DE2029822B2

DE2029822B2 - Diagnostische Zusammensetzung zum Nachweis der Nikotinsäureproduktion durch Mycobakterien

Info

Publication number: DE2029822B2
Application number: DE2029822A
Authority: DE
Inventors: Donald P. Rockaway Kronish; William D. Montclair Young Jun.
Original assignee: Warner Lambert Pharmaceutical Co
Current assignee: Warner Lambert Co LLC
Priority date: 1969-06-18
Filing date: 1970-06-16
Publication date: 1974-08-15
Also published as: SE380043B; GB1278036A; FR2050983A5; CH545480A; JPS5031037B1; CA927258A; DE2029822A1; DE2029822C3; US3616258A

Description

die Zone A etwa 0,2 bis etwa 6 mg eines Alkalimetallsalzes von p-Aminobenzoesäure, die Zone B etwa 0,6 bis etwa 20 mg Natriumoder Kaliumthiocyanat,
die Zone C etwa 0,2 bis etwa 10 mg einer kristallinen Säure aus der Gruppe Zitronensäure, Oxalsäure oder Malonsäure, und die Zone D etwa 1 bis etwa 20 mg Chloramin-T enthält, ^a5

wobei die Zonen in der Reihenfolge ABCD, ACBD, ABDC, ACDB, CDBA, BACD, BDAC, CBDA, DBCA, DBAC, BDCA, BCDA oder DCBA nebeneinander angeordnet sind.

2. Diagnostische Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß angrenzend an den unbehandelten Bereich, der der äußersten mit Reagenz imprägnierten Zone folgt, eine zusätzliche Zone E angebracht ist, die mit einer chemisch inerten hydrophoben Grenzschichtzusammensetzung imprägniert ist.

3. Diagnostische Zusammensetzung gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß anschließend an die Zone E eine zusätzliche Zone F angebracht ist, die mit einer Farblösung imprägniert und mit einer hydrophoben Grenzschichtzusammensetzung überzogen ist.

4. Diagnostische Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß

die Zone A etwa 1,0 bis etwa 4 mg eines Alkalimetallsalzes von p-Aminobenzoesäure, die Zone B etwa 6,0 bis etwa 131 mg Natriumoder Kaliumthiocyanat,

die Zone C etwa 2,0 bis etwa 3,0 mg einer kristallinen Säure, aus der Gruppe Zitronensäure, Oxalsäure oder Malonsäure, und
die Zone D etwa 2 bis etwa 10 mg Chloramin-T enthält.

55

5. Diagnostische Zusammensetzung gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß angrenzend an den unbehandelten Bereich, der der äußersten mit Reagenz imprägnierten Zone folgt, eine zusätzliche Zone E angebracht ist, die mit einer chemisch inerten hydrophoben Grenzschichtzusammensetzung imprägniert ist, die etwa 75 bis etwa 100 ml einer acrylischen Überzugszusammensetzung, und etwa 0 bis etwa 25 ml einer Kohlenwasserstoffverdünnung für die Überzugszusammensetzung enthält.

6. Diagnostische Zusammensetzung gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß angrenzend an die Zone E eine zusätzliche Zone F angebracht ist, die mit einer Farbstofflösung, die etwa 100 ml einer Lösung von etwa 0,05 bis etwa 0,8 g eines Farbstoffs enthält, imprägniert ist, wobei die faibstoffimprägnierte Zone mit einer hydrophoben Grenzschichtzusammensetzung überzogen ist

7. Diagnostische Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß

die Zone .4 etwa 3,4 mg des Natriumsalzes von p-Aminobenzoesäure,
die Zone B etwa 9 mg Kaliumthiocyanat,
die Zone C etwa 2,8 mg Zitronensäure, und
die Zone D etwa 8 mg Chloramin-T

enthält, und daß die reagenzimprägnierten Zonen auf dem schwammigen Material in der Reihenfolge ABCD aufgebracht sind.

