DE2006514B2

DE2006514B2 - Ein verfahren zur herstellung von proteolytischen enzymatischen produkten, die in vivo dem schleim des darmkanals, dem bronchialschleim und dem zervixschleim die optimale viskositaet verleihen und deren verwendung als zusatz in nahrungs- und futtermitteln

Info

Publication number: DE2006514B2
Application number: DE19702006514
Authority: DE
Inventors: Anmelder Gleich
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1969-02-21
Filing date: 1970-02-13
Publication date: 1977-09-29
Also published as: LU60376A1; IE33729B1; IL33904A0; DE2006514C3; BE745697A; GB1307516A; AT297635B; IE33729L; DK132666B; DE2006514A1; DK132666C; YU42270A; ES376787A1; CS151008B2; OA03218A; NL170965B; RO58428A2; IL33904A; NL7002466A; YU35032B

Description

)ic Erfindung beiriffi die in den Ansprüchen nierten Gegenstände.

)ie ständige Weiterentwicklung der Intensivviehzucht in den industrialisierten Ländern und der große Mangel an tierischem Eiweiß in den Entwicklungsländern machen Untersuchungen, die auf eine Steigerung tier Wachstumsgeschwmdigkcii der Tiere und eine . I lerabset/ung ihres Veibraudisindexes abzielen, immer dringlicher. Kürzlich wurde der Einfluß eines Zusatzes verschiedener gewöhnlicher (proteolyiischer, lipolytischer, amylolytischer) Enzyme, die die Verdauung der Hauptbestandteile von Mischfutter (Proteide, Lipide, . Glucicle) zu erleichtern vermögen, zu Mischfutter untersucht. Es war anzunehmen, daß diese exogenen Enzyme in Ergänzung der endogenen Enzyme die Verdauung in vivo und demzufolge das Wachstum der Tiere erleichtern würden. Alle diese Untersuchungen , führten bisher nicht zu praktisch brauchbaren Ergebnissen. Die Verbesserung der Wachstumgsgeschwindigkeit und des spezifischen Verbrauchs, die zuweilen beobachtet wurden, erwiesen sich schließlich in Anbetracht des Preises der zugesetzten Enzyme als zu gering und ι unbeständig.

Im Gegensatz hierzu ist die Erfindung auf die Bereitstellung von Enzym-Produkten gerichtet, die sich von den gewöhnlichen Enzymen durch ihre Fähigkeit unterscheiden, dem Intestinalschleim eine optimale Viskosität zu verleihen und somit die Geschwindigkeit der Aufnahme der verdauten Nahrungsmittel zu steigern.

Die Schleimhaut des Darmkanals, die empfindlich und schwach wie alle Schleimhäute ist, wird gegen Angriffe von außen durch eine Schicht viskoser Flüssigkeit, den Intestinalschleim, geschützt. Die Viskosität dieses Schleims ist an die Anwesenheit von Makromolekülen von Mucinen und Mucopolysacchariden gebunden, die untereinander durch Proteinbrücken verbunden sind und eine geschlossene Netzstruktur bilden.

Der Schleim des Darmkanals stellt auf diese Weise eine Art Schutzbarriere zwischen der Schleimhaut und der Masst der Nahrungs- und Futtermittel während der Verdauung dar. Diese Barriere verhindert eine zu enge Berührung der Wand des Magendarmkanals mit den großen Molekülen von endogenen Enzymen (Trypsin, Chymotrypsin), die die Verdauung der Nahrungs- und Futtermittel bewirken, aber schließlich auch die Schleimhaut selbst angreifen können. Dagegen muß diese Schutzschicht die kleinen Moleküle der verdauten Nährstoffe, die diese Intestinalwand durchdringen müssen, um in den Blutstrom zu gelangen, schnell hindurchtreten lassen.

Wenn der Intestinalschleim zu viskos ist, besteht die Gefahr, daß er den Durchgang der verdauten Nährstoffe in das Blut hemmt. Wenn die Viskosität zu gering ist, besteht die Gefahr, daß der Schleim seine normale Aufgabe, die Schleimhaut zu schützen, nicht mehr erfüllt. Es ist somit anzunehmen, daß sich zwischen diesen beiden entgegengesetzten Zuständen selten ein Optimum der Viskosität einstellt.

Der Erfindung liegen die beiden folgenden überraschenden Feststellungen zugrunde:

A. Es ist möglich, großtechnisch durch Fermentation proteolytische Enzyme herzustellen, die dem Schleim des Darmkanals in vivo die gewünschte optimale Viskosität zu verleihen vermögen. Bei Zusatz zu Nahrungs- und Futtermitteln bewirken diese Enzyme eine gelenkte und reversible Erniedrigung der Viskosität des Intestinalschleims und demzufolge eine selektive Steigerung der Geschwindigkeit der Resorption von verdauten Nahrungsstoffen.
Die gewöhnlichen proteolytischen Enzyme, deren

Verwendung πι dor tierischen Ernährung bereits erfolglos versucht wurde, haben im Gegensatz hier/u entweder eine ungenügende oder eine /u siarke V/irkung auf die Viskosität des Schleims ties Magen cJjrmkanuls. Im ersten Fall bleibt die Geschwindigkeit der Resorption durch die Wand des Darmkanals unverändert. Im /weiten l'all mit die />i starke Wirkung des Enzyms wie übrigens jede andere Reizwirkung eine schlagartige entladung des Inhalts der Schleimdrüsen in den Darm unter beschleunigter Neubildung des ln.\alts dieser Drüsen hervor. Diese unerwünschte reaktionelli· Hiypersekretion des Schleims, die bei einer einfachen Untersuchung der Darmwand von sezierten Tieren mit dem bloßen Auge deutlich erkennbar ist, ist mit der unerwünschten reaktioneilen übermäßigen Talgabscheidung vergleichbar, die durch eine Kopfwäsche mit zu starker Reinigungswirkung hervorgerufen wird.

