DE2006514A1

DE2006514A1 - Neue proteolytische enzymatische Produkte, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung

Info

Publication number: DE2006514A1
Application number: DE19702006514
Authority: DE
Inventors: M Hooreman
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1969-02-21
Filing date: 1970-02-13
Publication date: 1970-09-10
Also published as: FR2034559B1; DE2006514B2; IE33729L; LU60376A1; IE33729B1; IL33904A0; DK132666C; YU35032B; GB1307516A; ES376787A1; CH513978A; DK132666B; NL170965C; RO58428A2; AT297635B; CS151008B2; NL170965B; FR2034559A1; SE374389B; DE2006514C3

Description

Köln, den 9o2₀1970 Kl/Ax

Michel Hooreman, 9, Rue Marbeau, Paris (Frankreich)

Neue proteolytische enzymatische Produkte, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre; Verwendung

'Die Erfindung betrifft neue proteolytische e'nzymatische Produkte, die die wertvolle Fähigkeit haben, den Schleimen, insbesondere dem Intestinalschleim, dem Brochialschleim und dem Zervikalschleim in vivo eine optimale· Viskosität zu verleihen» Die■Erfindung betrifft ferner die Herstellung dieser Produkte und ihre Anwendungen in der Ernährung und in der Veterinärmedizin sowie ihre diätetischen und pharmazeutischen Anwendungen,,

Die ständige Weiterentwicklung der Intensivviehzucht in den industrialisierten Ländern und der große Mangel an tierischem Eiweiß in den' Entwicklungsländern machen Untersuchungen, die auf eine S-teigerung der Wachstumsgeschwindigkeit der Tiere und eine Herabsetzung ihres Verbrauchsindexes abzielen, immer dringlicher. Kürzlich wurde der Einfluß eines Zusatzes verschiedener gewöhnlicher (proteolytischer, lipolytischer, amylolytineher) Enzyme, die die Verdauung der Hauptbestandteile von Mischfutter (Proteide, Lipide, Glucide) zu erleichtern vermögen, zu Mischfutter untersuchte Es war anzunehmen, daß ' diese exogenen Enzyme in Ergänzung der endogenen Enzyme die

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Verdauung in vivo und demzufolge das Wachstum der Tiere erleichtern würden. Alle diese Untersuchungen führten ■[ bisher nicht zu praktisch brauchbaren Ergebnissen. Die Verbesserung der Wachstumsgeschwindigkeit und des spezifisehen Verbrauchs, die zuweilen beobachtet wurden, erwiesen sich schließlich in Anbetracht des Preises der zugesetzten Enzyme als zu gering und unbeständig.

Im Gegensatz hierzu ist die Erfindung auf Enzyme gerichtet, _fc. die sich von den gewöhnlichen Enzymen durch ihre Fähig- W 10 keit unterscheiden, dem Intestinalschleim eine optimale Viskosität zu verleihen und somit die Geschwindigkeit der Aufnahme der verdauten Nahrungsmittel sowie der oral verabreichten Medikamente zu steigern.

Die Schleimhaut des Darmkanals, die empfindlich und schwach wie alle Schleimhäute ist, wird gegen Angriffe von außen durch eine Schicht viskoser Flüssigkeit, den Intestinalschleim, geschützt. Die Viskosität dieses Schleims ist an die Anwesenheit von Makromolekülen von Mucinen und Mucopolysacchariden gebunden, die untereinander durch Proteinbrücken verbunden sind und eine geschlossene Netzstruktur bilden.

Der Schleim des Darmkanals stellt auf diese Weise eine Art Schutzbarriere zwischen der oohleimhaut und der Masse der Nahrungs- und Futtermittel während der Verdauung dar.

Diese Barriere verhindert eine zu enge Berührung der Wand des Magendarmkanals mit den großen Molekülen von endogenen Enzymen (Trypsin, Chymotrypsin), die die Verdauung der Nahrungs- und Futtermittel bewirken, aber schließlich auch die Schleimhaut selbst angreifen können. Dagegen muß diese Schutzschicht die kleinen Moleküle der verdauten Nährstoffe, die diese Intestinalwand durchdringen müssen, um in den Blutstrom zu gelangen, schnell hindurchtreten lassen.

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Wenn der Intestinalsehleim zu viskos ist, bes'teht die Gefahr, daß er den Durchgang der· verdauten Nährstoffe in das Blut hemmt,, Wenn die Viskosität zu gering ist, besteht die Gefahr, daß der¹' Schleim seine normale Aufgate, die Schleimhaut zu schützen, nicht mehr erfüllt.

Es 1st somit anzunehmen, daß sieh zwischen diesen beiden entgegengesetzten Zuständen selten ein Optimum der Viskosität einstellt.

Der Erfindung liegen die beiden folgenden überraschenden Feststellungen zu Grunde:

A. Es'ist möglich, großtechnisch durch Fermentation proteolytische Enzyme herzustellen, die dem Sehleim des Darmkanals, in vivo die gewünschte optimale Viskosität zu verleihen vermögen« Bei oraler Verabfolgüng, d.h. in der Praxis bei Zusatz zu Nahrungs- und Futtermitteln und/oder zum Trinkwasser, bewirken diese Enzyme eine gelenkte und reversible Erniedrigung der Viskosität des intestinalschleims und_demzufolge eine selektive Steigerung der Geschwindigkeit der Resorption von verdauten Uahrungsstoffen sowie von Medikamenten, die oral gleichzeitig mit diesen Enzymen oder unmittelbar nach ihnen gegeben werden.

Die gewöhnlichen proteolytischen Enzyme, deren Verwendung in der tierischen Ernährung bereits erfolglos versucht wurde, haben Im Gegensatz hierzu entweder eine ungenügende oder eine zu starke 'Wirkung auf die Viskosität des

Schleims des Magendarmkanals, Im ersten Fall bleibt die — Geschwindigkeit der Resorption durch die Wand des ' , Darrnkanals unverändert. Im zweiten Fall ruft die zu starke Wirkung des Enzyms wie übrigens jede andere Reizwirkung eine schlagartige Entladung des Inhalts der Schleimdrüsen in den Darm unter beschleunigter Neubildungdes Inhalts dieser Drüsen hervor. Diese unerwünschte reaktionelle Hypersekretion des Schleims, die bei einer einfachen Untersuchung der Darmwand von sezierten Tieren

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mit dem bloßen Auge deutlich erkennbar ist, ist mit der unerwünschten reaktioneilen übermäßigen Talgabscheidung vergleichbar, die durch eine Kopfwäsche mit zu starker Reinigungswirkung hervorgerufen wird.

Das Vorhandensein von proteolytischen Enzymen, die dem Schleim des Darmkanals eine optimale Viskosität, d.h. diese Viskosität ohne Gefahr einer reaktioneilen Hypersekretion wesentlich zu erniedrigen vermögen, war somit keineswegs naheliegend.

B. Aus dieser optimalen Einstellung der Viskosität des Schleims und demzufolge aus dieser Steigerung der Resorptionsgeschwindigkeit der verdauten Nahrungsstoffe ergibt sich eine Steigerung der Wachsturasgeschwindigkeit der Tiere und» eine Verringerung ihres spezifischen Fetter-Verbrauchs.

Die letztgenannte Folgerung war ebenfalls nicht naheliegend. Auf Grund der Länge des Magendarmkanals werden die Nahrungsstoffe schließlich immer vollständig resorbiert, und die Erfahrung lehrt, daß im Kot normalerweise nur Reste ohne nennenswerten Nährwert verbleiben. Diese vollständige Resorption ist jedoch kein ausreichendes Kriterium für eine optimale Ausnutzung der Nahrungsstoffe. Zweifellos konnte man annehmen, daß es genügen würde, wenn das Blut gleichzeitig und in genügender Konzentration alle Faktoren der anabolen Synthese enthält. Aber nur Versuche konnten das folgende, nicht ohne weiteres erkennbare Gesetz bestätigen: Zur Erzielung der maximalen Wachsturnsgeschwindigkeit ist es besser, eine maximale Konzentration der verdauten Nahrungsstoffe im Blut während einer verhältnismäßig kurzen Zeit als eine mittlere Konzentration während einer längeren Zeit zu erreichen, selbst wenn in den beiden Fällen die Gesamtmenge der in die Blutbahn übergetretenen Nahrungsstoffe schließlich '0\, gleich ist.