S. Diagnostische Zusammensetzung gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß angrenzend an die Zone D eine zusätzliche Zone E angebracht ist, die mit einer chemisch inerten hydrophoben Grenzschichtzusammensetzung, die etwa 85 ml einer Methylmethacrylat - Überzugszusammensetzung und etwa 15 ml Äthylalkohol umfaßt, imprägniert ist

9. Diagnostische Zusammensetzung gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß eine zusätzliche Zone F, angrenzend an die Zone E angebracht ist, die mit einer Farbstofflösun?, die etwa 100 ml einer Lösung von etwa 0,1 g eines Farbstoffs enthält, imprägniert ist, wobei die farbstoffimprägnierte Zone mit einer hydrophoben Grenzschichtzusammensetzung überzogen ist, die etwa 85 ml einer Methylmethacrylat-Überzugszusammensetzung und etwa 15 ml Äthylalkohol enthält.

Die Erfindung betrifft eine diagnostische Zusammensetzung zum Nachweis der Nicotinsäureproduktion durch Mycobakterien, bestehend aus einem schwammigen Material, das mit dem Alkalisalz einer aromatischen Aminosäure, einem Alkalithiocyanat, einer kristallinen organischen Säure und Chloramin-T derart imprägniert ist, daß mehrere mit verschiedenen Reagenzien imprägnierte Zonen gebildet sind, welche durch unbehandelte Bereiche des schwammigen Materials voneinander getrennt sind.

Verfahren zum Nachweis von Nikotinsäure, die durch »menschliche« Mycobakterien produziert wird, sind bekannt. Der ursprüngliche Konno-Test (Science, Bd. 124, S. 985, 1956) besteht darin, daß man Bazillen in ein Teströhrchen überführt, das 4% Anilin in Alkohol enthält. Die Zugabe von 10%igem Bromcyan ruft eine gelbe Färbung hervor, wenn adäquate Konzentrationen von Nikotinsäure vorhanden sind. Eine Abänderung des Konno-Tests wurde durch R u η y ο η (Am. Rev. Tuberc. and PuIm. Dis. 79, S. 663 bis 665, 1959) entwickelt und verwendet auch einen Extrakt der zu untersuchenden Kultur. Jedoch ist die Verwendung des hoch-toxischen Farbentwicklungsreagenz Bromcyan immer noch notwendig.

Gemäß einem weiteren Testverfahren, beschrieben

von J. O. K i 1 b u r η und G. P. K u b i c a in Tech. BuIL Registry of Medical Technologists 38, S. 244 bis 246, September 1968, wurden Versuche unternommen, die notwendigen Reagentien in Form eines imprägnierten Streifens der eingangs beschriebenen Zusammensetzung einzusetzen.

In diesem Teststreifen werden das Alkalithiocyanat und die organische Säure nicht getrennt aufgetragen. Als organische Säure wird p-Aminosalicylsäure verwendet Die Stabilität des Teststreifens beträgt bei 4⁰C 3 Monate, wohingegen bei 25° C bereits nach zweiwöchiger Lagerung ein Empfindlichkeitsverlust auftritt. Ein weiterer Nachteil des bekannten Teststreifens scheint darin zu bestehen, daß das Natriurnp-aminosalicylsäure-Reagenz nicht in Lösung, sondern vermutlich in Suspension auf den Teststreifen aufgebracht werden muß. Dies führt zu einer sehr empfindlichen und leicht verschiebbare^ Konfiguration, auf Grund derer die anderen Komponenten auf dem Streifen verunreinigt werden können.

Erfindungsgemäß sollen auch bei Raumtemperatur über einen längeren Zeitraum hinweg stabile diagnostische Zusammensetzungen geschaffen werden, bei denen die vorgenannten Nachteile nicht auftreten. Dies wird dadurch erreicht, daß bei der eingangs beschriebenen diagnostischen Zusammensetzung vier Reaktionszonen A, B, C und D vorgesehen sind, von denen die Zone A etwa 0,2 bis etwa 6 mg eines Alkalimetallsalzes von p-Aminobenzoesäure, die Zone B etwa 0,6 bis etwa 20 mg Natrium- oder Kaliumthiocyanat, die Zone C etwa 0,2 bis etwa 10 mg einer kristallinen Säure aus der Gruppe Zitronensäure, Oxalsäure oder Malonsäure, und die Zone D etwa 1 bis etwa 20 mg Chloramin-T enthält, wobei die Zonen in der Reihenfolge ABCD, ACBD, ABDC, ACDB, CDBA, BACD, BDAC, CBDA, DBCA, DBAC, BDCA, BCDA oder DCBA nebeneinander angeordnet sind.