Das Vorhandensein von proteolytischen Knzymen, die dem Schleim des Darmkanals eine optimale Viskosität, d. h„ diese Viskosität ohne Gefahr einer reaktioneilen Hypcrsektretion wesentlich zu erniedrigen vermögen, war somit keineswegs naheliegend.

B. Aus dieser optimalen Einstellung der Viskosität des Schleims und demzufolge aus dieser Steigerung der Resorptionsgeschwindigkeit der verdauten Nahrungsstoffe ergibt sich eine Steigerung der Wachstumsgeschwindigkeit der Tiere und eine Verringerung ihres spezifischen Fett Verbrauchs.

Die letztgenannte Folgerung war ebenfalls nicht naheliegend. Auf Grund der Länge des Magendarmkanals werden die Nahrungsstoffe schließlich imiüer vollständig resorbiert, und die Erfahrung lehrt, daß im K.ot normalerweise nur Reste ohne nennenswerten Mährwert verbleiben. Diese vollständige Resorption ist jedoch kein ausreichendes Kriterium für eine optimale Ausnutzung der Nahrungsstoffe. Zweifellos konnte man annehmen, daß es genügen würde, wenn das Blut gleichzeitig und in genügender Konzentration alle Faktoren der anabolen Synthese enthält. Aber nur Versuche konnten das folgende nicht ohne weiteres erkennbare Gesetz bestätigen: Zur Erzielung der maximalen Wachstumsgeschwindigkeit ist es besser, eine maximale Konzentration der verdauten Nahrungsst:offe im Blut während einer verhältnismäßig kurzen Zeit als eine mittlere Konzentration während einer längeren Zeit zu erreichen, selbst wenn in den beiden Fällen die Gesamtmenge der in die Blutbahn übergetretenen Nahrungsstoffe schließlich gleich ist.

Die erfindungsgemäß erhaltenen proteolytischen enzymatischen Produkte, die dem Schleim in vivo eine optimale Beschaffenheit zu verleihen vermögen, sind einerseits durch einen Vergleich ihrer Wirkung in vitro auf den Schleim des Magendarmkanals mit der Wirkung von zwei proteolytischen Enzymen mit optimaler natürlicher Wirkung, nämlich das Trypsin und das Chymotrypsin, gekennzeichnet. Dieser Vergleich wird nach dem Test der gelenkten Erniedrigung der Viskosität durchgeführt (reduction menagee de la viscosite = R. M. V.). Sie sind andererseits durch ihre Unempfindlichkeit gegenüber Trypsininhibitoren gekennzeichnet. Diese Unempfindlichkeit gewährleistet eine Wirkung in vivo.

Die Fermentation im erfindungsgemäßen Verfahren wird abgebrochen, sobald durch 0,1 ml einer Lösung von 250 Ansom-Einheiten der in der Fermentationsflüssigkeit gebildeten proteolytischen enzymatischen Produkte die Erniedrigung der Viskosität von 1 g Intestinalschleim bei 37°C in vitro unter sonst gleichen Bedingungen /wischen der durch 2^r>0 Ansoin Einheiten von reinem Trypsin Ικ'ΐνι.[gerufenen Viskositäiserniedrigung plus Wo als Maximum ίιηΙ der durch 250 Einheilen von reinem Chymotrypsin hervorgerufenen > Viskosiiätserniedrigung minus 5¹Vo als Minimum liegt, wobei die Erniedrigung der Viskosität als Prozentsatz der Viskosität des unbehandelten Intestinalschleims des Schweins oder des Kalbs ausgedrückt ist und für den Intcsiinalschleim des Schweins und ties Kalbs 60% für

π. diese Trypsin-Aktivitat und 4O¹Vi) für diese (hymotryp-SiIi-Akiivitiit nach halbstündigem enzymatischem Abbau beträgt.

/in" Herstellung der Enzyme werden Mikroorganismen verwendet, die enzymatische Produkte bilden, die

is die beiden folgenden Bedingungen erfüllen: Positiver R. M. V.-Test und Unempfindlichkeit gegenüber Trypsininhibitoren. Von den geeigneten Mikroorganismen waren die Pilze der Gattung Streptomyces fradiae von besonderem Interesse für den Anmelder. Aufgrund der

jo großen Zahl geeigneter Mikroorganismen ist jedoch keine Begrenzung hierauf beabsichtigt.

A. Beschreibung des R. M. V.-Tests

Ein Mikroorganismus, der Gemische von proteolyiisehen Enzymen in nennenswerten Mengen bildet, wird nach klassischem Verfahren gezüchtet. Die Fermentation wird nach Maßgabe in der Erfindungsdefinition abgebrochen. Die Bestimmung der verlangten Eigenschaften der gesuchten Zielprodukte erfolgt wie

.10 nachstehend angegeben.

Eine Ansom-Einheit (abgekürzt A. E.) wird definiert als die Enzymmenge, die bei Bebrütung für 10 Minuten bei 25"C und pH 7,5 in Gegenwart von denaturiertem Hämoglobin aus diesem Substrat das Äquivalent von

.^ I ng Tyrosin frei macht, bestimmt durch photometrische Absorption bei 280 ιπμ am Filtrat, das mit Trichloressigsäure nicht fällbar ist.