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OWGINAL INSPECTED

Die enzymatischen Produkte gemäß der Erfindung, die dem Schleim in vivo eine optimale Beschaffenheit zu verleihen vermögen, sind einerseits durch einen Vergleich ihrer Wirkung in vitro auf den Schleim des Magendarmkanals mit der Wirkung von zwei proteolytischen Enzymen mit optimaler natürlicher Wirkung, nämlich das Trypsin und das Chymotrypsin gekennzeichnete Dieser Vergleich wird nach dem Test der gelenkten Erniedrigung der Viskosität durchgeführt (reduction menagee de la viscosite = RKV). Sie sind andererseits durch ihre Unempfindlichkeit gegenüber Trypsininhibitoren gekennzeichnet. Diese Unempfindlichkeit gewährleistet eine Wirkung in vivo.

Die Erniedrigung der Viskosität des Schleims des Magendarmkanals durch diese enzymatischen Produkte,muß, genauer gesagt, gegenüber der Viskosität dieses unbehandelten Schleims etwa 5^c/° über bis etwa 5$ unter den Werten der Erniedrigung der Viskosität durch Trypsin und Chymotrypsin, d.h. zwischen 60 + 5 = 65$ und 40 - 5 = 35$ im Verhältnis zur Viskosität des unbehandelten Schleims unter den nachstehend genannten Bedingungen liegen.

Gemäß einem Merkmal der Erfindung liegt in vitro die Erniedrigung der Viskosität des Intestinalschleima durch diese enzymatischen Produkte genau zwischen den Werten, die sich durch Trypsin und Chymotrypsin ergeben (60-40/0).

Das Verfahren gemäß der Erfindung durch Fermentation von Mikroorganismen, die proteolytische Enzyme bilden, beruht ebenfalls auf dem RMV-Test. Die Fermentation wird abgebrochen, sobald die gebildeten enzymatischem Substanzen als Prozenuatz der Viskosität des unbehandelten Schleimes eine Erniedrigung der Viskosität ergeben, die wenigstens derjenigen durch Chymotrypsin minus 5$ und höchstens derjenigen durch Trypsin plus 5/' entspricht (wobei die Prozentsätze immer auf die Viskosität des unbehandelten Schleimes bezogen sind). Dieae3 Verfahren

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umfaßt auch die notwendigen Behandlungen für die Reinigung der erhaltenen Produkte, sobald diese sich als unempfindlich gegenüber Trysininhibitoren erweisen.

Zur Herstellung der Enzyme werden Mikroorganismen ver~ wendet, die enzymatische Produkte bilden, die die beiden folgenden Bedingungen erfüllen: Positive RMV-Test und Unempfindlichkeit gegenüber Trypsininhibitoren. Von den geeigneten Mikroorganismen waren die Pilse der Gattung Streptomyces fradiae von besonderem Interesse für den ■ 10 Anmelder. Aufgrund der großen Zahl geeigneter Mikroorganismen ist jedoch keine Begrenzung hierauf beabsichtigt.

A. Beschreibung des R.M,V.-Tests

a) Herstellung'des zu untersuchenden enzymatischen Produkts '

Ein Mikroorganismus, der Gemische von proteolytischen

Enzymen in nennenswerten Mengen bildet, wird nach klassischen Verfahren gezüchtet. Nach Beendigung der Fermentation wird das Medium filtriert, eingeengt, lyophilisiert oder zerstäubt. Auf diese Weise wird ein rohes fe 20 Enzym erhalten« Vorzugsweise wird nach Filtration und Einengung das durch Ausfällung mit Ammoniumsulfat erhaltene Produkt unter Vakuum getrocknet, wobei ein teilweise gereinigtes enzymatischem Produkt erhalten wird, das nach der klassischen Anaoii, Methode wenigstens 1000 Einheiten/mg enthalten muß.

Eine Anoom-Einheit (abgekürzt Λ.Ξ.) wird definiert als die Enzymmenge, die bei Bebrütung für 10 Minuten bei P¹J⁰C und Pu 7,5 in Gegenwart von denaturiertem Hämoglobin aus diesem Substrat das Äquivalent von 1 ug Tyrosin frei macht, bestimmt durch photometriuche Absorption bei P.liO mu am Filtrat, das mit Trichlorcniiignäure nicht fällbar i3t.

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"b) Messung

Als Substrat wird Schleim vom Kalb oder Schwein verwendet. Unmittelbar nach dem Schlachten des Tieres, das seit 24 Stunden kein Futter erhalten hat, entnimmt man hinter dem Magen drei aufeinanderfolgende Darmstücke von je etwa 1 m Länge. Man bindet ein Ende ab, und durch leichten Druck läßt man aus dem anderen Ende den Oberflächenschleim austreten, der entfernt wird. Anschließend gewinnt man durch starken Druck oder durch Abstreifen der Innenwand des vorher aufgeschlitzten Darms den Tiefenschleim, aus dem man die lösliche Phase durch Waschen mit 3 Raumteilen Wasser und anschließende Zentrifugierung abtrennt. Im Durchschnitt werden 50 ml unlöslicher Schleim pro Tier gewonnen. Dieser Schleim kann mehrere

Tage bei -20⁰C aufbewahrt oder sofort für viskosimetrische Untersuchungen verwendet werden.

Für diese m-ikroviskosimetrischen Untersuchungen wird das Brookfield-Viskosimeter verwendet, 'das es ermöglicht, mit 1 g unlöslichem Schleim zu arbeiten. Die Winkelgeschwindigkeit des beweglichen Kegels wird im allgemeinen auf 12 UpM und die Temperatur auf 37°C eingestellte Eine Skala von 0 bis 100 ermöglicht die Bestimmung der relativen Viskosität durch direkte Ablesung» Mit dem Schleim allein stellt man den Zeiger auf 1OC ein. Darauf gibt man 0,1 ml einer auf p^ 7,5 gepufferten Lösung zu, die das zu untersuchende enzymatische Produkt enthält. Wenn dieses Produkt aktiv ist, sinkt die Viskosität schnell, und man kann die Kurve der Erniedrigung der Viskosität in Abhängigkeit von der Zeit aufzeichnen. Die Vergleichsenzyme Trypsin und Chymotrypsin werden vorzugsweise in hochreiner Form entsprechend 16000 bzw. 20000 A.E./mg verwendet. Sie bewirken eine Viskositätsverminderung des Schleims, die in weniger ein 30 Minuten ein Plateau erreicht, se; daß die Dauer eines Versuchs auf 30 Hinuten festgesetzt werden kann. Bei einer Konzentration von

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50 A.E./g Schleim bewirken diese Enzyme eine Erniedrigung der Viskosität um 20$. Bei der 5-fachen Konzentration, d.h. 250 A.E./g Schleim, bewirken sie eine Viskositätserniedrigung, die im allgemeinen 60$ bzw. 40$ beträgt. Der Schleim vom Kalb oder Schwein variiert übrigens von einem Tier zum anderen, so daß diese Ergebnisse je nach der verwendeten Schleimprobe variieren können. Wenn Werte erhalten werden, die von den oben genannten Werten zu weit entfernt sind, kann die Schleimprobe entweder verworfen oder durch fraktionierende Fällung und erneute fc Suspendierung so behandelt werden, daß ungefähr diese Werte gefunden werden.

Mit einer solchen Schleimprobe wird die Erniedrigung der Viskosität ermittelt, die durch 250 A.E. des zu untersuchenden enzymatischen Produkts pro Gramm Schleim hervorgerufen wird. Wenn diese Erniedrigung vorzugsweise zwischen 40 und 60$ und allgemein zwischen 35 und 65$ liegt, gilt das enzymatische Produkt als geeignet im Sinne des R.M.V.-Tests und somit als fähig, die gewünschte optimale Viskosität des Schleims einzustellen.

Die Wirkung der Enzyme auf den Schleim wird durch die Abbildung veranschaulicht, in der in Abhängigkeit von der Zeit (in Minuten) als Abszisse die prozentuale Erniedrigung als Ordinate aufgetragen ist. Diese Darstellung zeigt die Kurven, die mit folgenden Enzymen erhalten wurden: Trypsin (Kurve 1) und Chymotrypsin (Kurve 2); mit einem Enzym, das dio Bedingungen des R.M.V.-Tests nicht erfüllte, da die Erniedrigung zu gering war (Papain, Kurve 3)i mit einem Enzym, das genau den Bedingungen des R.M.V.-Tests entsprach (Enzym von Strcptomyces fradiae, Präparat 2, Kurve 4), und schließlich mit einem Enzym, dao die Bedingungen dos R.M.V.-Tents nicht erfüllte, dr. die Erniedrigung zu stark war (Enzym von Bacillus subtilis, Kurve 5). Die Ergebnisse, die bei Verwendung dieser

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Enzyme im Tierfutter erhalten wurden, werden später "beschrieben (Beispiel 1).

c) Wirkungsweise - indirekte Charakterisierung

Die gelenkte Erniedrigung der Viskosität des Schleims durch gewisse enzymatische Produkte ist darauf zurückzuführen, daß sie eine gelenkte Wirkung auf die Proteine haben, die im Schleim Brücken zwischen den Makormolekülen von Mucinen und Mucopolysacchariden bilden. Diese Produkte bauen die Proteine bis zur Stufe der Polypeptide ab, ohne systematisch bis zur Stufe der Aminosäuren zu gehen.