Mit Hilfe der erfindungsgemäßen diagnostischen Zusammensetzung, die sich von der vorbeschriebenen, insbesondere dadurch unterscheidet, daß das Thiocyanat und die organische Säure getrennt aufgetragen, und statt p-Aminosalicylsäure p-Aminobenzoesäure verwendet wird, wird eine Beständigkeit von 4¹Z₂ Jahren bei einer Temperatur von 4° C erreicht. Bei Temperaturen von 3S⁰C sind die erfindungsgemäßen diagnostischen Zusammensetzungen zwölf Monate stabil. Eine derartige Stabilitätssteigerung ist mit beträchtlichen Vorteilen für die kommerzielle Produktion, die Versendung und die Lagerung verbunden. Es war auch nicht vorhersehbar, daß mit der speziellen erfindungsgemäßen diagnostischen Zusammensetzung derartige Vorteile erzielbar sein wurden.

Mit den erfindungsgemäßen Teststreifen kann die Anwesenheit von 3,1 Mikrogramm Nikotinsäure in 0,6 ml einer Lösung eines Extraktes der zu untersuchenden Kultur nachgewiesen werden. Da dieser Test in einem verschlossenen Teströhrchen durchgeführt wird, wird die Gefahr giftiger Reagentien vermieden.

Der diagnostische Test wird durchgeführt, indem man den Teststreifen in einem verschlossenen Teströhrchen mit einem Extrakt der zu untersuchenden Kultur in Kontakt bringt. Wenn Nikotinsäure vorhanden ist, führt die Reaktion der verschiedenen Reagentien mit der Nikotinsäure zu einer Farbbildung als positiver Nachweis für die Anwesenheit von Nikotinsäure.

In der ZeichnuEg ist ein Ausführungsbeispiel der Erfindung schematisch dargestellt Der gezeigte Streifen wird längs in eine Reihe von Bereichen aufgeteilt, die mit einem besonderen Reagenz imprägniert sind, und die voneinander durch nicht imprägnierte Bereiche getrennt sind. So ist der Bereich 1 mit dem Reagenz der Zone A imprägniert, der Bereich 3 mit dem Reagenz der Zone B, der Bereich 5 mit dem Reagenz der Zone C, und der Bereich 7 mit dem Reagenz der

ίο Zone D; die unbehandelten Bereiche 2, 4 und 6 trennen die behandelten Bereiche. In der bevorzugten, gezeigten Ausführungsform ist der Bereich 8 mit einer hydrophoben Grenzschicht der Zone .E imprägniert und der Bereich 9 mit dem Farbstoff der Zone F.

Zur Herstellung des Teststreifens wird eine Vielzahl von einzelnen, jedoch getrennten Zonen eines geeigneten schwammigen Materials imprägniert, wobei die Zonen bequemerweise identifiziert werden können in bezug auf das besondere Reagenz, das aufgetragen ist

ao als Zonen A, B, C und D mit den folgenden Reagentien:

Zcae A. p-Aminobenzoesäure

Sie wird in Form einer wäßrigen oder wäßrig

alkoholischen Lösung eines AlkaUmeiallsalzes von p-Aminobenzoesäure mit einem gemessenen pH-Wert von etwa 7,5 bis 12 aufgetragen.

Zone B. Kaliumthiocyanat

Dies wird in Form einer wäßrigen Lösung von Natrium- oder Kaliumthiocyanat aufgetragen.

Zone C. Kristalline Säure in trockener Form.

Sie kann aufgetragen werden in Form einer wäßrigen Lösung einer kristallinen Säure, wie Zitronensäure, Oxalsäure oder Mülonsäure.

Zone D. Chloramin-T

Dies wird aufgetragen in Form einer wäßrigen Lösung von Chloramin-T.

Die verschiedenen Reagenzzonen A, B, C und D können in einer Kombination von Stellungen relativ zueinander, wie es weiter unten beschrieben werden wird, auf das schwammige Material aufgebracht werden.