Als Substrat wird Schleim vom Kalb oder Schwein verwendet. Unmittelbar nach dem Schlachten des Tieres, das seit 24 Stunden kein Futter erhalten hat, entnimmt man hinter dem Magen drei aufeinanderfolgende Darmstücke von je etwa 1 m Länge. Man bindet ein Ende ab, und durch leichten Druck läßt man aus dem anderen Ende den Oberflächenschleim austreten, der

-15 entfernt wird. Anschließend gewinnt man durch starken Druck oder durch Abstreifen der Innenwand des vorher aufgeschlitzten Darms den Tiefenschleim, aus dem man die lösliche Phase durch Waschen mit 3 Raumteilen Wasser und anschließende Zentrifugierung abtrennt. Im Durchschnitt werden 50 ml unlöslicher Schleim pro Tier gewonnen. Dieser Schleim kann mefirere Tage bei -20⁰C aufbewahrt oder sofort für viskosimetrische Untersuchungen verwendet werden.

Für diese mikroviskosimetrischen Untersuchungen wird das Brookfield-Viskosimeter verwendet, das es ermöglicht, mit 1 g unlöslichem Schleim zu arbeiten. Die Winkelgeschwindigkeit des beweglichen Kegels wird im allgemeinen auf 12 UpM und die Temperatur auf 37°C eingestellt. Eine Skala von 0 bis 100 ermöglicht die Bestimmung der relativen Viskosität durch direkte Ablesung. Mit dem Schleim allein stellt man den Zeiger auf 100 ein. Darauf gibt man 0,1 ml einer auf pH 7,5 gepufferten Lösung zu, die das zu untersuchende enzymatische Produkt enthält. Wenn dieses Produkt aktiv ist, sinkt die Viskosität schnell, und man kann die Kurve der Erniedrigung der Viskosität in Abhängigkeit von der Zeit aufzeichnen. Die Vergleichsenzyme Trypsin und Chymotrypsin werden vorzugsweise in

hochreiner Form entsprechend 16 000 bzw. 20 000 A. EVmg verwendet. Sie bewirken eine Viskositätsverminderung des Schleims, die in weniger als 30 Minuten ein Plateau erreicht, so daß die Dauer eines Versuchs auf 30 Minuten festgesetzt werden kann. Bei einer Konzentration von 50 A. EVg Schleim bewirken diese Enzyme eine Erniedrigung der Viskosität um 20%. Bei der 5fachen Konzentration, d. h. 250 A. EVg Schleim, bewirken sie eine Viskositätserniedrigung, die im allgemeinen 60% bzw. 40% beträgt. Der Schleim vom Kalb oder Schwein variiert übrigens von einem Tier zum anderen, so daß diese Ergebnisse je nach der verwendeten Schleimprobe variieren können. Wenn Werte erhalten werden, die von den obengenannten Werten zu weit entfernt sind, kann die Schleimprobe entweder verworfen oder durch fraktionierende Fällung und erneute Suspendierung so behandelt werden, daß ungefähr diese Werte gefunden werden.

Mit einer solchen Schleimprobe wird die Erniedrigung der Viskosität ermittelt, die durch 250 A. E. des zu untersuchenden enzymatischen Produkts — in Form von 0,1 ml einer entsprechenden Lösung — pro Gramm Schleim hervorgerufen wird. Wenn diese Erniedrigung für das Zielprodukt zwischen 40 und 60% und allgemein zwischen 35 und 65% liegt, gilt dieses Produkt als geeignet im Sinne des R. M. V.-Tests und somit als fähig, die gewünschte optimale Viskosität des Schleims einzustellen.

Die Wirkung der Enzyme auf den Schleim wird durch die Figur veranschaulicht, in der in Abhängigkeil von der Zeit (in Minuten) als Abszisse die prozentuale Erniedrigung als Ordinate aufgetragen ist. Diese Darstellung zeigt die Kurven, die mit folgenden Enzymen erhalten wurden: Trypsin (Kurve 1) und Chymotrypsin (Kurve 2); mit einem Enzym, das die Bedingungen des R. M. V.-Tests nicht erfüllte, da die Erniedrigung zu gering war (Papain Kurve 3), mit einem Enzym, das genau den Bedingungen des R. M. V.-Tcsts entsprach (Enzym von Strcptomyccs fradiae, Präparat 2, Kurve 4), und schließlich mit einem Enzym, das die Bedingungen des R. M. V.-Tests nicht erfüllte, da die Erniedrigung zu stark war (Enzym von Bacillus subtilis, Kurve 5). Die Ergebnisse, die bei Verwendung dieser Enzyme im Tierfutter erhalten wurden, werden später beschrieben (Versuch 1).

B. Spezifität des R. M. V.-Tcsts

Die Wahl nach dem R. M. V.-Tcst ist eine der beiden wescntlicl.cn Voraussetzungen, die die gemäß der Erfindung verwendbaren enzymatischen Produkte erfüllen müssen. Die andere Voraussetzung, auf die später eingegangen wird (Versuch 1), besieht darin, daß diese Produkte praktisch unempfindlich gegenüber Trypsinin hibitoren sind.

Die enzymatischen Produkte, die clem R. M. V.-Tesi genügen, stellen bereits eine kleine Minderheit gegenüber der großen Zahl von Produkten dar, die diesem Test nicht genügen, weil sie die Viskosität zu wenig oder zu stark erniedrigen. Die Produkte, die dem R. M. V.-Test genügen und außerdem praktisch unempfindlich gegenüber Trypsininhibitoren sind, stellen somit eine noch kleinere Minderheit dar.

