DE19611940C2 - Verfahren zur zentrifugationstechnischen Durchführung von Partikeltrennungen, insbesondere auf biologischem Sektor - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Einrichtung zur zentrifugationstechnischen Durchführung von Partikel­ trennungen.

Längst hat sich die Erforschung von Organfunktionen auf zellulärer Ebene enorm verbreitet. Im Zentrum der physiolo­ gischen Grundlagenforschung steht heute die Beschreibung spezifischer Funktionen differenzierter und spezialisierter Zelltypen, die die einzelnen Gewebearten bilden und im Zu­ sammenwirken schließlich die zentralen Aufgaben der Körper­ organe bedingen.

Die wichtigste Voraussetzung für die weitere Entwicklung dieser wichtigen Forschungsrichtung ist die Verfügbarkeit immer effizienterer Zelltrennungsmethoden. Dafür scheinen sich heute zunächst einmal vielversprechende immunologische Trennverfahren anzubieten. Deren Grundlage ist stets die Expression typischer zellulärer Antigene, die mit Hilfe hochspezifischer Antikörper erkannt und schließlich für die Trennung ausgenützt werden. Werden die Antikörper z. B. auf magnetischen Körnchen verankert, so kann es über diese Pro­ teine auch zur Bindung der Zellen an die Partikel kommen. Im Idealfall läßt sich dieser Vorgang mit Hilfe eines Ma­ gneten auf bestechend einfache Weise für die Abtrennung der gebundenen Zellen auswerten.

Zellspezifische Antikörper sind aber oft auch extrem spezi­ espezifisch (und daher oft nicht verfügbar) und außerdem sehr teuer. Abgesehen von diesen in der Praxis oft ent­ scheidenden Limitationen stößt die Auswertbarkeit antigener Strukturen für erfolgreiche Zelltrennungen aber auch immer dann rasch auf unüberwindbare Grenzen, wenn sie für die Se­ paration von Zellarten - die nicht etwa wie die Zellen des Blutes in einer physiologischen Suspension vorliegen, son­ dern in Gewerbearten zunächst fest miteinander verbunden sind - herangezogen werden sollen.

Denn die wichtigste Vorbedingung dafür ist zunächst die komplette Dissoziation und Suspendierung solcher Zellen aus dem nativen Gewebeverband. Dies kann nur durch Einwirkung komplexer proteolytischer Gemische erreicht werden, die während ihres Angriffs unvermeidbarerweise auch das Anti­ genmuster der Gewebezellen substantiell verändern können. Bei der Proteolyse oft abgelöste bzw. maskierte oder auch unspezifisch neu entfaltete oder exprimierte Antigene ma­ chen das anschließende immunologische Trennverfahren rasch ineffizient und zahlreiche Fremdzellen schleichen sich ty­ pischerweise in die schließlich erhaltene Suspension der "gereinigten" Zielzellart ein. Zur Zeit erleben wir eine Inflation entsprechend falscher Mitteilungen in der Fachli­ teratur.

Wesentlich zuverlässiger als immunologisch erkennbare Zel­ leigenschaften überstehen bestimmte physikalische bzw. phy­ sikalisch-chemische Zellmerkmale die Einwirkung der Protea­ sen. Dazu gehören die Größe, Form und Aggregabilität der Zellen auf der einen Seite und ihr spezifisches Gewicht, das unter gegebenen physiologischen Bedingungen sehr von der Ionen- und Wasserpermeabilität ihrer Zellmembranen bzw. von dem in ihnen vorliegenden osmotischen Druck abhängt, auf der anderen Seite. Jede dieser physikalischen bzw. phy­ sikalisch-chemischen Größen kann als Trennparameter für ei­ ne erfolgreiche Zellseparation eingesetzt werden, wenn die Zellen in das Schwerefeld einer geeigneten Zentrifuge ein­ gebracht werden. Üblicherweise erfolgt die Zellseparation in Zentrifugengefäßen in Flüssigmedien bestimmter Dichte, die auch als sogenannte "diskontinuierlich oder kontinuier­ liche Dichtegradienten" eingeschichtet werden. Diese Medien haben zunächst die Aufgabe, die angestrebten Zelltrennungen gegen thermische Konvektion und mechanische Vibration zu stabilisieren. Die Sedimentationsgeschwindigkeit v hängt von dem folgenden formelmäßigen Zusammenhang ab

wobei d den Zellradius, ϑ_Z bzw. ϑ_M die spezifische Dichte der Zellen bzw. des Mediums, µ die Viskosität des Trennme­ diums, ω die Winkelgeschwindigkeit und r den Rotorradius bezeichnen.