Diese Feststellung ermöglicht es, indirekt die Produkte zu erkennen, die dem R.M.V.-Test genügen: Dies sind die Produkte, die die Proteine des Schleims sowie gewisse andere Proteine abbauen und hierbei Polypeptide bilden, deren mittlere Größe mit derjenigen der Polypeptide vergleichbar ist, die durch Einwirkung von Trypsin und Chymotrypsin auf die gleichen Proteine erhalten werden.

Die direkte Methode und die indirekte Methode der Erkennun» von Produkten, die im Sinne des R₀M.V.-Testa geeignet sind, haben Ergebnisse, die zwar nicht völlig identisch sind, jedoch weitgehend übereinstimmen,, Diese Produkte können 3omit nach der einen oder der anderen Methode gewählt werden.

25 B. Spezifität dos R.M.V.-Tests

Die Wahl nach dem R.M₀V₀-TeSt ist eine der beiden wesentlichen Voraussetzungen, die die gemäß der Erfindung verwendbaren enzymatischem Produkte erfüllen müssen. Die andere Voraussetzung, auf die später eingegangen wird (Beispiel 1), besteht darin, daß diese Produkte praktisch unempfindlich gegenüber Trypsininhibitoren sind.

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Die enzymatischen Produkte, die dem R.M.V₀-TeSt genügen, stellen bereits eine kleine Minderheit gegenüber der großen Zahl von Produkten dar, die diesem Test nicht genügen, weil sie die Viskosität zu wenig oder zu stark erniedrigen. Die Produkte, die dem R.M.V.-Test genügen und außerdem praktisch unempfindlich' gegenüber Trypsininhibitoren sind, stellen somit eine noch kleinere Minderheit dar.

Die beiden vorstehend genannten Bedingungen können als charakteristisch bezeichnet werden. Wie man später an einem speziellen Beispiel (Beispiel 1) sehen wird, zeigen Versuche, daß die enzymatischen Produkte, die diese beiden Voraussetzungen erfüllen, einen günstigen Einfluß auf das Wachstum der Tiere und ganz allgemein eine eindeutige Wirksamkeit in den Nahrungs- und Futtermitteln, Veterinären, diätetischen und pharmazeutischen Zubereitungen gemäß der Erfindung haben. Umgekehrt haben, wie das gleiche Beispiel zeigt, die Produkte, die diese beiden Voraussetzungen nicht erfüllen, auf das Wachstum der Tiere einen ungünstigen, keinen oder nur einen geringen und unbeständigen Einfluß. Dieser Einfluß liegt in der gleichen Größenordnung wie bei enzymatischen Produkten, die vor der Erfindung bereits als Zusatz zum Tierfutter vorgeschlagen wurden und sich schließlich auf Grund der mäßigen erzielten Ergebnisse nicht auf dem Markt behaupten konnten.

Der große Vorteil einer Auewahl der enzymatischen Fro-• dukte mit Hilfe der vorstehend beschriebenen charakteristischenDoppelvoraussetzung besteht darin, daß nie es ermöglicht, einfach, schnell und zuverlässig die Produkte, die Γίχν den vorgesehenen Zweck geeignet sind, mit einer äußerst großen Erfolgsaunsicht zu erkennen. Diese Vorwahl vermeidet lange und kostspielige Versuche an einer großen Zahl von Tieren, die man häufig durchgeführt hat, aber bisher nur zu Ergebnissen geführt haben, die für die

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Praxis nicht "brauchbar sind.

Die vorstehend beschriebene Wahl der enzymatischem Produkte nach dem R.M.V.-Test unterscheidet sich nicht von der Wahl, die in der britischen Patentanmeldung 9619 vom 21.2.1969 beschrieben ist und darin besteht, daß man das enzymatische Produkt mit sich selbst in zwei verschiedenen Konzentrationen vergleicht. Das befriedigende Produkt muß auf den Schleim des Magendarnkanals eine Wirkung haben, die mit der Steigerung der Konzentration nur wenig steigt. So muß bei einer Konzentration, die das 5-fache der Konzentration beträgt, die in 60 Minuten eine Erniedrigung der Viskosität um ZOjo hervorruft, die Erniedrigung vorzugsweise zwischen 40 und 60?£ liegen. Diese Methode hat den Nachteil, daß bei ihr vorher durch aufeinanderfolgende Annäherungen die Konzentration bestimmt werden muß, die eine Erniedrigung um 20yo bewirkt. Diese Bestimmung ist bei einem solchen V/ert der Viskositätserniedrigung verhältnismäßig ungenau.

Die Methode der tatsächlichen Wahl, die darin besteht, daß man das enzymatische Produkt direkt in vitro mit Trypsin und Chymotrypsin vergleicht, ergibt zuverlässigere Ergebnisse, da es sich um Äquivalente handelte

Für die Herstellung der enzymatischen Produkte gemäß der Erfindung werden zwei Stämme von ^treptomyces fradiae (Ur.1993 und 2019 aus der Sammlung des Museum National d'Histoire Naturelle von Paris) verwendet. Kach klassischen Kultivierungsmethoden züchtet man einen dieser Stämme in einem Kulturmedium für die Großherstellung, das pro Liter die folgende Zusammensetzung hat:

30 g Sojabohnenmehl, 30 g Glucose, 0,8 g Dikaliumphosphat, 10 g CaJ ciumcarbonat, p,. 7,0. Die Kultivierung wird bei ?ü C durchgeführt, v.'obei 0,3 Rnumteile sterile Luft/Räumt ο 11 Kulturrnedi um/l-ij nute zugeführt W'.-lon.

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Unter diesen Bedingungen bildet .Streptomyces fradiae keine Antibiotika, dafür aber wenigstens 5 Proteasen und 2 Peptidasen. Diese verschiedenen Enzyme können nur durch lange Analysenmethoden, die als Houtinebestimnungen unzweckmäßig sind, nachgewiesen werden. Es ist jedoch notwendig, soweit wie möglich die Bildung einiger dieser Enzyme, insbesondere die Bildung der Peptidasen zu vermeiden, die in zu großer Konzentration unerwünscht sind. Das Wesentliche ist jedoch, daß das erhaltene Enzymgemisch dem RI-.IV-Test genügt, der sich schnell durchführen und somit an die Erfordernisse der Großherstellung anpassen läßt. Im allgemeinen genügt dieses Enzymgemisch dem RMV- Test zu Beginn der Fermentation nicht, da die Vicko^itätserniedrigung zu gering ist. In der Lütte des Fermentationsprozesses genügt dieses Genisch dem HF:V-Test, während es an Schluß der Ferment at io'n die Bedingungen des Tests nicht erfüllt, da die Viskositätserniedrigunp; zu rtark ist. Bei Anwendung der oben beschriebenen I.iethode bricht man die Fermentation ab, wenn die Einwirkung des erhaltenen Enzymgenisches auf den ochleim bep;innt, diejenige von Chymotrypsin zu überschreiten, ohne jedoch die des Trypsins zu erreichen. Diese Dauer der Fermentation kann von einer Fabrikation zur anderen in Abhängigkeit von geringen und pra!:- tisch unkontrollierbaren Schwankungen der Bedingungen der Fermentation variieren. Die Dauer liegt jedoch im allgemeinen zwischen 60 und ΡΛ Stunden, und die Gesamtkonzentration des FernentationsmediuLis liegt im allgemeinen bei etwa 3000 AE/ml.

Nach üblichen Isolierungsverfahren, jedoch immer unter der Kontrolle des RI.'V-Tests werden aus diener Gärbrühe die folgenden Produkte gewonnen:

Produkt A: Die filtrierte Kulturbrühe wird unter vorminderten Druck ei ngoengt. Hierbei wird ein flüssigen rohes enzymatischem IVodukt mit weniff-tens 50.000 AE/ml erhalten.

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Produkt 3; Aus dem Produkt A wird durch Zerstäubung ein festes rohes enzymatisches Produkt mit wenigstens 100 AE/mg erhalten.

Produkt G: Aus dem Produkt A wird durch Fällung mit Ammoniumsulfat und Trocknung unter vermindertem Druck ein teilweise gereinigtes enzymaticches Produkt mit wenigstens 1000 AE/mg erhalten.