Um die diagnostische Zusammensetzung zu verwenden und die Nikotinsäureproduktion durch einen besonderen Organismus nachzuweisen, wird ein wäßriger oder Salzlösungsextrakt einer Kultur des zu unter-

suchenden Organismus in ein Teströhrchen der Abmessung 13 · 100 mm oder ein ähnliches Behältnis eingebracht. Der mit den Reagentien imprägnierte diagnostische Teststreifen wird in die Extraktflüssigkeit eingetaucht und der Behälter wird sofort ver-

schlossen. Kapillare Wanderung der Reagentien und schwaches Bewegen bei Raumtemperatur gestattet die Einwirkung der Reagentien mit der in dem Extrakt vorhandenen Nikotinsäure. Die Entwicklung einer spezifischen Farbreaktion in etwa 15 bis 20 Minuten

ist ein positiver Hinweis auf die Anwesenheit von Nikotinsäure. Die Farbentwicklungsreaktionen, die stattfinden, wenn Nikotinsäure vorhanden ist, können dargestellt werden durch das folgende Formelschema:

2 029

/V-COOH

I J +Cl-C^N

N
Nikotinsäure Chlorcyan ♦) COOH

0= Loh

Glutaconaldehydderivat

/V

COOH

HOOC-

NHj

COOH

Chromogen

*) Chlorcyan wird durch die Reaktion von Chloramin-T mit dem auf dem Teststreifen worhandenen Thiocynat bei einem sauren pH-Wert gebildet.

COOH

p-Aminobenzoesäure primäres aromatisches Amin

Da der Behälter, in dem der Test durchgeführt wird, bei der Bildung der toxischen Reaktionsprodukte verschlossen ist, werden die Gefahren mit der Handhabung derartiger toxischer Reaktionsprodukte normalerweise verbunden, vollständig vermieden.

Die p-Aminobenzoesäurereagenzlösung, die zum Imprägnieren der Zone A verwendet wird, wird hergestellt, indem man von etwa 0,5 bis 20 g eines Alkalimetallsalzes von p-Aminobenzoesäure in etwa 20 bis 100 ml, vorzugsweise etwa 30 bis 50 ml, destilliertem Wasser löst und man dann eine genügende Menge deines mischbaren organischen Lösungsmittels, wie Äthanol, zugibt, um das Volumen der Endlösung auf etwa 100 ml zu bringen. Die Konzentration des Alkohols in der Endlösung kann von 10 bis 80% betragen, vorzugsweise von 40 bis 60 Volumprozent Eine genügende Menge eines alkalischen Mittels, das den diagnostischen Test nicht stört, wird zugegeben, um den pH-Wert der Endlösung auf einen gemessenen pH-Wert von etwa 7,5 bis 12, vorzugsweise etwa 9 bis 12, zu bringen.

Geeignete Alkalimetallsalze der p-Aminobenzoesäure, die verwendet werden können, schließen ein Natrium- und Kaliumsalze, wobei das Natrhimsalz bevorzugt ist. Geeignete pH-Wert-Modifizienmgsmittel, die den diagnostischen Test nicht stören, schließen alkalische Materialien ein, wie Natrium-, Kalium- oder Ammoniumhydroxyd. Vorzugsweise wird eine etwa 0,1 n-Natriumhydroxydlösung verwendet.

Das verwendete Salz der p-Aminobenzoesäure wird vorzugsweise in etwa der gesamten zu verwendenden Menge destilliertem Wassers gelöst, der pH-Wert wird auf etwa 7,5 bis 12, am bevorzugten auf etwa 10,5 bis 10,7 gebracht, und dann wird Äthanol, der bevorzugte Alkohol, zugegeben. Der gemessene pH-Wert dieser Endlösung liegt zwischen etwa 9 bis 12.

Die auf die Zone B aufgebrachte Thiocyanatlösung wird hergestellt, indem man von etwa 40 bis 80 g, vorzugsweise etwa 50 bis 70 g, Natrium- oder Kaliumthiocyanat in weniger als 100 ml destilliertem Wasser löst und dann das Volumen der Lösung durch weitere Zugabe von destilliertem Wasser auf 100 ml bringt.

Die Säurelösung, die auf die Zone C aufgebracht wird, wird hergestellt, indem man etwa 30 bis 70 g, vorzugsweise etwa 40 bis 60 g, Zitronensäure, Oxalsäure oder Malonsäure oder eine Mischung dieser Säuren in destilliertem Wasser löst und dann genügend zusätzliches destilliertes Wasser zugibt, um das Volumen der Endlösung auf 100 ml zu bringen.