Auf dieser Grundlage werden bis heute bei Zentrifugations­ verfahren grundsätzlich wahlweise, aber nicht mit aller Konsequenz kombinierbar die folgenden zwei Techniken ausge­ übt:

1. "Zonenzentrifugationen"

Hierbei erfolgt die Trennung der Zellen in einem in Sedi­ mentationsrichtung immer dichter werdenden, aber doch rela­ tiv flachen kontinuierlichen oder stufenförmigen Gradienten des ausgewählten Trennmediums (verschiedene Produkte auf dem Markt, z. B. Ficoll®, Metrizamid, Percoll etc. ), so daß keine der Zellarten einen isopyknischen (ihrer eigenen spezifischen Dichte entsprechenden) Dichtebereich auffinden kann. Als Konsequenz würden sich alle Zellarten am Boden des Separationsgefäßes wieder ansammeln, falls die Zentri­ fugation nicht rechtzeitig unterbrochen würde. Eine Tren­ nung erfolgt vor allem auf Grund der unterschiedlichen Grö­ ße der Zellarten (siehe obige Formel).

2. "Isopyknische Zentrifugationen"

In diesen Fällen wird ein Dichtegradient eingefüllt, der auch Bereiche gleicher spezifischer Dichte wie die der Zellen enthält. Erreicht eine Zellart den für sie "isopyknischen" Bereich des Gradienten, geht ihre Sedimen­ tationsgeschwindigkeit gegen Null (siehe obige Formel) und Zellen verschiedenen spezifischen Gewichts trennen sich dann im Gradienten, wenn dessen Profil im Zentrifugengefäß einen geeigneten räumlichen Verlauf hat. Je nach Trennpro­ blem werden besser lineare oder konvexe oder konkave Gra­ dienten eingefüllt.

Aus der DE 35 04 205 A1 geht die Konstruktion eines für derartige Zellseparationen geeigneten Rotors hervor, der es gestattet, die kurz geschilderten Zentrifugationsmethoden auch dadurch auszunützen, daß das Innere des Separationsge­ fäßes während der gesamten laufenden Zentrifugation zugäng­ lich bleibt und der Gradient über eine entsprechende Kanüle abgesaugt werden kann. Ein zusätzlicher Vorteil ist auch die Autoklavierbarkeit des gesamten Rotors und dadurch die Schaffung von Voraussetzungen zum sterilen (aseptischen) Arbeiten und eine sich eventuell anschließende, langfristi­ ge Kultivation der getrennten Zellen im Gewebelabor.

Die jahrelange Erfahrung mit diesem Rotor hat bewahrenswer­ te, konstruktive Merkmale deutlich gemacht, aber auch die folgenden Probleme und Einschränkungen dieser Konstruktion aufgezeigt:

• a) In den Zentrifugengefäßen wirken sich Corioliskräfte aus, wie dies die Fig. 1 zeigt. Im rotierenden (Pfeil 4) Zentrifugenbehälter 1 würde sich ein Körper entlang der be­ absichtigten Linie 2 bewegen, wenn die genannte Coriolis­ kraft außer acht bleibt. Tatsächlich wirkt diese jedoch so auf den Körper ein, daß dieser sich entlang der Linie 3 be­ wegt. Dies hat zur Folge, daß die im Gradienten 7 getrenn­ ten Zellbanden 6, 8 gemäß Fig. 2 beschaffen bzw. verformt sind. Werden diese Zellbanden 6, 8 über die Spitze einer am Ende des Zentrifugenbehälters 1 endenden Kanüle 5 frak­ tioniert, kommt es zur teilweisen Verschmierung der Zell­ trennung. Die volle, prinzipiell mögliche Trennleistung des Systems wird daher im Endeffekt nicht nützbar, weil Teile der Bande 6 immer noch eluiert werden, wenn die Bande 8 bereits an der Spitze angekommen ist.
• b) Die Konstruktion der Kanülenführung läßt eine Fraktio­ nierung der getrennten Banden nur durch Absaugung zu. Bei laufender Zentrifuge muß der dazu notwendige Sog die Zen­ trifugalkraft übertreffen. Da letztere möglichst hoch sein soll, um eine Verwirbelung der getrennten Zellen zu vermei­ den, muß der für die Absaugung der Zellen entwickelte Un­ terdruck so beträchtlich sein, daß es teilweise zum "Ausgasen" im Zellinneren physikalisch gelöster physiologi­ scher Gase (Sauerstoff, Kohlendioxid, Stickstoff) kommen kann, was mit einer Zellschädigung verbunden sein kann. Au­ ßerdem läßt sich eine kontinuierliche Elution aus prakti­ schen Gründen kaum erreichen. Der Einsatz von peristalti­ schen Pumpen zum kontinuierlichen Abpumpen von Zellen wäre jedenfalls deletär für fast alle Zellarten. Es besteht au­ ßerdem ständig die Gefahr von Verwirbelungen, wenn beim Ab­ ziehen von häufig zum Ansaugen des Gradienten eingesetzten Spritzen vom Kanülenansatz in der Kanüle befindliches Volu­ men wieder in die Spitze des Zentrifugenglases zurückge­ schleudert wird.

