne
eingeengt und liefern 1,3 g Triäthylammonium-N-a-tert.-butyloxycarbonyl-N-^-pyridyl-(3)-methyloxycarbonyl-L-<^,
2/-diamino butyrat in Form eines Öls.
Man löst 1,2 g dieses Produkts in 2 cm' destilliertem
Wasser und leitet die erhaltene Lösung durch eine Säule von Harz Amberlite IRA 400 (Form OH"). Man wäscht mit
250 cm' destilliertem Wasser und eluiert das Produkt
dann mit 250 cm' In-Essigsäure. Das Eluat wird lyophilisiert.
Man erhält so 0,53 g des Acetats der !Mk-tert.-Butyloxycarbonyl-N-tf-pyridyl-(3)-methyloxycarbonyl-L-c^j^-diaminobuttersäure.
Rf = 0,74 ^/Sfilicagel; n-Butanol-Pyridin-Bissigsäure-Wasser
(50 : 20 : 6 : 24 Volumina^J
Analyse: berechnet: C = 52,30 H = 6,58 N = 10,16 i>
gefunden: 51t56 6,66 10,44 #·
Zu einer Lösung von 0,91 g D-Lysin-monohydrochlorid in
3 3
einem Gemisch von 8 cm Wasser, 12 cm tert.-Butanol
109808/2273
und 3,5 cnr Triäthylamin setzt man 3,2 g gemäße Beispiel
5 hergestelltes N-Oxo-pyridyl-(3)~methyl-pnitrophenyl-carbonat
zu. Nach 4-stündigem Rühren wird das Reaktionsgemisch unter vermindertem Druck (20 mm
Hg) bei 20 0C zur Trockne eingeengt. Zu der in 100 cm Wasser
erhaltenen Lösung des Rückstands setzt man 40 cm Harz Dowex 50 (Form H+) zu und hält 15 Minuten in Bewegung.
Das Harz wird durch Filtrieren abgetrennt und dann dreimal mit je 50 cnr Wasser gewaschen. Das Filtrat und
die Waschflüssigkeiten werden vereinigt und zweimal mit
je 150 cnr Äther gewaschen. Die wässrige Lösung wird
unter vermindertem Druck (20 mm Hg) bei 50 0C zur Trockne
eingeengtjund das erhaltene Produkt wird unter vermindertem
Druck (0,3 mm Hg) bei 20 0C getrocknet.
Man erhält so 1,78 g 'N-et,f--JN-Oxopyridyl-(3)-methylo3cycarbonylj-D-lyein.
Rf se. 0,18 ^ilicagfel; n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser
(50 : 20 : 6 t 24 VoluminaJ/.
Man löst 1,17 g L-Valin in einem Gemisch von 4 g Di-
3 3
cyclohexylamin, 8 cm destilliertem Wasser und 12 cm
tert.-Butanol. Man setzt 3,34 g gemäss Beispiel 5 hergestelltes
N-Oxopyridyl-(3)-methyl-p-nitrophenylcarbonat
zu. Man rührt das Reaktionsgemisch 2 Stunden bei 60 0C und prüft das Nichtauftreten einer positiven
Reaktion nit'Ninhydrin. Man lässt auf etwa 20 0C abkühlen
und erhält eine gelbe Ausfällung, die man durch Filtrieren entfernt. Das Filtrat wird bei 50 0C unter
vermindertem Druck (20 mm Hg) zur Trockne eingeengt. Man erhält eine gelbe Festsubstanz, die man mit Äther
wäscht. Das so erhaltene trockene Produkt wird in 10 cnr
Äthanol gelöBt und mit 70 cm Petroläther ausgefällt.
Man erhält 5 g eines teilweise kristallisierten Öls,
10 9808/2273
das man unter vermindertem Druck (0,3 mm Hg) trocknet.