Die Chloramin-T-Lösung, die aufgebracht wird, um die Zone D zu bilden, wird hergestellt, indem man etwa 10 bis 60 g, vorzugsweise etwa 30 bis 60 g, Chloramin-T in einem geringeren Volumen destilliertem Wasser löst und man dann weiteres destilliertes Wasser zubringt, um die Lösung auf 100 ml zu bringen. Die oben beschriebenen Reagenzlösungen werden auf die Zonen A, B, C und D des schwammigen Materials aufgebracht. Gewünschtenfalls können sie in mehreren Auftragungen auf die entsprechende Zone aufgebracht werden, um auf den entsprechenden Zonen die folgenden Mengen der Reagenzmaterialien aufzubringen, die verbleiben, wenn die Lösungsmittel, in denen, sie aufgebracht wurden, verdampft wurden:

!Weiter Bereich in mg

Zone A Reagenz
Zone B Reagenz
Zone C Reagenz
Zone D Reagenz

etwa 0,2 bis 6 etwa 0,6 bis 20 etwa 0,2 bis 10 etwa 1 bis 20

Bevorzugter Bereich in mg

etwa 1 bis 4 etwa 6 bis 13 etwa 2 bis 3 etwa 2 bis 10

Wie bereits angegeben, können die oben beschriebenen Reagenzzonen auf dem schwammigen Teststreifen in einer Vielzahl von Kombinationen aufgebracht werden, entweder nebeneinander in alphabetischer Reihenfolge oder in beliebiger Reihenfolge. Die Farbbildung als Anzeichen eines positiven Ergebnisses wird variieren in Abhängigkeit von der gewählten Placierung der verschiedenen Reagentien. Die folgende Tabelle faßt die möglichen durchführbaren Kombinationen zusammen, wobei die entsprechenden Farbreaktionen, die ein positives oder negatives Ergebnis anzeigen, ebenfalls angegeben sind.

Ic

Tabelle I

Reihenfolge	Positive	Negative
der	Farbreaktion	Farbreaktion
Reagenz
lösungen	gelbe Lösung	farblos
*ABCD*	desgl.	desgl.
*ACBD*	desgl.	desgl.
*ABDC*	gelbe Lösung mit	braune Quer
*ACDB*	brauner Querreak	reaktion auf dem
	tion auf dem Streifen	Streifen
	orange-rosa auf dem	gelbe Querreak
*CDBA*	Streifen, gelbe Quer	tion auf dem
	reaktion auf dem	Streifen
	Streifen
	desgl.	desgl.
*BACD*	desgl.	desgl.
*BDAC*	desgl.	desgl.
*CBDA*	desgl.	desgl.
*DBCA*	desgl.	desgl.
*DBAC*	desgl.	desgl.
*BDCA*	desgl.	desgl.
*BCDA*	desgl.	desgl.
*DCBA*

A = p-Aminobenzoesäuresalz Lösung,

B = Thiocyanat-Lösung,

C — Säurelösung,

D — Chloramin-T-Lösung.

Die Kombinationen, die eine »gelbe Lösung« als Nachweis einer positiven Nikotinsäurereaktion ergeben, sind bevorzugt, da diese Farbreaktion ähnlich der ist, die bei Anwendung klassischer Testverfahren erhalten wird. In dieser Kategorie sind die ABCD- und ^CAD-Reihenfolgen die empfindlicheren, wobei die y42?CZ>-Reihenfolge das insgesamt besonders bevorzugte Produkt darstellt Von jenen Reihenfolgen von Kombinationen, bei denen «orange-rosa« eine positive Nikotinsäurereaktion anzeigt, sind die CDBA, BACD, BDAC und CBDA bevorzugt, wobei in dieser Kategorie die Reihenfolge CDBA am meisten bevorzugt ist.