Produkt D; Aus den Produkt A wird durch eine Reihe von Fällungen mit Ammoniumsulfat und Lösungsmitteln, insbesondere Aceton, anschließende erneute Auflösung und Trocknung der endgültigen Fällung unter vermindertem Druck ein fast gereinigtes enzymatisches Produkt erhalten, das wenigstens 10.000 AE/mg enthält und eine relative elektrophoretische tlonodispersion der enzymatischem Aktivität aufweist.

Produkt E; Aus dem Produkt D wird durch Elektrophorese in der Flüssigphase oder durch Säulenchromatographie, Dialyse und Lyophilisierung das Enzym überwiegend in hochgereinigter Form abgetrennt. Es enthält wenigstens 50.000 AE/mg und weist eine absolute elektrophor eti sehe I.Ionodispersion

20 der enzymatisehen Aktivität auf.

Alle diese Produkte erfüllen durch Definition den KLIV-Test. Um gemäß der Erfindung verwendbar zu sein, müssen sie noch praktisch unempfindlich gegenüber Trypsininhibitoren sein. Hierauf wird nachstehend eingegangen (Beispiel 1). Die Versuche zeigen, daß dies bei den vorstehend genannten Produkten eindeutig der Fall ist. Diese Produkte stellen somit eine besondere Gruppe von enzymatisehen Produkten dar, die gemäß der Erfindung verwendbar sind. Andere spezielle Gruppen von onzymatischen Produkten, die nach dem IiMV-Test gemäß der Erfindung verwendbar sind, können aus anderen Stämmen von f/treptomyces oder aus Mikroorganismen anderer Gattungen, insbesondere aus I.ükroorganir.mon der Gattung Bacillus, gewonnen werden.

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Die vorstehend genannten Produkte A₁ B oder C eignen sich für die Herstellung von Mischfutter für Tiere, das genäß den folgenden Beispielen zusammengestellt werden kann.

A. Versuche an Ratten
Beispiel 1; Fütterung von Ratten mit HcCollum-Futter

Dieses Futter hat die folgende Zusammensetzung: 60/5 Zucker, 12% Getreidemehl, 18# Kasein, 3# Hefe, 3?» Talg, 4% McCoI-lum-Salze.

Weiße Ratten, die ein Alter von 5 V/ochen haben und etwa 40 g wiegen, werden in Gruppen von je 5 männlichen oder 5 weiblichen Tieren auf KrIfige aufgeteilt. 3ie erhalten das Futter und Trinkwasser nach Belieben. Sie v/erden im Verlauf von 3 V/ochen einzeln zweimal pro Woche gewogen. Die durchschnittliche tägliche Gewichtszunahme wird an Gruppen von 10 Tieren (5 männliche und ^r> weibliche) ermittelt.

Die Vergleichsgruppe erhält das McCollura-Futter. Die Versuchsgruppen erhalten das gleiche Futter mit Enzymzusatz, entweder in einer Dosis von 100 AE/g oder in einer Dosis von 1000 AE/g. Unter dor Annahme, daß eine wachsende Ratte fc täglich eine Puttermengo vorbraucht, die 1/10 ihres Gewichte entspricht (10 g Putter/Tag pro Ratte von 100 g), entsprechen diese Dosen 10.000 bzw. 100.000 AE/kg Lebendgewicht pro Tag.

Die Enzyme, deren Wirkung auf den Schleim in Fig. 1 dargestellt ist, werden verwendet. Außer dem Enzym .3.F. Präparat 2 (S.F. = Streptomyces fradiao), das die Viskosität des '.IchIeims um 50Γ* erniedrigt, werden die Enzyme fJ.F. Präparat 1 und £3.F. Präparat 3 verwendet, die die Vißkositat des Schleims um 40;a bzw. 60"» erniedrigen. Diese drei Präparate erfüllen die Bedingungen des RMV-Testß im weiten Sinne, da sie eine Erniedrigung der Viskosität zwischen 35 und GS;o bewirken, aber nur das Präparat 2 erfüllt die Bedingungen des RI.lV-Ter.ts im normalerweise bevorzugten

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engen Sinne. Diese drei Präparate entsprechen dem oben beschriebenen Produkt C und enthalten etwa 2000 AE/mg. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengestellt.
Tabelle I

Einfluß der Enzyme auf die Erniedrigung der Viskosität des Schleims (gemäß dem RLIV-Test) und auf das V/achstum

von Ratten

Enzym »Senkung Ohne __ Gev.dchtszunähme der Retten der Enzym I,:£T lOO'AIi/g MiFTöGO AE/g"

Viskosität g/Tag Putter Futter

7^"ä?·; ;Γ g/Tag " /j

	O
	30
Papain
SF Prä	40
parat 1
SF Prä	50
parat 2
SP Prä	60
parat 3	80
B.S.

2,85

2,85 100 2,85 100

3,45 121 3,4-0 119

4,15 14-5 4-,05 142

parat 3 60 3,25 114 2,95 103

3,00 105 2,40 84

SF: Enzym von Streptomyces fradiae B.S.: Enzym von Bacillus subtilis

Das Enzym SF Präparat 2, dessen Wirkung auf den Schleim genau zwischen derjenigen von Trypsin und derjenigen von Chymotrypsin liegt (r^rniedrigung der Viskosität um 50;ό), bewirkt eine Steigerung der V; achstums geschwindigkeit der Hatten zwischen 40 und 45>o für die beiden verwendeten Dosen.

Bei dem Enzym SF Präparat 1, dessen '.Virkung auf den Schleim mit derjenigen von Chymotrypsin vergleichbar ist (Erniedrigung der Viskosität 40,0, ist diese Steigerung geringer, jedoch liegt sie bei etwa 20',ί für die beiden verwendeten Dosen.

Bei dem Enzym SF l^räparat 3, dessen Wirkung auf den Schleim mit derjenigen von Trypsin vergleichbar ist (Erniedrirung der '■■■'skosität 60.Ό), beträgt diese Steigerung noch 147$ bei · niedrigen Dosis, sinkt jedoch fast auf 0 bei der

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SAD CRlGlNAU

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hohen Do«is.

Die Enzympräparate von Ctreptomyces fradiae, die in unterschiedlicher Weise dem HMV-Test genügen, haben somit einen unterschiedlichen günstigen Einfluß auf das Wachstum der Ratten. ^rilenn ferner Γ/breptonyces fradiae kultiviert wird, ohne nach dem Verfahren gemäß der Erfindung zu arbeiten, v/erden im allgemeinen Enzympräparate erhalten, die die Bedingungen des RKV-Tests nicht erfüllen, da sie eine zu starke Erniedrigung der Viskosität bewirken, und die einen deutlich ungünstigen Einfluß auf das ./achstum der Ratten haben.

Papain, das nicht die Bedingungen des RtIV-Tests erfüllt, da die Viskositätserniedrigung zu gering ist, hat keinen Einfluß auf das V/achstum der Ratten.

Sin Enzym von Bacillus subtilis, das dem HIiV-Te st nicht genügt, da die Viskositätserniedrirung zu stark ist, hat in schwacher Dosis einen geringen günstigen Einfluß auf das V/achc·turn der Rotten, aber dieser Einfluß ist unbeständig. Bei starker Dosierung wird der Einfluß offensichtlich ungünstig. Bei der Autopsie Find an der V/and des !.!agendarmkanals der Rotten, die diese hohe Dosis erhalten haben, mit den bloßen Auge deutliche Anzeichen einer Hypersekretion des Schleims erkennbar, die genügt, um die beobachtete Verlangsanung des Wachstums zu erklären.

Trypsin und Chymotrypsin bewirken eine geringe und unbeständige steigerung der '.Vachstumsger.chwindigkeit der Ratten. Diese Steigerung bleibt in jedem Fall unter 10,·^. Diese Ponkreasonzyme, die in vitro auf den Schleim eine Wirkung haben, die mit derjenigen der Präparate 1,2 und 3 der „„ „ .gleicjibar ist. ^ . . ,„.

SF-Enzyme ver-/ , zeigen somit in vivo eine wesentlich geringere Wirkung auf das V/achstum der Ratten. Diese Anomalie kann dadurch erklrrt v/erden, daß das Trypsin und Chymotrypsin in t'bersclmß in vivo durch endogene Trypsininhibitoren, z.B. den Kunitzschen Pankreas-Inhibitor, blockiert werden können. Dagegen ist dan Enzym, das in den von

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Streptomyces fradiae erhaltenen Präparaten 1, 2 und 3 überwiegt, gegenüber dienen Inhibitor praktisch unempfindlich. Ebenso ist es praktisch unempfindlich gegenüber exogenen Inhibitoren, z.B. gegenüber dem Soja-Inhibitor.