3 Man löst das erhaltene Öl in 500 cm Wasser und setzt
200 cm Harz Dowex 50, Form H+^ zu. Man hält die Suspension
30 Minuten in Bewegung, filtriert das Harz ab und lyophilisiert das Filtrat.
Man erhält so 1,0 g N-0xo-pyridyl-(3)-methyloxycarbonyl
L-valin. .
| Analyse: | berechnet: | 21 | N = | O, | 44 |
| gefunden: | 0, | 37 | |||
| Beispiel | |||||
| : 1 | |||||
| 1 | |||||
Zu einer Suspension von 2,17 g Polymyxin B in 145 cm
Dimethylformamid setzt man 3»18 g gemäso Beispiel 5 erhaltenes
N-0xopyridyl-(3)-methyl-p-nitrophenyl-carbonat zu. Nach 24-8tündigem Rühren bei 60 0C und 65-stündigem
Rühren bei 20 0C wird das unlösliche Material durch Filtrieren
abgetrennt. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck (0,3 mm Hg) bei 60 0C zur Trockne eingedampft.
Man nimmt das erhaltene öl in 7 cm Methanol auf und chromatographiert diese Lösung an einer Säule von
Sephadex LH 20 (Durchmesser der Säule: 38 mm, Höhe: 1,80 m). Man eluiert mit Methanol und sammelt Fraktionen
von 7 ctel . Die Fraktionen 130 bis 170 werden vereinigt
und unter vermindertem Druck (20 mm Hg) bei 50 0C zur
Trockne eingeengt. Man erhält so 3,2 g Penta-N-^T-Oxopyridyl-(3)-methyloxycarbonyl/-polymyxin
B.
Rf = 0,30 /Silicagel; n-Butanol-Pyridin-Essigeäure-Wasser
(50 : 20 : 6 : 24 Volumina^.
Zu einer Lösung von 300 mg Penta-N-/pyridyl-(3)~methyloxycarbonyl7-colistin,
das gemäss Beispiel 12 hergestellt ist, in 3 cnr Dimethylformamid, 10 car Methanol
10 9 8 0 8/2273
•2
und 2 cnr 1η-Salzsäure setzt man 300 mg Palladiumkohle
(mit 3»15 $> Pd) zu und leitet einen schwachen
Wasserstoffstrom 16 Stunden lang ein. Nach Filtrieren
und Einengen des Filtrate zur Trockne unter vermindertem Druck (0,3 mm Hg) bei 50 0C wird der erhaltene feste
Rückstand in 5 cm Methanol gelöst, und die Lösung wird
an einer Säule von 50 g Sephadex LH 20 (Durchmesser der Säule: 14 mm, Höhe: 1,90 m) chromatographiert. Man eluiert
mit Methanol und sammelt Fraktionen von 2 cm . Die Fraktionen 40 bis 46 werden vereinigt und mit 10 cm
destilliertem Wasser verdünnt, und die erhaltene Lösung wird lyophilisiert. Man erhält so 158 mg Colistin-pentahydrochlorid.
Rf = 0,29 ^ilicagelj n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser
(50 : 20 s 6 : 24 Volumina^J.
Man löst 1 g gemäss Beispiel 13 hergestelltes Penta-N-
^N-oxopyridyl-(3)-methyloxycarbonyl7-coliBtin in 200 cm
frisch destilliertem Ammoniak bei -33 0C. Zu dieser Lösung
setzt man Natrium in kleinen Anteilen zu, bis man eine bleibende Blaufärbung während mehr als 5 Minuten
erhält. Dann setzt man 700 mg Ammoniumchlorid zu, um die Entfärbung des Reaktionsmediums zu erzielen. Man verdampft
das Ammoniak, wobei man das Reaktionsmedium bei 0 0C rührt. Man erhält eine Festeubstanz, die man in
50 cm' destilliertem Wasser von 0 0C aufnimmt. Man stellt
das Reaktionsmedium durch Zugabe von In-HCl auf pH 6
ein, trennt das unlösliche Material ab und engt daß PiI-trat
unter vermindertem Druck (0,3 mm Hg) bei 50 0C zur
Trockne ein. Man nimmt den erhaltenen Rückstand in 3 cur
Methanol auf, trennt das unlösliche Material durch Filtrieren ab und chromatographiert das Filtrat an einer
Säule von 40 g Sephadex LH 20 (Durchmesser der Säule;
14 mm, Höhe: 1,7 m). Man eluiert mit Methanol (100 om )
10 9808/2273
- 26 -" ■ ;
und 3ngt das Eluat unter vermindertem Druck (20 mm Hg)
zur Trockne ein. Man gewinnt bo 508 mg Colistin-pentahydrochlorid.