Die beiden vorstehend genannlcn Bedingungen können als charakteristisch bezeichnet werden. Wie man später an einem speziellen Fall (Versuch I) sehen wird, zeigen Versuche, daß die enzymatischen Produkte, die diese beiden Voraussetzungen erfüllen, einen günstigen Einfluß auf das Wachstum der Tiere ιιικΙ ganz allgemein eine eindeutige Wirksamkeit in den Nahrungs- und Futtermitteln haben. Umgekehrt haben, wie der gleiche Versuch zeigt, die Produkte, die diese beiden Voraussetzungen nicht erfüllen, auf das Wachstum der Tiere einen ungünstigen, keinen oder nur einen geringen und unbeständigen Einfluß. Dieser Einfluß liegt in der gleichen Größenordnung wie bei enzymatischen Produkten, die vor der Erfindung bereits als Zusatz zum Tierfutter vorgeschlagen wurden und sich schließlich aufgrund der mäßigen erzielten Ergebnisse nicht auf dem Markt behaupten konnten.

Der große Vorteil einer Auswahl der enzymatischen Produkte mit Hilfe der vorstehend beschriebenen charakteristischen Doppelvoraussetzung besteht darin daß sie es ermöglicht, einfach, schnell und zuverlässig die Produkte, die für den vorgesehenen Zweck geeignet sind, mit einer äußerst großen Erfolgsaussicht zu erkennen. Diese Wahl vermeidet lange und kostspielige Versuche an einer großen Zahl von Tieren, die man häufig durchgeführt hat, aber bisher nur zu Ergebnissen geführt haben, die für die Praxis nicht brauchbar sind.

Für das erfindungsgemäße Verfahren werden ζ. Β zwei Stämme von Streptomyces fradiae (N. 1998 und 2019 aus der Sammlung des Museum National d'Histoire Naturelle von Paris) verwendet. Nach klassischen Kultivierungsmethoden züchtet man einen dieser Stämme in einem Kulturmedium für die Großhcrstellung, das pro Liter die folgende Zusammensetzung hat:

30 g Sojabohnenmehl, 30 g Glucose, 0,8 g Dikaliumphosphat, 10 g Calciumcarbonat, pH 7,0. Die Kultivierung wird bei 28"C durchgeführt, wobei 0,3 Raumteile sterile Luft/Raumteil Kulturmedium/Minute zugeführt werden.

Unter diesen Bedingungen bildet Streptomyco fradiae Nr. 1998 keine Antibiotika, dafür aber wenigstens 5 Proteasen und 2 Peptidasen. Diese verschiedenen Enzyme können nur durch lange Analysenmethoden, die als Routinebestimmungen unzweckmäßig sind, nachgewiesen werden. Es ist jedoch notwendig, soweit wie möglich die Bildung cinigci dieser Enzyme, insbesondere die Bildung der Peptida sen, zu vermeiden, die in zu großer Konzentration unerwünscht sind. Das Wesentliche ist jedoch, daß da; erhaltene Enzymgemisch dem R. M. V.-Test genügt, dei sich schnell durchführen und somit an die Erfordernisse der Großhcrstellung anpassen läßt. Im allgemeiner genügt dieses Enzymgemisch dem R. M. V.-Test zi Beginn der Fermentation nicht, da die Viskositätscrnie drigung zu gering ist. In der Mitte des Fermentations prozcsscs genügt dieses Gemisch dem R. M. V.-Test während es am Schluß der Fermentation die Bcdingun gen des Tests nicht erfüllt, da die Viskosilätserniedri gung zu stark ist. Bei Anwendung der oben beschriebe ncn Methode bricht man die Fermentation ab, wenn dk Einwirkung des erhaltenen Enzymgemisches auf der Schleim beginnt, diejenige von Chymotrypsin zi überschreiten, ohne jedoch die des Trypsins zi erreichen. Diese Dauer der Fermentation kann voi einer Fabrikation zur anderen in Abhängigkeit voi geringen und praktisch unkontrollierbaren Schwankun gen der Bedingungen der Fermentation variieren. Dk Dauer liegt jedoch im allgemeinen zwischen 60 und 8' Stunden, und die (icsamtkonzentration des Fermenla lionsniciliums liegt im allgemeinen bei etwa J(KK A. EVmI.

Nach üblichen Isolierungsverfahren, jedoch immei unter der Kontrolle des R. M. V. Tests, werden au: dieser Ciärbriilu.¹ ilie !tilgenden ProilukIe gewonnen:

Produkt A:

Die filtrierte Kulturbrühe wird unter vermindertem Druck eingeengt. Hierbei wird ein flüssiges rohes enzymatisches Produkt mit wenigstens 50 000 A. EVmI erhalten.

Produkt B:

Aus dem Produkt A wird durch Zerstäubung ein festes rohes enzymatisches Produkt mit wenigstens 100 A. E./mg erhalten.

ProduktC:

Aus dem Produkt A wird durch Fällung mit Ammoniumsulfat und Trocknung unter vermindertem Druck ein teilweise gereinigtes enzymatisches Produkt mit wenigstens 1000 A. E./mg erhalten.

Produkt D:

Aus dem Produkt A wird durch eine Reihe von Fällungen mit Ammoniumsulfat und Lösungsmitteln, insbesondere Aceton, anschließende erneute Auflösung und Trocknung der endgültigen Fällung unter vermindertem Druck, ein fast gereinigtes enzymatisches Produkt erhalten, das wenigstens 10 000 A. E./mg enthält und eine relative elektrophoretische Monodispersion der enzymatischen Aktivität aufweist.