Beispiel 2: Fütterung von Hatten mit einem an öojaproteinen reichen Putter

Dieses Futter, das normalerweise für die Hähnchenzucht verwendet wird, hat die folgende Zusammensetzung: 6O^:/o I.Iaismehl, 53;j ßojabohnenmehl, y/o Talg, 4# Mineral- und Vitaminpräparat. Der Versuch wird an Gruppen von -je 10 männlichen Ratten unter den gleichen allgemeinen Bedingungen wie bei dem in Beispiel 1 beschriebenen Versuch durchgeführt. Die Vergleichsgruppe hat eine mittlere Gewichtszunehme von 5,25 g/Tag.

Die Versuchsgruppe 1, die das gleiche Futter mit Zusatz des SF-Enzympräparats 2 in einer Dosis von 1000 AE/g erhält (entsprechend etwa 100.000 AE/kg Lebensgev/icht/Tag), hat die gleiche durchschnittliche tägliche Gewichtszunahme.

Die Versuchsgruppe 2, die das gleiche Futter, aber ein Trinkwasser erhält, in dem das SF-Enzympräparat 2 in einer Dosis von 500 AE/nl gelöst ist (entsprechend ebenfalls etwa 100.000 AE/kg Lebendgewicht/Tag), hat eine durchschnittliche Gewichtszunahme von 7,3 g/Tag, d.h. eine um 397'» gesteigerte Gewichtszunahme.

Der bei der Versuchsgruppe 1 festgestellte Mißerfolg ist nicht auf die Anwesenheit des Northrop-Trypsininhibitors im Sojabohnenmehl zurückzuführen, da dieserInhibitor durch die Wärmebehandlung, die normalerweise vom Lieferanten dieses Ausgangsmaterials vorgenommen wird, zerstört worden war. Der Wißerfolg ist vielmehr darauf zurückzuführen, daß das Enzym eine besondere Affinität zu den ^ojaproteinen zu haben scheint, die, wenn sie dem Futter in hoher Konzentration zugesetzt werden, das gesamte Enzym an sich binden können. Dadurch kann dieses Enzym nicht mehr auf dio Pro-

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teine des Schleiras einwirken, dessen Viskosität nicht mehr erniedrigt wird. V/enn Jedoch das Enzym dem Trinkwasser und nicht den Futter zugesetzt wird, v/ird dieser Abbau der Proteine teilweise vermieden. Dies ist der Grund für den Erfolg, der bei der Versuchsgruppe 2 erzielt wurde. Es ist somit im allgemeinen zv/eckraäßig, das Enzym dem Trinkwasser zuzusetzen. Versuche haben außerdem gezeigt, daß die Stabilität des Enzyms in Lösung genügt, um diese Verabfolgung in Großzüchtereien vornehmen zu können.

Beispiel 3« Versuche an isolierten Darmschlinpen Diese Versuche haben den Zweck, die Steigerung der Geschwindigkeit der Resorption der Nahrungsstoffe durch die Darmwand direkt nachzuweisen.

Die Versuche wurden mit 5 Ratten durchgeführt, die seit 24 Stunden kein Futter erhalten haben, etwa 150 g wiegen und mit Urethan anästhesiert sind. Nach der öffnung der Bauchhöhle werden etwa 10 cm Ileum isoliert. Jedes Ende ist durch eine Sonde von außen zugänglich. f.! an wäscht dns Ileura und führt dann 0,4 ml einer Lösung von Kaseinhydrolysat ein, die 2,5 mg Stickstoff enthält, i'an läßt die Lösung 10 Minuten im Ileum, entnimmt sie dann und führt eine Spüllösung ein, die ebenfalls entnommen wird. Der restliche Stickstoff in diesen beiden Lösungen wird bestimmt. Der gleiche Versuch wird an der gleichen Hatte wiederholt, wobei jedoch vorher 0,05 ml einT Lösung eingeführt werden, die 0,5 mg/ml Enzyme des SF-Präparats 2, d.h. etwa 50 AE enthält.

Es v/ird festgestellt, daß die resorbierte Stickstoffmenge bei den Vergleichsverruchen ohne Enzym von einem Tier zum JO anderen stark schwankt und im Durchschnitt 5/« beträgt. Bei den mit Knzym durchgeführten Versuchen schwankt die resorbierte Stickstoffmenge woniger und iut viel höher, nämlich durchsclinittlich 17·^.

Nach der gleichen Methode kann die Geschwindigkeit der Resorption anderer Nahrungsstoffe und ihre mögliche Stoi-ί ^- 009837/1912

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gerung unter dem Einfluß des Enzyms untersucht werden. Es ist festzustellen, daß diese Steigerung im allgemeinen bei den Proteiden größer ist als bei Gluciden oder Lipiden. Die Steigerung der Y/achstums geschwindigkeit durch das Enzym muß somit mehr zugunsten des I'uskelgewebes des Tieres als zugunsten seiner Keservestoffe erfolgen. Es kann somit gesagt werden, daß das Y/achstum des Tieres nicht nur in der Quantität, sondern auch in der Qualität verbessert wird.

Nach der gleichen Methode kann auch die Geschwindigkeit der Resorption von Medikamenten untersucht werden, deren Durchgang durch die Wand des l.'agendarnkanals von einem spezifischen Träger abhängig oder unabhängig sein kann. Es ist festztisteilen, daß diese Resorptionsgeschwindigkeit im allgemeinen'durch das Enzym gesteigert wird, ,iedoch je nach dem Medikament in unterschiedlicher V/eise.

B. Versuche r.iit Hähnchen

Beispiel 4: Tiähnchenzucht auf den Erdboden Hähnchen vom Gtamm Arbor-Acres werden zunächst gemeinsam gezüchtet und erhalten das gleiche Starterfutter. Im Alter von 12 Tagen v/erden sie in vier Gruppen zu je 25 Tieren aufgeteilt, die das gleiche mittlere Gewicht (124· g) und die gleiche Standardabweichung (3,23) haben.

Die Vergleichs^ruppe 1 erhält ein Futter auf Basis von I.'aip und Soja mit geringer Proteinkonzentration (16"S) · Am Schluß des Versuchs im Alter von 5'°' Tagen, d.h. nach einer Versuchsdauer von 46 Tagen, beträgt das mittlere Gewicht .1430 g und der Verbrauchsindex (Verhältnis des Gewichts de3 verbrauchten Futtere zum Gewicht der Tiere) 2,30.

JO Die Versuchfjgi'uppe 1 erhält das gleiche Futter, ,jedoch mit einen Zusatz von 4 g/kg des oben beschriebenen Produkts B mit 100 AE/mp;. Die Enzyme! ο sis betrügt no mit 400 AE/kg entsprechend etv/a 40.000 AE/kg Lebendgewicht pro Tag. An Schluß de."3 Versuchs beträgt das mittlere Gewicht 1553

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(+ 8"0 und der Verbrauchsindex 2,1 S (- ψ/ο}.

Die Vergleichsgruppe 2 erhält ein Futter auf Basis von Ivlais und Soja mit normaler Proteinkonzentration (22.¹S). Am Schluß des Versuchs beträft das mittlere Gewicht 1676 g und der Verbrauchsindex 2,09.

Die Versuchsgruppe 2 erhält das gleiche Futter ebenfalls mit einen Zusatz von 4-00 A2/kg Futter. Am Schluß des Versuchs beträgt das mittlere Gewicht 1772 g (+ 6.'S) und der Verbrauch sind ex 1,93 (- 5''S) .

Beispiel 5; Hähnchenzucht in der Battorie Der Verr.uch wird nit zwei Gruppen von etwa GOOO Hähnchen vom Stamm Vauguard-Garrison durchgeführt, die in der Batterie aiif gebogen werden. Die Vergleichsgruppe erhält in Form von lV!ehl ein handelsübliches Futter auf Basis von Soja und T'ais, das It. Analyse 21 "S Proteine und 5?S Lipide enthält. Für dieses Futter wird ein Fonicillin-Prokain-Gehalt von 8 mg/kg und ein Tetracyolingehalt von 25 mg/kg garantiert. Die Versuchsgruppe erhält das gleiche Futter mit Zusatz von A-OO mg/kg dos oben renannten Produkts G, das 2000 Ali/mg enthält. Die -inzyradocin betrügt somit 800 AE/kg Futter entnprecliond etwa 80.000 AJ^/kg Lebendgewicht pro Tag.

Am 30. Tag des Versuchs haben die MHinchen anscheinend die gleiche Entwicklung in beiden Gruppen, aber jedes Ilähneben hat im Durchschnitt 10'iO g Futter in der Vergleichs— gruppe und nur 90Γ> G Futter in der Ver.suchsgruppe verbrauclit. Dies entspricht ,einor Fütt;oreinsparung von etwa 16;S.