Bf β 0,29 /3"ilicagel; n-Butanol-Pyridin-Eesigsäure-Wasser
(50 : 20 : 6 : 24 Volumina)J.
Zu einer Lösung von 1,5 g gemäss Beispiel 13 hergestelltem
Penta-N-^-oxopyridyl-(3)-methyloxycarbonyl7-colistin
in 230 cm' einer auf pH 7,5 gepufferten und auf 37 0O erwärmten
Lösung setzt man 50 mg Subtillsin zu und rührt das Reaktionsgemisch 15 Minuten bei 37 0O. Oleich anschliessend
wird das Reaktionsgemische auf -70 0C abgekühlt.
Die Lyophilisation der so erhaltenen Lösung liefert ein cremefarbenes Pulver, das in 10 cm der schweren Phase
eines Lösungsmittelsystems der folgenden Zusammensetzung gelost wird t
n-Butanol 800 cnr
Pyridin 200 cm5
Essigsäure 100 C«r
Wasser 900 ca*
Diese Lösung wird einer Gegenstroaverteilung in einer
Apparatur von 60 Rohren, die jeweils IQ ca schwere Phase
und 10 cm leichte Phase enthalten können» unterzogen.
Am Ende der Gegenstromverteilung wird der Inhalt eines jeden Rohres unter vermindertem Druck (25 mm Hg) bei
60 0C zur Trockne eingeengt. Die Rückstände aus den
■z
Rohren 25 bis 31 werden in insgesamt 20 cm Wasser gelöst,
und die so erhaltene Lösung wird lyophilisiert. Man erhält so 246 mg Tri-N~$~[M~oxopyrldyl-C5)-raethyloxycarbonyll-colistamin
oder Cyolo-iN-^-L-a^-diaminobutyryl-N-
%- [N-oxopyridyl- O) -methyloxyoarbonyl J -L-a^-diarainobutyryl-D-leucyl
-L-leucyl-N-i--1 N-oxopyridyl- (3) -raethyloxycarbo-
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nyl]-L-α,^ -diaminobutyryl-N-^-[N-oxopvridyl-l3j-methyloxycarbonyl
-L-a, i/-diaminobutyryl -L-threonyl (.
Rf = 0,27 /jSilicagelj n-Butanol-Pyridin-EssigBäure-Wasser
(50 : 20 : 6 : 24 Voluminajl/·
Nach vollständiger Hydrolyse ergibt die Analyse mit einem
Technicon-Autoanalysator das Vorhandensein der folgenden
Aminosäuren :
Dab =i 4fO7 (Theorie = 4)
Leu m 2,00 (Theorie =2)
Thr χ 0,98 (Theorie =1)
Man arbeitet in analoger Weise, ersetzt jedoch dae
Subtilisin durch Nagarse, Pronase, Colietinase, Alkalase
oder durch B. eubtilie GLAXO 417» B. subtilis A.T.C.C.
9524 und Bacillus THE 4 gebildete Proteasenund erhält ebenfalls das oben beschriebene cyclische Polypeptid,
das durch Chromatographie an Silicagel (Rf = 0,27) in dem System n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser
(50 : 20 ι 6 ι 24 Volumina) identifiziert wird.