Aus der US 4 927 545 ist ein Verfahren zur zentrifugation­stechnischen Durchführung von Partikeltrennungen auf biolo­ gischem Sektor bekannt, bei dem in einen Zentrifugenbehäl­ ter eine zu fraktionierende Blutprobe eingebracht wird, wo­ bei nachfolgend eine Gradientenlösung mit sich stufenweise vergrößernder Dichte eingebracht wird. Aus der Probe wan­ dern Partikel durch die Wirkung der Gleichgewichts- und/oder Sedimentationszentrifugation in die Gradientenlö­ sung. Nach einer vorbestimmten Zentrifugationszeit wird die die fraktionierten Partikel der Probe enthaltende Gradien­ tenlösung über eine Kanüle ausgebracht. Die Auswirkungen der Corioliskraft werden bei diesem bekannten Verfahren nicht beachtet. Die Gradientenlösung wird unter Anwendung eines Vakuums durch Absaugen ausgetragen.

Aus der DE 43 14 144 C2 ist ein weiteres Verfahren zur zen­ trifugationstechnischen Durchführung von Partikeltrennungen auf biologischem Sektor bekannt, bei dem zwei fraktioniere Partikel der Probe über je eine Kanüle unter Anwendung von Vakuum ausgebracht werden.

Aus der DE 42 16 000 A1 ist ein Verfahren zur zentrifugati­ onstechnischen Durchführung von Partikeltrennungen bekannt, bei dem in einen Zentrifugenbehälter eine zu fraktionieren­ de Probe und eine Gradientenlösung abgestufter Dichte über eine Kanüle eingebracht werden und nach einer vorbestimmten Zentrifugationszeit die Probe ausgebracht wird. Bei diesem Verfahren finden die wesentlichen Verfahrensschritte jedoch nicht in der Zentrifuge, sondern in einer speziellen Vor­ richtung statt.

Schließlich ist aus der EP 0 205 106 A2 ein Verfahren zur zentrifugationstechnischen Durchführung von Partikeltren­ nungen auf biologischem Sektor bekannt, bei dem in eine Zentrifugenbehälter eine zu fraktionierende Prober über ei­ ne Kanüle eingebracht und nach einer vorbestimmten Zentri­ fugationszeit über eine weitere Kanüle die Probe ausge­ bracht wird.

Eine Gradientenlösung ist dabei nicht vorgesehen.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur zentrifugationstechnischen Durchführung von Partikeltrennungen zu schaffen, bei dem eine optimale Trennschärfe erreichbar ist und eine Schädigung bei der Partikelfraktionierung vermieden wird.

Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Patentanspruches 1 gelöst.

Die Erfindung schafft vorteilhafterweise darüber hinaus ein völlig neues Zentrifugationsverfahren unter Kombination der beiden grundsätzlichen, oben erläuterten Zentrifugen­ techniken miteinander, wobei zur Trennung zusätzlich ein Flüssigkeitsstrom einsetzbar ist.

Der ungünstige Einfluß der Coriolis-Kräfte wird durch einen durchgehend konischen Zentrifugenbehälter minimiert. Im Falle von Glasgefäßen wird die Innenseite hydrophob be­ schichtet, z. B. mit Standardverfahren silikonisiert. Im Falle von Plastikgefäßen empfiehlt sich Teflon oder Poly­ carbonat als Wandmaterial. Die hydrophoben Wandinnenschich­ ten führen zum Abstoßen der hydrophilen Zellen und verhin­ dern deren direkten Wandkontakt.