Vom 40. Tage an entwickelt sich in der gesamten Zucht eine Epidemie, der die Versuchsgruppe viel besser widersteht, l.'ach oO T.i;',on bel;r;i_fi-t dio I.ortalitilt in der Vergleiclu·.- ^ry;'> und in der Ver.'-.aohngruiipo nur 1,6Γό».

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Das mittlere Gewicht beträgt 134-6 6 bzw, 1319 g· Dieses etwas niedrigere Gewicht bei der Versuchsgruppe erklärt sich dadurch, daß in dieser Gruppe die Tiere von schwacher Konstitution überlebten, während sie ohne den Enzyrnzusatz wahrscheinlich eingegangen wären.

Der Verbrauchßindex beträgt 2,8 bzw. 2,63. Hieraus ergibt sich eine Futtereinsparung von 6,5/3 bei der Versuchsgruppe. Eine einfache Rechnung zeigt, daß der Gewinn pro 1000 Hähnchen ohne Berücksichtigung der Kosten des Enzyms 6A- Franc bzw. 266 Franc beträgt.

Kontrollversuch: Zu Beginn des Hauptversuchs werden aua • jeder Gruppe 25 Hähnchen entnommen und auf dem Erdboden in einem getrennten Raum aufgezogen, wo die hygienischen Bedingungen bes/rer sind. Die Mortalität bei diesen Gruppen ist Null. Das mittlere Gewicht beträgt 1603 6 bei der Vergleichsgruppe und 174-6 g (+ 9/0 bei der Versuchsgruppe. Der Verbrauchsindex beträgt 2,68 bzw. 2,4-1 (- 10,"0·

Beispiel 6: 'wiederholung des in Beispiel 5 beschriebenen Versuchs

Während der in Beispiel 5 beschriebene Versuch im Hochsommer während einer Hitzewelle durchgeführt wurde, unter der die Tiere offensichtlich litten, wurde der hier beschriebene Versuch im Herbst unter normalen klimatischen Bedingungen durchgeführt. Nach 60 Tagen beträgt die Mortalität bei der Verp-leichsgruppe 7»9?j und bei der Versuchngruppe 4,8#. Das mittlere Gewicht beträgt 1338 g bzw. 1356 ß. Der Verbrauchsindex beträgt 2,73 bzw. 2,38 entsprechend einer Futtereinnparung von 12,4-/J bei der Versuchsgruppe.

Eine einfache Y/irtschaftlichkeitsberechnung ergibt, daß der Gewinn pro 1000 Hähnchen ohne Berücksichtigung der Kosten deß Enzyms bei der Vergleichsßruppe 77 Franc und bei der Versuchsgruppe 4-69 Franc beträgt.

Die Verßuche mit Hähnchen wurden durchßeführt, bevor die Gefahr der Bindung deß Enzyme durch die Sojaproteine ver-

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SAD OFUQlNAi.

mutet und durch Zusatz des Enzyms zum Trinkwasser wie in Beispiel 2 ausgeschaltet wurde. Kit Hähnchen können v/eit bessere Ergebnisse, insbesondere Steigerungen der Y/achstumsgeschwindigkeit, die mit den in Beispiel 2 beobachteten (+ 39/0 erzielt werden, wenn das Enzym dem Trinkwasser und nicht dem Futter zugesetzt wird.

C. Versuche an Kälbern

In diesem besonderen Fall kann ein enzymatisches Produkt gemäß der Erfindung außer seiner Hauptwirkung auf den Schiein des Hagendarmkanals auch eine nicht unbeachtliche Wirkung auf das Futter selbst ausüben. Zwischen dem Augenblick, in dem die aus Milchpulver hergestellte LIiIch auf 37 C gebracht wird und dem Augenblick, in dem sie von den Kälbern getrunken wird, vergeht häufig etwa 1/2 Stunde.

Wehrend dieser'Zeit werden im flüssigen Kedium bei 37°C die Proteine der Milch durch das enzymatisch^ Produkt teilweise abgebaut. Dies trägt in einem gewissen LTaße zur Gesamtverbesserung des Wachstums der Kälber bei. Die Beispiele 5 und 6 zeigen, daß bei der Großzucht die l.Iortalitat bei den Versuchstieren deutlich gesenkt wird. Diese Feststellung läßt verschiedene Erklärungen zu. Ss i?t insbesondere bekannt, daß die pathogenen Mikroorganismen zuv/eilen reichlich in der Schicht des tiefen Schleims vorkommen, und daß die Kokzidien oder andere Parasiten nuweilen zur I3ildung von intestinalen Krypten beitragen, in denen sie sich ansiedeln. Wenn diese Mikroorganismen, diese Kokzidien oder diese Parasiten in einem su viskosen Schleim eingehüllt sind, können sie sich der Einwirkung von Antibiotika, Kokzidiof:emitteln oder antiparasitären Mitteln entziehen, die normalerweise dem Futter zugesetzt v/erden. Die Enzyme, die eine gelenkte Erniedrigung der Viskosität des Schleims im Magendarmkanal zu bewirken vermögen, können somit eine aktivierende V/irkung auf die Antibiotika, die Kokzidiosemittel und die ontiparuiü t '. von Mittel haben. Dies kann teilweise die verringerte 'ortalität erklären, die bei den Versuchsgruppen beobachtet wurde.

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Die 'enzyraatisehen Produkte geraäß der Erfindung ermöglichen ■ somit eine Verringerung der Dosis an Antibiotika, Kqkzir-

diosemittein und antiparasitäreii Mitteln, die normaler-... v/eise.;dem Mischfutter für Tiere zugesetzt werden, ohne daß der Schutz, den diese drei Arten von Produkte!} gewäh-v ren, abgeschwäeht wird, ■ . -.. . .

Andererseits ermöglichen die enzymatisehen Produkte gemäß = der Erfindung eine Steigerung der Geschwindigkeit der Resorption gewisser· Veterinärmedikainen,te durch, die Viand .. des Magendarmkanals, Dies kann nach der in Beispiel 3 . beschriebenen Methode nachgewiesen werden..-Die ,Produkte eignen sich somit für die Herstellung von. verschiedenen tierärztlichen Px'äparaten.

Die Futtermittel für die Tiere enthalten in Verbindung mit einem physiologisch unbedenklichen Hilfsstoff wenigstens eines "der Produkte A-, B odb_ 0. Sie werden in einer Dosis von 1000 bis 20.000 AE/kg Körpergewicht pro Tag verabfolgt, ■ Als Hilfsstoffe oder Trägerstoffe eignen sich Feststoffe wie Lactose oder Lösungsmittel oder auch TJmhülluncen, die ^;; die enzymatisehen Produkte vor ihi^er Verwendung schützen.

Die tierärztlichen Präparate, die auf den Ccjaledm des Darri-... kanals einv/irken,- ^m die Resorption der-I_;Iedikamente zu ,erleichtern", enthalten v/enigstens eines der Produkte A, B oder¹-,.G und vierden in einer Dosis von 5000 bis 200.000 AE/ ,25 ....-" Körpergewicht pro Tag verabreicht. Die orale Verabreichung ist in· beeiden'Fällen die einfachste und zweckmäßigste.

Die Ergebnisse, die vorstehend für Tierversuche beschrieben wurden, sind auf den 1.1 enscheη übertragbar. Zur Erzielung der gewünschten Wirkung in voller Sicherheit wird an JO Stelle "eines rohen oder teilweise gereinigten enzymatischeh Produkts ein fact gereinigtes Produkt,' z.B. das Produkt- "D" verwendet. Auf diese V/ei se Werden diate.tiEche "und pharmaseütiüche Zubereitungen erhalten,, die auf den Intestinalschloim einv/irken. Die diätetischen Zubereitungen

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enthalten wenigstens eines der Produkte D und Ξ und v/erden in einer Dosis von 1000 bis'20.000 AE/kg Körpergewicht pro Tag verabreicht.

Die pharmazeutischen Zubereitungen, die auf den Schleim des Darmkanals zur Verbesserung des Anabolismus oder zur Steigerung der Wirksamkeit von Medikamenten einwirken, enthalten wenigstens eines der Produkte D und E und v/erden in einer Dosis von 5000 bis 200.000 ΑΞ/kg Körpergewicht pro Tag verabreicht.