Die zum Lösen des Penta-N-/ff-oxopyridyl-(3)-methyloxycarbony
1/-CoIiStins verwendete,auf pH 7,5 gepufferte Lösung
kann durch Einstellen einer Lösung von 34 cm Essigsäure in 700 cm- deetilliertem Wasser auf pH 7»5 (Bestimmung
mit einem pH-Hessgerät) durch Zugabe yon 5n-Ammoniak
und anschlieesendes Auffüllen auf 1000 cm' durch
Zugabe von deetilliertem Wasser erhalten werden.
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Claims (10)
1. Verfahren zum Schützen von Aminoresten, dadurch
gekennzeichnet , dass man als Schutzgruppe eine Gruppe der allgemeinen Formel
Py - CH - O CO -
in der Py einen unsubstituierten oder durch einen
Methylrest substituierten Pyridyl- oder Pyridyl-N-oxydrest bedeutet und R ein Wasserstoffatom, einen geradkettigen oder verzweigten Alkylrest mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen oder einen Phenylrest darstellt, verwendet.
Methylrest substituierten Pyridyl- oder Pyridyl-N-oxydrest bedeutet und R ein Wasserstoffatom, einen geradkettigen oder verzweigten Alkylrest mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen oder einen Phenylrest darstellt, verwendet.
2. Verfahren nach Anspruch .1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Pyridyl-(3)-methyloxycarbonylgruppe
verwendet.
verwendet.
J>. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
dasB man die N-Oxopyridyl-(3)-methyloxycarbonylgruppe
verwendet.
4» Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
dass man die Pyridyl-(4)-methyloxycarbonylgruppe
verwendet.
verwendet.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die N-Oxopyridyl-(4)-methyloxycarbonylgruppe
verwendet.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die 6-Methylpyridyl-(2)-methyloxycarbonylgruppe
verwendet.
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7. Verfahren naoh Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
dass man die N-Oxo-6-methylpyridyl-(2)-methyloxycarbonylgruppe
verwendet.
8. Verfahren zum Schützen von Aminogruppen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Derivat
der allgemeinen Formel
Py - CH - 0 CO - X
in der Py und R die oben angegebenen Bedeutungen besitzen, und X eine die Carbonylfunktion aktivierende
Gruppe, wie ein Chloratom, ein. Rest -N, oder ein Rest -OT, in welchem T einen Phenyl- oder substituierten
Phenylrest, wie p-Nitrophenyl oder 2,4,5-Trichlorphenyl,
oder einen von einem Heterocyclus abgeleiteten Rest, wie einen Chinolyl-(8)- oder 2,5-Dioxopyrrolidinyl-(1)-Rest,
darstellt, ist, mit einem Produkt, das einenibder mehrere Aminoreste aufweist, umsetzt.
9· Verwendung eines Produkts der allgemeinen Formel
Py - CH - 0 CO OT ι
in der Py, R und T die oben angegebenen Bedeutungen
besitzen, als Mittel zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 8.
10.j Verbindung mit einem oder mehreren Aminoresten, dadurch
gekennzeichnet, dass zumindest einer dieser Aminoreste durch eine Schutzgruppe der allgemeinen
Formel
Py - CH - 0 CO -
in der Py und R die oben.angegebenen Bedeutungen besitzen,
geschützt ist.
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Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| FR6926912A FR2055903A5 (de) | 1969-08-05 | 1969-08-05 | |
| FR7021180A FR2093294A5 (en) | 1970-06-09 | 1970-06-09 | Pyridylmethyl oxycarbonyl used as amino - blocking groups |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE2038996A1 true DE2038996A1 (de) | 1971-02-18 |
Family
ID=26215213
Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
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Country Status (7)
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| CA (1) | CA937569A (de) |
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| CH521343A (fr) | 1972-04-15 |
| NL7011151A (de) | 1971-02-09 |
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| SE382979B (sv) | 1976-02-23 |
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| GB1331435A (en) | 1973-09-26 |
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