Eine luftdicht abdichtbare Doppelkanüle, deren vertikale Achse genau durch den Rotormittelpunkt verläuft, erlaubt vorteilhafterweise die Einführung einer zentralen Kanüle wie beim aus der DE 35 04 205 A1 vorbekannten Rotortyp, schafft aber noch einen zweiten gas- und flüssigkeitsab­ dichtbaren Zugang zum Separationsgefäß. Über diesen Weg kann am Ende des Trennprozesses ein Druckmedium eingebracht und dadurch der Gradient über die Zentralkanüle ausgedrückt und mit Hilfe eines ebenfalls zur optimalen Ausrüstung die­ ses Zentrifugensystems gehörenden Fraktionensammlers frak­ tioniert werden. Diese Fraktionierungstechnik erlaubt die vollkommene Aufrechterhaltung der im konisch immer dünner werdenden Zentrifugengefäß optimal weit auseinandergezoge­ nen Zelltrennungen im Verlauf der durch die nahezu punkt­ förmige Abführung unterstützten Gradientenfraktionierung.

Schließlich bringt das erfindungsgemäße Zentrifugations­ verfahren gleich mehrere typische Zellparameter für den Trennprozess ins Spiel und resultiert in nicht mehr stei­ gerbaren Trennschärfen. Dabei wird zu allererst die Probe über die innere zentrale Kanüle in den Zentrifugenbehälter eingetragen. Zweckmäßigerweise wird sie mit Gradientenmedi­ um auf eine spezifische Dichte gebracht, die gerade über der leichtesten Zellart im Gemisch liegt. Diese schwimmt bei der weiteren Zentrifugation deshalb bereits in reiner Form als oberste Bande auf.

Grundlegend für die Optimierung des erfindungsgemäßen Zen­ trifugationsverfahrens ist nun weiterhin, daß sowohl eine jeweils elektronisch stufenlos regulierbare Pumpeneinrich­ tung und Zentrifugeneinrichtung in Kombination mit dem neu­ entwickelten Rotor eingesetzt werden, beide Geräte sind deshalb auch programmiert koordinierbar. Wird nun - pro­ grammgesteuert - mit dem Einpumpen des meist aus zwei Lö­ sungen gemischten Gradienten begonnen, so wirken zwei Kräf­ te auf das zu trennende Zellgemisch gleichzeitig ein, die Zentrifugalkraft und die Strömungskraft. Erstere führt in diesem Stadium der Zentrifugation vor allem zur Trennung von Zellen auf Grund ihrer unterschiedlichen Zelldurchmes­ ser und spezifische Dichte, letztere erfaßt vor allem sper­ rig geformte Zellen oder Aggregate, während kompakt gebau­ te, schwere Einzelzellen kaum beeinflußt werden. Zusätzlich kann die Wanderungsrichtung der Zellen noch dadurch gezielt beeinflußt werden, daß die Osmolarität des Gradientenmedi­ ums durch Beimischen entsprechender Salzkonzentrationen über das Programm rasch verändert wird (Erythrozyten schrumpfen, z. B. rasch in hypertonen Medien und erhalten so ein größeres spezifisches Gewicht und sedimentieren deshalb rascher). Programm-gesteuert können außerdem bald so hohe Dichtegradientenbereiche eingefüllt sein, daß bestimmte Zellarten der Ausgangsprobe im Bereich einer für sie isopy­ knischen Dichte anlangen und dann gemäß der oben angegebe­ nen Formel liegen bleiben. Andere Zellarten wandern unter den jeweils gegebenen Bedingungen eventuell noch weiter und sammeln sich erst in weiter von der Zentrifugenachse ent­ fernt gelegenen Gradientenbereichen. Durch jedem Zellge­ misch anpaßbare Geschwindigkeiten der Pumpeneinrichtung bzw. Zentrifugenrotation lassen sich Zelltrennungen bisher nie erreichter Schärfen und in kürzesten Zeiträumen (teilweise nur in wenigen Minuten) erreichen. Dies kann für die Vitalität biologischer Präparate entscheidend sein. Das geschilderte Verfahren ist außerdem extrem anpassungsfähig und billig.

Im folgenden werden die Erfindung und deren Ausgestaltungen im Zusammenhang mit den Figuren näher erläutert. Es zeigen:

Fig. 1 und 2 Darstellungen zur Erläuterung des Prinzips des erfindungsgemäßen Zentrifugationsverfahrens und

Fig. 3 und 4 eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Zentrifugationsverfahrens.