Gewünschtenfalls kann ein Ende des imprägnierten Teststreifens mit einem hydrophoben Material überzogen werden, so daß es als Mittel zum Handhaben des Teststreifens dienen kann, wodurch eine Kontamination der Reagenzzonen vermieden wird. Zum Beispiel kann eine Zone, die mit einer hydrophoben Grenzschichtzusammensetzung (im folgenden als Zone E bezeichnet) imprägniert ist, an einem Ende des Streifens, angrenzend an die äußerste Reagenzzone, aufgebracht werden. Zur Identifizierung und zur Handhabung kann auch eine Zone, die mit einem Farbstoff imprägniert ist, geschaffen werden (im folgenden als Zone F bezeichnet), angrenzend an die oben beschriebene hydrophobe Grenzschichtzone E. Diese gefärbte Zone kann auch mit einer hydrophoben Grenzschichtzusammensetzung überzogen werden, wie sie zum Überziehen der Zone E verwendet wird.

Für die hydrophobe Grenzschicht wird eine Zusammensetzung verwendet, die das Herauslösen des Kulturextraktes und der Reagenzreaktionsteilnehmer aufwärts an das Ende des schwammigen Materials oder in die gefärbte Zone verhindert, wenn eine derartige Zone vorhanden ist. Die Grenzschichtzusammensetzung sollte natürlich in diesem System chemisch inert sein. Substanzen, die eine wasserdichte Grenzschicht dieser Art bilden, schließen ein Wachse, Lacke und Kunststoffmaterialien, insbesondere eine im Handel erhältliche farblose polymerisiertc Methylmethacrylat-Uberzugszusammensetzung, welche in Form einer Lösung in Toluol geliefert wird und zur leichteren Aufbringung bis zu etwa 25% mit zusätzlichem Toluol oder anderen Verdünnungsmitteln, wie Äthyl-, Methyl- oder Propylalkohol USP, verdünnt werden kann.

ίο Jeder geeignete Farbstoff, der das schwammige Material genügend färbt, um das Ende des diagnostischen Streifens, der angefaßt werden soll, von den farblosen Reagenzzonen, die in den Kulturextrakt eingetaucht werden, zu unterscheiden, kann für die Farblösung zum Auftragen auf die Zone F verwendet werden, so z. B. Farbstoffe, wie Sudan IV (Color Index No. 258 und Certification No. NZ18) oder Sudan Rot GGA (Color Index Lösungsmittelrot Nr. 22) in einem geeigneten flüchtigen Lösungsmittel,

ao z. B. Xylol. Viele andere Farbstoffe sind ebenfalls geeignet. Die bevorzugte Farbstofflösung, die aufgetragen wird, enthält etwa 0,05 bis etwa 0,8, vorzugsweise etwa 0,1 bis etwa 0,5 g, des Farbstoffes in etwa 100 ml des flüchtigen Lösungsmittels.

as Als schwammige aufsaugende Materialien sind jene Materialien geeignet, die auf Grund von Kapillarwirkung in der Lage sind, Flüssigkeiten aufzusaugen, z. B. Filterpapier, Filz, poröse Keramikstreifen, gewebtes oder mattenartiges Fiberglas u. dgl.

Die folgenden Beispiele werden gegeben, um die Erfindung weiter zu erläutern.

Beispiel 1
ABCDEF-Reiherdolge

A. Herstellung der Reagenzlösung
der Zone A, p-Aminobenzoesäuresalz

10 g des Natriumsalzes von p-Aminobenzoesäure werden in destilliertem Wasser gelöst, und die Lösung wird mit zusätzlichem destilliertem Wasser auf ein Volumen von 50 ml gebracht. Der pH-Wert der Lösung wird auf 10,5 bis 10,7 eingestellt, indem man 0,1 n-NaOH-Lösung verwendet. Die Lösung wird dann mit 95 %igem Äthanol auf 100 ml gebracht.

B. Herstellung der Reagenzlösung
für die Zone B, Kaliumthiocyanat

60 g Kaliumthiocyanat wird in destilliertem Wasser gelöst und die Lösung wird mit zusätzlichem destilliertem Wasser auf ein Volumen von 100 ml gebracht.

C. Herstellung der Reagenzlösung
für die Zone C, Zitronensäure

50 g Zitronensäure wird in destilliertem Wasser gelöst, und die Lösung wird mit zusätzlichem destilliertem Wasser auf 100 ml gebracht. Dieses Material kühlt sich beim Auflösen ab und muß auf Raumtemperatur erwärmt werden.