Ebenso wie der Schleim des Darmkanals verdankt der Bronchialschleim seine Viskosität teilweise der Anwesenheit von Makromolekülen von Mucinen, die untereinander durch Proteinbrücken verbunden sind. Das Prinzip einer gelenkten Einwirkung auf die Viskosität des Schleims durch gelenkte Einwirkung auf die Proteine dieses Schleimes ist somit ebenfalls anwendbar. Auf Grund dieser Tatsache wurden bereits Trypsin und Chymotrypsin für die 3ronchialtherapie vorgeschlagen, aber ihre Verwendung ist aus verschiedenen Gründen, insbesondere durch die Anwesenheit von Trypsininhibitoren und außerdem von verschiedenen Kunitz-Inhibitoren im Bronchialachleim begrenzt.

Dagegen haben Versuche gezeigt, daß diese Inhibitoren keine Einwirkung auf die enzymatisehen Produkte haben, die zu der oben beschriebenen speziellen Gruppe gehören. Diese Produkte können somit verwendet werden, um die Viskosität des Bronchialschleims mäßig zu erniedrigen, wodurch der Ausstoß des überschüssigen Schleimes und die Wirkung von Antibiotika erleichtert v/erden.

Da die Bronchialschleimhaut schwächer und weniger ausge-30' dehnt ist als die Schleimhaut des Darmkanals, sind diese Produkte, die als Aerosol oder in einer anderen geeigneten. Darreichungsform gegeben werden können, vorzugsweise stark gereinigte Produkte, z.B. das Produkt D bei Tieren und die Produkte D oder E beim Menschen. Hierbei werden sie in

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verhältnismäßig, geringen Dosen gegeben, die im allgemeinen zwischen 500 und 50.000 AE/kg Körpergewicht pro Tag liegen.

Ebenso wie der Schleim des Darmkanals verdankt d'er Zervix-Schieim seine Viskosität teilweise besonders großen Makro- · molekülen, die untereinander durch Proteinbrücken verbunden sind. Das Prinzip einer gelenkten V/irkung auf die Viskosität des Schleimes durch gelenkte Einwirkung auf·die Proteine dieses Schleimes ist somit ebenfalls anwendbar.

Die gelenkte Einwirkung auf die Yiskosität des Zervix-■ Schleimes erscheint eindeutig erwünscht bei" der künstlichen Besamung von Rindern, die z.Z. in voller Entwicklung ist. Die Erfo3gso[uote bei der ersten Besamung liegt im Durchschnitt nur bei 65/£. Dies läßt sich teilweise dadurch erklären, daß ein zu viskoser Zervix-Schleim zuweilen die Bildung eines wahren Zervix-Stopfens verursacht, der den ' . Uterushals versperrt und die Fortbewegung der Spermien verhindert. . '

Es ist jetzt .erkannt worden^ daß der-.Erfolg-einer Insemination teilv/eise bedingt ist durch das!Vorhandensein einer genügenden Trypsinaktivitat -im Samen,die gewährleistet, daß die Spermatozoen befruchtungsfähig werden. Es ist allgemein bekannt, daß der Zervix-Schleim gewisse Trypsininhibitoren enthalten kann. ■ -

■ ' .Die enzymatisehen Produkte^ die zu der oben 'beschriebenen ' besOnderen Gruppe gehören, eine Aktivität sröm'iTrypsintyp ^v; haben und im allgemeinen unempfindlich, gegenüber Trypsininhibitoren sind, können"-somit eine gelenkte· Erniedrigung dej? Viskosität des Zervtx-Schleimes hervorrufen und dazu beitragen, daß die Spermatozoen befruchtungsfähig werden. Sie können auf diese -.Welse die Behandlung von Krankheiten der Genitalwege erleichtern und die Erfolgsqüote bei, der ersten künstlichen Insemination sowie auch bei der natürlichen Insemination steigern. ..

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Da die Vaginal- und Uterusschleimhäufce empfindlicher und schwächer und weniger groß sind als die Schleimhaut des Darmkanals, werden als enzymatische Produkte, die der Vorbereitung der Eier dienen, vorzugsweise hochreine Produkte verwendet, z.3. das Produkt D für Tiere und die Produkte D oder E für den Menschen. Diese Produkte v/erden in verhältnismäßig geringen Dosen (im allgemeinen zwischen 5OO und 5Ο.ΌΟΟ AE/kg Gewicht pro Tag) verwendet.

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ti,; ■ . ■

Tabelle II ' . /' ·

Zu verabfolgende Tagesdosis und Mindestkonzentration des enzymatischen Produkts^;in AbhängigkeitΓ

... - , . von den Anwendungen . ■ ' ' ;, ■''.·''' '■'

Mindestkonzentration des Produkts

Zu verabreichende Tagesdosis

T ι· e r e ■K e ns c h

V7irkunp;sort

Intestinal- Bronchial-·Zervix- Putter schiein schleim Schleim

y/irkunrjSQrt' ' _____ :$iäte«

lntestinal- Bronchial--' Zervix-· tisch schleim schleim Schleim _; '

50.000 AE/ml* iOO AE/mg 1000 AE/mg

5OOO bis 200.000 AE/

kg Körpergewicht bis
20.000 AE/
kg Körpergewicht

^ 10.000 AE/mg

50.000 AE/mg

* AE = Ansom-Einheiten

500 bis 5OO bis ' 5O.OOO AE/ 50.000 AE/ kg Körper- kg Körpergewicht gewicht

5000 bis 500 bis 500 bis 1000 bis 200.000 50.000" 50.000 20.000 AE/kg AE/kg AE/kg AE/kg Körper- Körper— Körper- Körpergewicht gewicht gewicht gewicht

K) CD O

Claims

- 28 Patentansprüche

1) Proteolytische enzymatische Produkte, die dazu dienen, dem Schleim des Darmkanals, dem Bronchialschleim und dem Zervixschleim in vivo eine optimale Viskosität zu verleihen, dadurch gekennzeichnet, daß einerseits in vitro bei 37°C die Erniedrigung der Viskosität von 1 g Intestinalschleim, der mit 0,1 ml einer auf p_H 7,5 gepufferten Lösung von 250 Ansom-Einheiten dieser enzymatischen Produkte behandelt worden ist, unter sonst gleichen Bedingungen zwischen der Viskositätserniedrigung durch 250 Ansom-Einheiten von reinem Trypsin + 5 % als Maximum und der Viskositätsverminderung durch 250 Ansom-Einheiten von reinem Chyntbrypsin - 5 % als Minimum liegt, wobei die Erniedrigung der Viskosität als Prozentsatz der Viskosität des unbehandelten Schleimes ausgedrückt ist und für den Schleim des Schweins und des Kalbes 60 % für Trypsin und 40 % für Chymotrypsin nach halbstündigem enzymatischem Abbau beträgt, und andererseits die enzymatischen Produkte unempfindlich gegenüber Trypsin-Inhibitoren sind.

2) Enzymatische Produkte nach Anspruch 1, dadurch gekenn-

zeichnet, daß in vitro die auf die enzymatischen Produkte zurückzuführende Erniedrigung der Viskosität des Intestinalschleimes genau zwischen derjenigen des Trypslns und derjenigen des Chymdrypsins liegt.

5) Enzymatische Produkte nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie durch Kultivierung von Mikroorganismen, die Proteasen bilden, und anschließende Isolierung erhalten werden.

4) Enzymatische Produkte naoh Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie von Streptomyces erhalten werden.

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5) Enzymatisehe Produkte nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie von Streptomyces fradiae erhalten werden. . . " "

6) Enzymatische Produkte nach Anspruch; 5, dadurch gekennzeichnet, daß sie von den Stämmen Streptomyces fradiae Nr.1998 und 2019 der Sammlung des Museum National d'Histoire Naturelle, Paris, erhalten werden.

7) Enzymatische Produkte nach Anspruch 4 Ms 6, erhalten - in fester .oder flüssiger Form durch Isolierung aus

der Kult.ivierungsbrühe. I

8) Enzymatische Produkte nach Anspruch 7, enthaltend wenigstens 50000 Ansom-Einheiten/ml.

9) Enzymatische Produkte nach Anspruch 7, enthaltend wenigstens 100 Ansom-Einheiten/mg.

10") Enzymatische Produkte nach Anspruch 7₉ enthaltend wenigstens 1000 Ansom-Einheiten/mg. ■

)Enzyrnatische Produkte nach Anspruch 7» enthaltend wenigstens 10000 Ansom-Einheiten/mg.

12)Enzymatische Produkte nach Anspruch 7, dadurch gekenn.- " zeichnet, daß sie wenigstens 50.000 Ansom-Einheiten/mg enthalten und bei der Elektrophorese eine absolute Monodispersion aufweisen.