In der Fig. 3 ist eine Einrichtung zur Durchführung des vorliegenden Verfahrens dargestellt. Im wesentlichen umfaßt diese Einrichtung ein erstes Behältnis 10 für eine dichtere Gradientenlösung, ein zweites Behältnis 9 für eine ver­ gleichsweise dünnere Gradientenlösung, eine Pumpeneinrich­ tung 12, eine Zentrifugeneinrichtung 30, die später näher erläutert werden wird, und eine Recheneinrichtung 90. In der Zentrifugeneinrichtung 30 wird ein Zentrifugenbehälter 1 gehalten und in Drehung versetzt, der die aus der Fig. 3 ersichtliche, sich verjüngende bzw. konische Form besitzt, durch die die Einwirkung von Coriolis-Kräften vermieden wird. Außerdem wird durch die speziell konische Form er­ reicht, daß die Trennung der Fraktionen im Bereich der Spitze 51 der zentralen Kanüle 5 besser erfolgen kann, weil die einzelnen Fraktionen im Bereich des kleinen Durchmes­ sers an der Spitze 51 auseinandergezogen werden. In das In­ nere des Zentrifugenbehälters 1 ragt die entlang der Achse des Zentrifugenbehälters 1 verlaufende zentrale Kanüle 5 derart hinein, daß ihr freies Ende 51 unmittelbar vor der Spitze 1' des konischen Zentrifugenbehälters 1 endet. Das gesamte Ende 51 ist vorzugsweise gemäß Fig. 4 spitz ausge­ bildet. In den Zentrifugenbehälter 1 ragt ferner an einem Ort außerhalb der Längsachse desselben eine weitere Kanüle 17 hinein, die etwa am Ende des durch ein Deckelteil 31 verschlossenen Zentrifugenbehälters 1 endet.

Die Recheneinrichtung 90 ist über Leitungen 91 bzw. 92 mit der Pumpeneinrichtung 12 und der Zentrifugeneinrichtung 30 verbunden, so daß diese durch ein in der Recheneinrichtung 90 gespeichertes Programm im Hinblick auf die Förderlei­ stung bzw. die Drehzahl gesteuert werden können.

Mit der beschriebenen Einrichtung wird in der folgenden Weise gearbeitet.

In einem ersten Schritt wird eine Gradientenlösung einer gewünschten Dichte hergestellt. Zu diesem Zweck wird in ei­ ner genau programmierten Weise, durch die Recheneinrichtung 90 gesteuert, aus dem ersten Behältnis 10 über die Leitung 11 mit der Hilfe der Pumpeneinrichtung 12 eine dichtere Gradientenlösung 13 in das zweite Behältnis 9 eingeführt, in der sich eine dünnere Gradientenlösung 14 befindet. Vor­ teilhafterweise mit der Hilfe eines bekannten Magnetrührers 28 werden die eingeführte dichtere Gradientenlösung 13 und die im Behältnis 9 befindliche dünnere Gradientenlösung 14 fortlaufend gemischt, bis ein gewünschter Dichtegrad herge­ stellt ist. Nach dem Öffnen der Schlauchklemme 15 oder ei­ nes anderen Verschlusses wird mit der Hilfe der Pumpenein­ richtung 12 über die Leitung 16 die gemischte Gradientenlö­ sung 7' der gewünschten Dichte über die zentrale Kanüle 5 in das Innere des Zentrifugenbehälters 1 im Bereich der Spitze 1' desselben eingeführt. In dem Behälter 1 befindet sich zu diesem Zeitpunkt bereits im Bereich der Spitze 1' die zu fraktionierende Probe 26, da die Gradientenein­ schichtung nach dem Einbringen der Probe 26 erfolgt. Beim Einbringen der Gradientenlösung 7 wird die Probe 26 in der Richtung des Pfeiles 40 gegen die Zentrifugalkraft 41 ver­ schoben, wobei die Zellpartikel der Probe 26 in die Gra­ dientenlösung 7 einwandern. Die Gradientenlösung 7 kann rechnergesteuert fortlaufend im Hinblick auf ihre Dichte so variiert werden, daß die Dichte in einem genau vorbestimm­ ten Maße kontinuierlich oder stufenweise zunimmt.

Dies hat zur Folge, daß die Fraktionierung durch die wäh­ rend der Zentrifugation ablaufenden Prozesse der Gleichge­ wichtszentrifugation, bei der die Partikel der Probe 26 so­ lange wandern, bis sie die ihnen entsprechende Gradienten­ dichte erreichen, und der Sedimentationszentrifugation er­ reicht wird, bei der die Zellpartikel der Probe 26 in Ab­ hängigkeit von ihrer Form und/oder Größe und/oder Aggrega­ tion in unterschiedliche Partikelzonen (Banden) aufgetrennt werden.