Produkt E:

Aus dem Produkt D wird durch Elektrophorese in der Flüssigphase oder durch Säulenchromatographie, Dialyse und Lyophilisierung das Enzym überwiegend in hochgereinigter Form abgetrennt. Es enthält wenigstens 50 000 A. E./mg und weist eine absolute elektrophoretische Monodispersion der enzymatischen Aktivität auf.

Alle diese Produkte erfüllen den R. M. V.-Test. Um gemäß der Erfindung verwendbar zu sein, müssen sie noch praktisch unempfindlich gegenüber Trypsininhibitoren sein.

Hierauf wird nachstehend eingegangen (Versuch 1). Die Versuche zeigen, daß dies bei den vorstehend genannten Produkten eindeutig der Fall ist. Diese Produkte stellen somit eine besondere Gruppe von enzymatischen Produkten dar, die gemäß der Erfindung verwendbar sind. Andere spezielle Gruppen von enzymatischen Produkten, die nach dem R. M. V.-Test gemäß der Erfindung verwendbar sind, können aus anderen Stämmen von Streptomyces oder aus Mikroorganismen anderer Gattungen, insbesondere aus Mikroorganismen der Gattung Bacillus, gewonnen werden.

Die vorstehend genannten Produkte A, B oder C f. eignen sich für die Herstellung von Mischfutter für Tiere, wie nachfolgend gezeigt wird.

A. Versuche an Ratten Versuch 1

Fütterung von Ratten mit McCollum-Futter

Dieses Futter hat die folgende Zusammensetzung: 60% Zucker, 12% Getreidemehl, 18% Kasein, 3% Hefe, 3% Talg, 4% McCollum-Salze.

Weiße Ratten, die ein Alter von 3 Wochen haben und etwa 40 g wiegen, werden in Gruppen von je 5 männlichen oder 5 weiblichen Tieren auf Käfige aufgeteilt. Sie erhalten das Futter und Trinkwasser nach Belieben. Sie werden im Verlauf von 3 Wochen einzeln zweimal pro Woche gewogen. Die durchschnittliche tägliche Gewichtszunahme wird an Gruppen von 10 Tieren (5 männliche und 5 weibliche) ermittelt.

Die Vergleichsgruppe erhält das McCollum-Futter Die Versuchsgruppen erhalten das gleiche Futter mil Enzymzusatz entweder in einer Dosis von 100 A. E./g oder in einer Dosis von 1000 A. E./g. Unter der Annahme, daß eine wachsende Ratte täglich eine Futtermenge verbraucht, die '/io ihres Gewichts entspricht (10 g Futter/Tag pro Ratte von 100 g) entsprechen diese Dosen 10 000 bzw. 100 000 A. E./kg Lebendgewicht pro Tag.

Die Enzyme, deren Wirkung auf den Schleim ir F i g. 1 dargestellt ist, werden verwendet. Außer derr Enzym S. F.-Präparat 2 (S. F. = Streptomyces fradiae) das die Viskosität des Schleims um 50% erniedrigt werden die Enzyme S. F.-Präparat 1 und S. F.-Präparat I verwendet, die die Viskosität des Schleims um 40% bzw 60% erniedrigen. Diese drei Präparate erfüllen die Bedingungen des R. M. V.-Tests im weiten Sinne, da sif eine Erniedrigung der Viskosität zwischen 35 und 65°/c bewirken, aber nur das Präparat 2 bewirkt eine Senkung der Viskosität des Schleimes um 50%. Diese dre Präparate entsprechen dem oben beschriebenen Pro dukt C und enthalten etwa 2000 A. E./mg. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle zusammenge stellt.

Einfluß der Enzyme auf die Erniedrigung der Viskosität des Schleims (gemäß dem R.M.V.-Test) und auf das Wachstum von Ratten

Enzym	Senkung	Ohne	Gewichtszunahme der	"/o	Kauen	H./g	^ll/o
	der Vis	Fnzym
	kosität		mil 100 Al·./,	100	mit 1000 A.	100
			Futter	121	!•'utter	119
		B/Tag	g/Tag	145	g/Tag	142
	0	2,85		114		103
Papain	30		2,85	105	2,85	84
S.F. Präparat 1	40		3,45	3,40
S.F. Präparat 2	50		4,15	4,05
S.F. Präparat 3	60		3,25	2,95
B.S.	80		3,00	2,40

S.K: F.ii/.ym von Slroptomyixs hacliai· Nr.
U.S.: Knzym von Uiu'illiis siiblilis.

IWK.

Das l'ii/.ym S. F.-I'räparat 2, (lessen Wirkung auf dun Schleim genau zwischen derjenigen von Trypsin und derjenigen von Chymotrypsin liegt (Krniedngung der Viskosität um 50⁰Xi), bewirkt eine Steigerung de Wiii'hstiimsgcschwindigkeil der Ratten zwischen 40 un< 45% für die beiden verwendeten Dosen.

709 639/8

Bei dem Enzym S. F.-Präparat 1, dessen Wirkung auf den Schleim mit derjenigen von Chymotrypsin vergleichbar ist (Erniedrigung der Viskosität 40%), ist diese Steigerung geringer, jedoch liegt sie bei etwa 20% für die beiden verwendeten Dosen.

Bei dem Enzym S. F.-Präparat 3, dessen Wirkung auf den Schleim mit derjenigen von Trypsin vergleichbar ist (Erniedrigung der Viskosität 60%), beträgt diese Steigerung noch 14% bei der niedrigen Dosis, sinkt jedoch fast auf 0 bei der hohen Dosis.