D. Herstellung der Reagenzlösung
für die Zone D, Chloramin-T

50 g Chloramin-T wird in destilliertem Wasser unter Erhitzen auf 58 bis 60° C gelöst, um vollständige Auflösung zu sichern. Es wird genügend destilliertes Wasser zugesetzt, um das Volumen auf 100 ml zu bringen, während man die Temperatur auf 58 bis 6O⁰C hält, um die Auskristailisation zu verhindern.

■c μ ct.n..r._n A*_r k,,H,v.„i,_ni,«.n Größe. Man gibt einen gemäß Beispiel 2 hergestellten

E^ Herstellung der hydrophoben diagnostischen Teststreifen mit der Zone ^ (das der

Grenzschichtzusammensetzung fur die Zone £ _gefg_{bten Markierungszone gegenü}berliegende Ende)

85 ml einer handelsüblichen farblosen Losung j_n die Salzlösung eintauchend hinzu und verschließt

polymerisierten Methylmethacrylats werden mit 15 ml _{5 das Teströh}rchen sofort mit einem paraffinüber-

Athylalkohol USP verdünnt. zogenen Korkstopfen. Man läßt 15 bis 20 Minuten

F. Herstellung der Farbstofflösung für die Zone F bei Raumtemperatur unter gelegentlichem leichtem

' , _o , _ . „~. , ·_ν11 ι» _t „α Schütteln stehen. Ein positiver Test für Nikotinsäure

0 3 g Sudan Rot GGA werden in Xylol gelost und £ Entwicklung einer orangen

die Losung wird mit zusatehchcm Xylol auf em Vo- _{ιό bJs} J_{n p}£ _{der L}„_su J ^ ^

lumen von 100 ml gebracht. _ist ^ _wesentHch ⁶ _{en faAlos>} j_ede Verfärbung des

Beispiel 2 Teststreifens selbst wird außer acht gelassen. Zur Be-

.... ... -,.ο *· seitigung sollten ¹U bis ImI einer 10 %igen wäßrigen

Aufbringen der diagnostischen Reagentien Natriumhydroxydlösung zu jedem Teströhrchen ge-

auf das schwammige Material _{ij} geb?n} ^^ *_{ω mai}f ^.^ _{verschlossen und v}|_r.

Bei der Herstellung der Streifen wird ein kontinuier- mischt ¹Z₂ bis 1 Stunde stehenläßt, bevor man sterili-

licher Bogen Eaton-Dikeman Filterpapier Nr. 623 siert.

(70 lbs.) mit 83 mm Breite verwendet. Das Papier B e i s d i e 1 4
wurde in 9 getrennte Bereiche eingeteilt mit der Breite,

wie sie in der Zeichnung angegeben ist. 20 Die Verfahrensweisen von Beispiel 1 und 2 werden Die Bereiche 2, 4 und 6 sind unbehandelt. Die wiederholt mit der Ausnahme, daß die Reagenzzonen Reagenzlösung für die Zone A wird auf den Bereich 1 auf das Papier in der Reihenfolge A, C, B, D auf geaufgebracht, zweimal auf jeder Seite des Papiers, bracht werden, wobei die gleiche Reihenfolge und das wobei man zwischen der ersten und zweiten Aufbrin- Verfahren für die Zonen E und Fwie in den Beispielen 1 güng jeder Seite trocknen läßt. In dieser Weise werden 25 und 2 angewandt werden.
3,4 mg p-Aminobenzoesäurenatriumsalz auf jeden . -ic
Teststreifen aufgebracht. Die Reagenzlösung der Beispiels
Zone B wird auf den Bereich 3, zweifach auf jeder Seite Man verwendet das Verfahren der Beispiele 1 und 2 des Papiers, aufgebracht, wobei man zwischen der mit der Ausnahme, daß die Reagenzzonen auf das ersten und zweiten Aufbringung auf jeder Seite ein- 30 Papier in der Reihenfolge C, D₁ B, A aufgebracht trocknen läßt. Dadurch bringt man etwa 9 mg Kalium- werden, wobei man die Zonen E und F in der gleichen thiocyanat auf jeden Teststreifen auf. Man muß darauf Reihenfolge und Art und Weise aufbringt wie im achten, daß sich die Reagenzlösungen der Zone A Beispiel 1 und 2 beschrieben.