/J13Vverfahren zur Herstellung von proteolytischen enzy- -S.matischeh Produkten, die in vivo dem Schleim des Darmkanals,* dem Bronchialschleim und dem Zervixschleira die optimale Viskosität verleihen, aus einem Mikroorganismus, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kultivierung des Mikroorganismus abbricht, sobald die Erniedrigung der Viskosität von 1 g Iriteätirialschleim bei 37⁰C in vitro durch 0,1 ml einer £ös"ung von 250 Ansom-Einheiten der gebildeten enzymatischeη Pro-

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dukte unter sonst gleichen Bedingungen zwischen der durch 250 Ansom-Einheiten von reinem Trypsin hervorgerufenen Viskositätserniedrigung plus 5$ als Maximum und der durch 250 Einheiten von reinem Chymotrypsin hervorgerufenen Viskositätserniedrigung minus 5$ als Minimum liegt, wobei die Erniedrigung der Viskosität als Prozentsatz der Viskosität des unbehandelten Schleimes des Schweins oder des Kalbes nach halb-

;. stündigem enzymatischem Abbau 60°/o für Trypsin und

40$ für Chymotrypsin beträgt, der gewählte Stamm

W ferner Produkte bilden muß, die gegenüber Trypsin-

Inhibitoren unempfindlich sind, und diese enzymatischen Produkte sich reinigen lassen.

14) Verfahren^nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung des die Produkte bildenden Stammes abgebrochen wird, sobald die Erniedrigung der Viskosität des Schleims des Darmkanals genau zwischen den Werten der Viskositätserniedrigung durch Trypsin (60$) und der Viskositätserniedrigung durch Chymotrypsin (40$) liegt«

15) Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß der die enzymatischen Produkte bildende Stamm aus der Gattung Streptomyces ausgewählt wird,

16) Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß als Stamm, der die enzymatischen Produkte bildet,

Streptomyces fradiae verwendet wird«

17) Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Stämme Streptomyces fradiae Nr.1998 und 2019 der Sammlung des Museum National d'Histoire Naturelle, Paria, verwendet werden.

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18) Verfahren nach; Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm "bei 28⁰C in einem Nährmedium kultiviert wird, das pro Liter 30 g Sojabohnenmeh-i, 30 g Glucose, 0,8 g Dinatriumphosphat und 10 g Calciümcarbonat enthält und einen p„-Wert von 7,0 hat, eine Belüf- · tung mit 0,3 Raumteilen steriler Luft pro Raumteil des Nährmediums pro Minute vorgenommen wird, die Bauer der Fermentation 60. bis 84 Stunden beträgt und. die Endkonzentration der Kulturbrühe etwa 3000 Ansom-Einheiten/nil beträgt.

19) Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die filtrierte Kulturbrühe unter vermindertem Druck eingeengt wird, bis sie eine Konzentration von wenigstens 50 000 Änsorn-Einheiten/ml hat.

20) Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß durch Zerstäubung der eingeengten Kültürbrühe ein Feststoff gebildet wird, der wenigstens 100 Ansom*- Einheiten/mg enthält. ' · ■

21) Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß durch Fällung mit Ammoniumsulfafc und Trocknung der eingeengten Kulturbrühe unter vermindertem Druck " ein Feststoff mit wenigstens 1000 Ansom-Einheiten/mg gebildet wird.

22) Verfahren nach Anspruch 19/ dadurch gekennzeichnet, daß durch eine Reihe vott Fällungen mit Ammoniumsulfat und Aceton, anschließende erneute Auflösung und Trocknung unter vermindertem Druck ein Feststoff gebildet wird, der Wenigstens 10 000 Ansom-Einheiten/mg -enthält. -.■■■-*

23) Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß man das gemäß Anspruch 22 erhaltene Produkt der Elektrophorese in der Flüssigphase oder der Säulenchromatographie unterwirft und hierbei ein !Produkt * * · ^; 0 09837/1912

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mg

bildet, das wenigstens 50 000 Ansom-Einheiten/enthält,

24) Nahrungs- und Futtermittel, veterinärmedizinische, diätetische oder pharmazeutische Zubereitungen, da-.durch gekennzeichnet, daß sie in Verbindung mit einem' physiologisch unbedenklichen Träger wenigstens eines der enzymatischen Produkte gemäß Anspruch 1 bis 12 enthalten.

25) Futtermittel für Tiere nach Anspruch 24^ zur qualitativen und quantitativen Förderung des Wachstums der Tiere, dadurch gekennzeichnet, daß sie als enzymatisches Produkt, das der Viskosität des Schleimes des Darmkanals den optimalen Wert gibt,.ein oral in einer Dosis von 1000 bis 20 000 Ansom-Einheiten/ kg Körpergewicht pro Tag zu verabreichendes Produkt enthalten, das wenigstens 50 000 Ansom-Einheiten/ml oder wenigstens 100 Ansom-Einheiten/mg oder wenigstens 1000 Ansom-Einheiten/mg enthält.

26) Veterinärmedizinische Zubereitungen nach Anspruch zur Steigerung der Wirksamkeit von oral verabreichten Medikamenten, dadurch gekennzeichnet, daß sie als enzymatisches Produkt, das der Viskosität ,des Schleims des Darmkanals die optimale Viskosität gibt, ein oral in einer Dosis von 5000 bis 200 000 Ansom-Einheiten/kg Körpergewicht pro Tag zu verabreichendes Produkt enthalten, das wenigstens 50 000 Ansom-Sinheiten/ml oder wenigstens 100 Ansom-Einheiten/mg oder wenigstens 1000 Ansorn-Einheiten/mg enthält.

27) Diätetische Zubereitungen für den Menschen nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein oral in einer Donin von 1000 bin 20 000 Ansom-Eiiobei trr./k." Körpergewicht pro Ta^ ku verabreichendes en::ym;itisehen l'ro.iukt enthalten, -nv, der: Schleim den Darmkanaly d.io optimaIp Viskosität, verleiht und wenip-0 09 8 3 7/1912

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stens 10 000 Ansom-Einheiten/mg oder wenigstens 50 000 Ansom-Einheiten/mg enthält.

28) Pharmazeutische Zubereitungen nach Anspruch 24 zur -Verbesserung des Anabolismus und zur Steigerung der Wirksamkeit von Medikamenten, dadurch gekennzeichnet, daß sie als enzymatisches Produkt, das der Viskosität des Schleims des Darmkanals den optimalen Wert verleiht, ein oral in einer Dosis von 5000 "bis 200 000 Ansom-Einheiten/kg Körpergewicht pro Tag zu verabreichendes Produkt enthalten, das wenigstens

10 000 Ansom-Einheiten/mg oder wenigstens 50 000 An-. - som-Einheiten/mg enthält.

29) Veterinärmedizinische Zubereitungen nach Anspruch für die Behandlung von Affektionen der Atemwege, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein enzymatisches Produkt enthalten, das der Viskosität des Bronchialschleims den optimalen Wert verleiht und wenigstens 10 000 Ansom-Einheiten/mg enthält, und in." Form von Aerosol oder in jeder anderen geeigneten Form in einer Dosis, die 500 bis 50 000 Ansom-Einheiten/kg Körpergewicht pro Tag ,entspricht, verabreicht werden.

30) Pharmazeutische Zubereitungen nach Anspruch 24 für die Behandlung von Affektionen der Atemwege, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein enzymatisches Produkt enthalten, das der Viskosität des Bronchialschleiras den optimalen Wert verleiht und wenigstens 10 000 Ansom-Einheiten/mg oder wenigstens 50 000 Ansom-Einheiten/mg enthält, und in Form von Aerosol oder in jeder anderen geeigneten Form in einer Dosis, die . 500 bis 50 000 Ansom-Einheiten/kg Körpergewicht pro Tag entspricht, verabreicht werden»

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31) Veterinärmedizinische Zubereitungen nach Anspruch für die Behandlung von Affektionen der Genitalien, insbesondere für die Behandlung der Sterilität, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein enzymatisches Produkt enthalten, das der Viskosität des Zervixschleimes die optimale Viskosität verleiht und wenigstens 10 000 Ansom-Einheiten/mg enthält, und insbesondere in Eiform in einer Dosis von 500 bis 50 000 Ansom-Einheiten/kg Körpergewicht pro Tag angewendet werden«

32) Pharmazeutische Zubereitungen nach Anspruch 24 für die Behandlung von Krankheiten der Genitalien, insbesondere für die Behandlung der Sterilität, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein enzymatisches Produkt enthalten, das der Viskosität des Zervixschleimes die optimale Viskosität verleiht und wenigstens 10 000 Ansom-Einheiten/mg oder wenigstens 50 000 Ansom-Einheiten/mg enthält, und insbesondere in Eiform in einer Dosis verabreicht werden, die 500 bis 50 000 Ansom-Einheiten/kg Körpergewicht pro Tag entspricht»

009837/1912