Die Enzympräparate von Streptomyces fradiae, die in unterschiedlicher Weise dem R. M. V.-Test genügen, haben somit einen unterschiedlichen günstigen Einfluß auf das Wachstum der Ratten. Wenn ferner Streptomyces fradiae kultiviert wird, ohne nach dem Verfahren gemäß der Erfindung zu arbeiten, werden im allgemeinen Enzympräparate erhalten, die die Bedingungen des R. M. V.-Tests nicht erfüllen, da sie eine zu starke Erniedrigung der Viskosität bewirken, und die einen deutlich ungünstigen Einfluß auf das Wachstum der Ratten haben.

Papain, das nicht die Bedingungen des R. M. V.-Tests erfüllt, da die Viskositätserniedrigung zu gering ist, hat keinen Einfluß auf das Wachstum der Ratten.

Ein Enzym von Bacillus subtilis, das dem R. M. V.-Test nicht genügt, da die Viskositätserniedrigung zu stark ist, hat in schwacher Dosis einen geringen günstigen Einfluß auf das Wachstum der Ratten, aber dieser Einfluß ist unbeständig. Bei starker Dosierung wird der Einfluß offensichtlich ungünstig. Bei der Autopsie sind an der Wand des Magendarmkanals der Ratten, die diese hohe Dosis erhalten haben, mit dem bloßen Auge deutliche Anzeichen einer Hypersekretion des Schleims erkennbar, die genügt, beobachtete die beobachtete Veriangsamung des Wachstums zu erklären.

Trypsin und Chymotrypsin bewirken eine geringe und unbeständige Steigerung der Wachstumsgeschwindigkeit der Ratten. Diese Steigerung bleibt in jedem Fall unter 10%. Diese Pankreasenzyme, die in vitro auf den Schleim eine Wirkung haben, die mit derjenigen der Präparate 1, 2 und 3 der S. F.-Enzyme vergleichbar ist, zeigen somit in vivo eine wesentlich geringere Wirkung auf das Wachstum der Ratten. Diese Anomalie kann dadurch erklärt werden, daß das Trypsin und Chymotrypsin im Überschuß in vivo durch endogene Trypsininhibitoren, z. B. den Kunilzschen Pankreas-Inhibitor, blockiert werden können. Dagegen ist das Enzym, das in den von Streptomyces fradiae erhaltenen Präparaten 1, 2 und 3 überwiegt, gegenüber diesem Inhibitor praktisch unempfindlich. Ebenso ist es praktisch unempfindlich gegenüber exogenen Inhibitoren, z. B. gegenüber dem Soja-Inhibitor.

Versuch 2

Fütterung von Ratten
mit einem an Sojaproteinen reichen Futter

Dieses Fuller, das normalerweise für die llühncheiizucht verwendet wird, hat die folgende Zusammense,-zung: b0% Maismehl, 33% Sojabohnenmehl, 3% Talg, 4% Mineral- und Vitaminpräparat. Der Versuch wird an Gruppen von H) männlichen Rattun unter den gleichen allgemeinen Bedingungen wie bei dem im Versuch I beschriebenen Versuch durchgeführt. Die Verglciehsgrtippc hai eine mittlere Gewichtszunahme von 5,25 |;/Tag.

Die Versuehsgruppe I, die das gleiche Fuller mit /usal/ des S. F.-Hiizympräparnls 2 in einer Dosis von 1000 A. E./g erhält (entsprechend etwa 100 000 A. E./kj Lebendgewicht/Tag), hat die gleiche durchschnittliche tägliche Gewichtszunahme.

Die Versuchsgruppe 2, die das gleiche Futter, aber eir Trinkwasser erhält, in dem das S. F.-Enzympräparat 2 ir einer Dosis von 500 A. E./ml gelöst ist (entsprechenc ebenfalls etwa 100 000 A. E./kg Lebendgewicht/Tag) hat eine durchschnittliche Gewichtszunahme von 7,3 g/Tag, d. h. eine um 39% gesteigerte Gewichtszunahme.

ίο Der bei der Versuchsgruppe 1 festgestellte Mißerfolg ist nicht auf die Anwesenheit des Northrop-Trypsininhi bitors im Sojabohnenmehl zurückzuführen, da diesel Inhibitor durch die Wärmebehandlung, die normaler weise vom Lieferanten dieses Ausgangsmaterial:

vorgenommen wird, zerstört worden war. Der Mißer folg ist vielmehr darauf zurückzuführen, daß das Enzyrr eine besondere Affinität zu den Sojaproteinen zu haber scheint, die, wenn sie dem Futter in hoher Konzentra tion zugesetzt werden, das gesamte Enzym an sich binden können. Dadurch kann dieses Enzym nicht mehl auf die Proteine des Schleims einwirken, desser Viskosität nicht mehr erniedrigt wird. Wenn jedoch da: Enzym dem Trinkwasser und nicht dem Futter zugesetz wird, wird dieser Abbau der Proteine teilweise vermieden. Dies ist der Grund für den Erfolg, der bei de Versuchsgruppe 2 erzielt wurde. Es ist somit irr allgemeinen zweckmäßig, das Enzym dem Trinkwassei zuzusetzen. Versuche haben außerdem gezeigt, daß die Stabilität des Enzyms in Lösung genügt, um diese Verabfolgung in Großzüchtereien vornehmen zi können.

Versuch 3
_1S Versuche an isolierten Darmschlingen

Diese Versuche haben den Zweck, die Steigerung de Geschwindigkeit der Resorption der Nahrungsstoffi durch die Darmwand direkt nachzuweisen.