und B nicht vermischen. Die Reagenzlösung der Zone C I

wird auf dem Bereich 5, einmal auf jeder Seite des Pa- 35 Beispiele» |

piers, aufgebracht, wodurch man 2,8 mg Zitronensäure Die Verfahren der Beispiele 1 und 2 werden ange- !

auf den Teststreifen aufbringt. Die Reagenzlösung der wandt mit der Ausnahme, daß die Reagenzzonen in |

Zone D, die während der Aufbringung auf 58 bis 60° C der Reihenfolge B, A, C, D auf das Papier aufgebracht \

gehalten wird, wird auf den Bereich 7, zweimal auf werden, wobei man für die Zonen E und F die gleiche ί

jeder Seite des Papiers, aufgebracht, wobei man zwi- 40 Weise wie im Beispiel 1 und 2 anwendet ί

sehen der ersten und zweiten Aufbringung auf jeder |

Seite trocknen läßt und man dadurch etwa 8 mg B e i s ρ i e 1 7 |

Chloramin-T je Teststreifen aufbringt Man muß |

vorsichtig sein, ein Vermischen oder einen Kontakt Man verwendet die Verfahren von den Beispielen 1 |

zwischen der Reagenzlösung der Zone B und der 45 und 2 mit der Ausnahme, daß die Reagenzzonen der j

Reagenzlösung der Zone D zu vermeiden. Nach Reihenfolge B, D, A, C auf das Papier aufgebracht i

jeder Aufbringung der Zonen sollte das Papier in werden, wobei man die Zonen E und F in der Reihen- ;

einem Abzug getrocknet werden, denn, wenn diese foige und der Verfahrensweise der Beispiele 1 und 2

Reagentien vermischt werden, bildet sich ein hoch- aufbringt.

toxisches Gas, nämlich Chlorcyan. Die Reagenzlösung 50 Beispiele
der Zone F wird auf den Bereich 9 aufgebracht, einmal

auf jeder Seite des Papiers, und man läßt trocknen. Die Die Verfahrensweisen der Beispiele 1 und 2 werden Reagenzlösung der Zone E wird auf die Bereiche 8 angewandt mit der Ausnahme, daß die Reagenzzonen und 9, einmal auf jeder Seite des Papiers, aufgebracht, in der Reihenfolge C, B, D, A auf das Papier aufgewobei man beide Bereiche überzieht und trocknen 55 bracht werden und man die gleiche Reihenfolge der läßt. Nachdem alle Bereiche des Papiers gut trocken Beispiele 1 und 2 für die Zonen £ und F verwendet
sind, wird es in 6,3 mm (V₄ inch) breite Streifen geschnitten, von denen jeder die 9, mit den beschriebenen Beispiel 9
Lösungen imprägnierten Bereiche enthält.

60 Das Verfahren von Beispiel 3 wird angewendet

Beispiel 3 ^unter Verwendung des Teststreifens, der im Beispiel 5 .. JjJ- ^ u -7 . hergestellt wurde. Als positive Anzeige der Anwesen-Verwendung der diagnostischen Zusammensetzung _{heit von Nikotins}ä_ure wird der Streifen orange bis Verwendungsverfahren rosa, und eine gelbe Querreaktion tritt auch auf dem Man bringt 0,6 ml eines Salzlösungsextraktes der zu 65 Teststreifen auf. Die positiven oder negativen Farbuntersuchenden Kultur (Mycobacterium species) in reaktionen der Teststreifen der Beispiele 6, 7 und 8 ein Teströhrchen von 13 · 100 mm oder ähnlicher sind in der Tabelle I angegeben.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

ao I Patentansprüche:

1. Diagnpstische Zusammensetzung zum Nachweis der vNicotinsäureproduktion durch Mycobakterien, bestehend aus einem schwammigen Material, das mit dem Alfaiisalz einer aromatischen Aminosäure, einem Alkalithiocyanat, einer kristallinen organischen Säure und Chloramin-T derart imprägniert ist, daß mehrere mit verschiedenen Reagenzien imprägnierte Zonen gebildet sind, welche durch unbehandelte Bereiche des schwammigen Materials voneinander getrennt sind, d adurch gekennzeichnet, daß vier Reagenzzonen A, B, C und D vorhanden sind, von denen