Die Versuche werden mit 5 Ratten durchgeführt, di( seit 24 Stunden kein Futter erhalten haben, etwa 150$ wiegen und mit Urethan anästhesiert sind. Nach de Öffnung der Bauchhöhle werden etwa 10 cm lleurr isoliert. Jedes Ende ist durch eine Sonde von außer zugänglich. Man wäscht das Ileum und führt dann 0,4 m einer Lösung von Kaseinhydrolysat ein, die 2,5 mj Stickstoff enthält. Man läßt die Lösung 10 Minuten in Ileum, entnimmt sie dann und führt eine Spüllösung ein die ebenfalls entnommen wird. Der restliche Stickstof in diesen beiden Lösungen wird bestimmt. Der gleich

so Versuch wird an der gleichen Ratte wiederholt, wobe jedoch vorher 0,05 ml einer Lösung eingeführt werden die 0,5 mg/ml Enzyme des S. F.-Präparats 2, el. h. etwa 5< A. E. enthält.

Es wird festgestellt, daß die resorbierte Stickstoff

ro menge bei den Vergleichsversuchen ohne Enzym vot einem Tier zum anderen slark schwankt und in Durchschnitt 5% beträgt. Bei den mit Enzym durchge führten Versuchen schwankt die resorbierte Stickstoff menge weniger und ist viel höher, nämlich durchschnitt

(.ι. lieh 17%.

Nach der gleichen Methode kann die (iesehwindig keil der Resorption anderer Nahruiigsstofl'e und ihn mögliche Steigerung unter dem Einfluß des Enzym untersucht werden. Es ist festzustellen, daß dies;

(·■> Steigerung im allgemeinen bei den Proteiden grölier is als bei Glueiden oder I.ipideii. Die Steigerung de Wachsliimsgesehwindigkeit durch das Enzym null somit mehr zugunsten ties Muskelgewebes des Tiere

als zugunsten seiner Reservestoffe erfolgen. Es kann somit gesagt werden, daß das Wachstum des Tieres nicht nur in der Quantität, sondern auch in der Qualität verbessert wird.

B. Versuche mit Hähnchen

Versuch 4
Hähnchenzucht auf dem Erdboden

Hähnchen vom Stamm Arbor-Acres werden zunächst gemeinsam gezüchtet und erhalten das gleiche Starterfutter. Im Alter von 12 Tagen werden sie in vier Gruppen zu je 25 Tieren aufgeteilt, die das gleiche mittlere Gewicht (124 g) und die gleiche Standardabweichung (3,28) haben.

Die Vergleichsgruppe 1 erhält ein Futter auf Basis von Mais und Soja mit geringer Proteinkonzentration (16%). Am Schluß des Versuchs im Alter von 58 Tagen, d. h. nach einer Versuchsdauer von 46 Tagen, beträgt das mittlere Gewicht 1430 g und der Verbrauchsindex (Verhältnis des Gewichts des verbrauchten Futters zum Gewicht der Tiere) 2,30.

Die Versuchsgruppe 1 erhält das gleiche Futter, jedoch mit einem Zusatz von 4 g/kg des oben beschriebenen Produkts B mit 100 A. E7mg. Die Enzymdosis beträgt somit 400 A. EAg entsprechend etwa 40 000 A. E./kg Lebendgewicht pro Tag. Am Schluß des Versuchs beträgt das mittlere Gewicht 1553 g( + 8%) und der Verbrauchsindex 2,15 (-7%).

Die Vergleichsgruppe 2 erhält ein Futter auf Basis von Mais und Soja mit normaler Proteinkonzentration (22%). Am Schluß des Versuchs beträgt das mittlere Gewicht 1676 g und der Verbrauchsindex 2,09.

Die Versuchsgruppe 2 erhält das gleiche Futter ebenfalls mit einem Zusatz von 400 A. E./kg Futter. Am Schluß des Versuchs beträgt das mittlere Gewicht " 1772 g (+ 6%) und der Verbrauchsindex 1,98 (- 5%).

Versuch 5
Hähnchenzucht in der Batterie

Der Versuch wird mit zwei Gruppen von etwa 6000 Hähnchen vom Stamm Vauguard-Garrison durchgeführt, die in der Batterie aufgezogen werden. Die Vergleichsgruppe erhält in Form von Mehl ein handelsübliches Futter auf Basis von Soja und Mais, das laut Analyse 21% Proteine und 5% Lipide enthält. Für dieses Futter wird ein Penicillin-Prokain-Gehalt von 8 mg/kg und ein Tetracyclingehalt von 25 mg/kg garantiert. Die Versuchsgruppe erhält das gleiche Futter mit Zusatz von 400 mg/kg des obengenannten Produkts C, das 2000 A. E./mg enthält. Die Enzynidosis beträgt somit 800 A. E./kg Futter entsprechend etwa 80 000 A. E./kg Lebendgewicht pro Tag.

Am 30. Tag des Versuchs haben die Hähnchen anscheinend die gleiche Entwicklung in beiden Gruppen, aber jedes Hähnchen hat im Durchschnitt 1080 g Futter in der Vergleichsgruppe und nur 903 g Futter ir der Versuchsgruppe verbraucht. Dies entspricht einei Futtereinsparung von etwa 16%.

Vom 40. Tage an entwickelt sich in der gesamter Zucht eine Epidemie, der die Versuchsgruppe vie besser widersteht. Nach 60 Tagen beträgt die Mortalitäl in der Vergleichsgruppe 5% und in der Versuchsgruppe nur 1,6%.

ίο Das mittlere Gewicht beträgt 1346 g bzw. 1319 g Dieses etwas niedrigere Gewicht bei der Versuchsgruppe erklärt sich dadurch, daß in dieser Gruppe die Tiere von schwacher Konstitution überlebten, während sie ohne den Enzymzusatz wahrscheinlich eingeganger wären.

Der Verbrauchsindex beträgt 2,8 bzw. 2,63. Hierau: ergibt sich eine Futtereinsparung von 6,5% bei dei Versuchsgruppe.

Kontrollversuch: Zu Beginn des Hauptversuch:

werden aus jeder Gruppe 25 Hähnchen entnommen unc auf dem Erdboden in einem getrennten Raurr aufgezogen, wo die hygienischen Bedingungen besser sind. Die Mortalität bei diesen Gruppen ist Null. Das mittlere Gewicht beträgt 1603 g bei der Vergleichsgruppe und 1746 g ( + 9%) bei der Versuchsgruppe. Der Verbrauchsindex beträgt 2,68 bzw. 2,41 (-10%).

Versuch 6

Wiederholung des in Versuch 5 beschriebenen
Versuchs

Während der in Versuch 5 beschriebene Versuch im Hochsommer während einer Hitzewelle durchgeführt wurde, unter der die Tiere offensichtlich litten, wurde der hier beschriebene Versuch im Herbst unter normalen klimatischen Bedingungen durchgeführt, Nach 60 Tagen beträgt die Mortalität bei der Vergleichsgruppe 7,9% und bei der Versuchsgruppe 4,8%. Das mittlere Gewicht beträgt 1338 g bzw. 1356 g, Der Verbrauchsindex beträgt 2,73 bzw. 2,38 entsprechend einer Futtereinsparung von 12,4% bei der Versuchsgruppe.

Die Versuche mit Hähnchen wurden durchgeführt, bevor die Gefahr der Bindung des Enzyms durch die

^s Sojaproteine vermutet und durch Zusatz des Enzyms zum Trinkwasser wie in Versuch 2 ausgeschaltet wurde. Mit Hähnchen können weit bessere Ergebnisse, insbesondere Steigerungen der Wachstumsgeschwindigkeit, die mit den in Versuch 2 beobachteten ( + 39%)

so erzielt werden, wenn das Enzym dem Trinkwasser und nicht dem Futter zugesetzt wird.

Die Futtermittel für die Tiere können in Verbindung mit einem physiologisch unbedenklichen Hilfsstoff wenigstens eines der Produkte A, B oder C enthalten.

ss Sie werden in einer Dosis von 1000 bis 20 000 A. E./kg Körpergewicht pro Tag verabfolgt.

Hliitl /eichnuimen

Claims

Patentansprüche:

I. Verfahren zur Herstellung von proleol> tischen enzymatischen Produkten, die in vivo dem Sehleim des Darmkanals, dem Dronchialschleim und dem Zervixschleim die optimale Viskosität verleihen, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kultivierung eines proteolytische Enzyme, die gegen Trypsin-Inhibitoren unempfindlich sind, bildenden Mikroorganismus abbricht, sobald durch 0,1 ml einer Lösung von 250 Ansom-Einheiten de^r in der Fermentationsflüssigkeit gebildeten proteolytischen enzymatischen Produkte die Erniedrigung tier Viskosität von i g Intestinalschleim bei 37"C in vitro unter sonst gleichen Bedingungen zwischen der durch 250 Ansom-Einheiten von reinem Trypsin hervorgerufenen Viskositäiserniedrigung plus 5% als Maximum und der durch 250 Einheiten von reinem Chymotrypsin hervorgerufenen Viskositätserm'edrigung minus 5% als Minimum liegt, wobei die Erniedrigung der Viskosität als Prozentsatz der Viskosität des unbehandelien Inlestinalschleims des Schweins oder des Kalbes ausgedrückt ist und finden Intestinalschleim des Schweins und des Kalbs 60% für diese Trypsin-Aktivität und 40% für diese Chymotrypsin-Aktivität nach halbstündigem enzymatischem Abbau beträgt, und daß man aus dieser Fermentationsflüssigkeit gereinigte proteolytische enzymatische Produkte mit den Eigenschaften, daß einerseits in vitro bei 37"C die Erniedrigung der Viskosität von 1 g Intestinalschleim, der mit 0,1 ml einer auf pH 7,5 gepufferten Lösung von 250 Ansom-Einheiten dieser enzymatischen Produkte behandelt worden ist, unter sonst gleichen Bedingungen zwischen der Viskositätserniedrigung durch 250 Ansom-Einheiten von reinem Trypsin +5% als Maximum und der Viskositätsverminderung durch 250 Ansom-Einheiten von reinem Chymotrypsin — 5% als Minimum liegt, wobei die Erniedrigung der Viskosität als Prozentsatz der Viskosität des unbehandelten Intestinalschleims ausgedrückt ist und für den Intestinalschleim des Schweins und des Kalbs 60% für diese Trypsin-Aktivität und 40% für diese Chymotrypsin-Aktivität nach halbstündigem enzymatischem Abbau beträgt, und daß sie andererseits unempfindlich gegenüber Trypsin-Inhibitoren sind, gewinnt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Stamm aus der Gattung Streptomyces eingesetzt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein Stamm Streptomyces fradiae eingesetzt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennteichnet, daß die Stämme Streptomyces fradiae Nr. 1998 und 2019 der Sammlung des Museum National Ü'Histoire Naturelle, Paris, eingesetzt werden.
5. Verwendung der nach den Ansprüchen 1-4 erhaltenen proteolytischen enzymatischen Produkte als Zusatz in Nahrungs- und Futtermitteln.