Wie dies bereits erwähnt wurde, wird dabei durch die Koni­ zität des Zentrifugenbehälters 1 verhindert, daß die ent­ stehenden Fraktionen gemäß Fig. 2 infolge der auftretenden Corioliskraft verschmiert werden, da deren Auswirkungen bei den durch die Verjüngung erzielten kleinen Behälterdurch­ messern nicht relevant sind.

Da Möglichkeiten der Zugabe eines im Hinblick auf die zu­ nehmende Dichte programmiert gesteuerten Lösungsgradienten 7 durch Bestimmung des Mischungsverhältnisses in dem Be­ hältnis 9 durch Ansteuerung der Pumpeneinrichtung 12 sowie der Regelung der Drehzahl der Zentrifugeneinrichtung 30 be­ stehen, kann die Fraktionentrennung in einem bisher nicht erreichten Ausmaß gestaltet werden.

Nach der Trennung wird Druckmedium, vorzugsweise Druckluft über die Leitung 18 und die Kanüle 17 in das Innere des Zentrifugenbehälters 1 zum gezielten Ausbringen der erzeug­ ten Fraktionen über die zentrale Kanüle 5 eingebracht. Die­ se werden durch den im Inneren des Zentrifugenbehälters 1 erzeugten Druck gegen die Zentrifugalkraft 41 über die Spitze 51 der zentralen Kanüle 5 (vorzugsweise bei vermin­ derter Drehzahl) punktförmig abgesaugt und mit einer bisher nicht erreichbaren Schärfe ausgebracht. Vorzugsweise zweigt die zentrale Kanüle 5 über ein T-Stück 81 zu einer dann ge­ öffneten Schlauchklemme 80 oder einen anderen Verschluß ab, so daß die Fraktionen über die Leitung 83 entnommen werden können.

Im folgenden wird im Zusammenhang mit der Fig. 4 der kon­ struktive Aufbau des Rotors der Zentrifugeneinrichtung 30 im Hinblick auf die bevorzugte Leitungsführung der zentra­ len Kanüle 5 sowie der weiteren Kanüle 17 näher erläutert. Dabei ist der Körper dieses Rotors, an dem der Zentrifugen­ behälter 1 befestigt ist, mit 50ezeichnet.

Vorzugsweise sind die Zufuhrleitungen 18 für die zentrale Kanüle 5 und 16 für die weitere Kanüle 17 koaxial zueinan­ der in der Form einer Doppelkanüle angeordnet. Dabei ver­ laufen beide Leitungen 16 und 18, wobei sich die Leitung 18 im Inneren der Leitung 16 befindet, zunächst durch eine obere Platte 19, in deren Mitte sich eine Bohrung 410 be­ findet, durch die die genannte Doppelkanüle verläuft. Un­ terhalb der vorzugsweise aus Stahl bestehenden Platte 19 befindet sich eine Dichtungscheibe 20 für die äußere Lei­ tung 16, die vorzugsweise aus Silikongummi besteht. Das En­ de der Leitung 16 endet in einer mittigen Bohrung 20' der Dichtungsscheibe 20. Unterhalb der Dichtungsscheibe 20 be­ findet sich eine weitere Platte 21, die vorzugsweise aus Stahl besteht und durch deren Bohrung 25 die innere Leitung 18 verläuft. Das Ende der Leitung 16, das durch die Dich­ tungsscheibe 20 abgedichtet ist, steht daher dicht mit der Bohrung 25 in Verbindung, die wiederum über einen radial in der Platte 21 verlaufenden Durchgang 23 mit der Kanüle 17 in Verbindung steht. Die durch die Bohrung 25 hindurch ver­ laufende Leitung 18 verläuft durch eine mittige Bohrung 22' einer weitere Dichtungsscheibe 22, die vorzugsweise eben­ falls aus Silikongummi besteht und die Leitung 18 an ihrem Außenumfang abdichtet. Vorzugsweise besteht die Dichtungs­ scheibe 22 aus einem weicheren Silikongummi als die Dich­ tungsscheibe 20. Das Ende der Leitung 16 ragt in eine im Körper 50 des Rotors der Zentrifugeneinrichtung 30 befind­ liche Bohrung 510 hinein, die in radialer Richtung über ei­ nen Durchgang 52 mit der zentralen Kanüle 5 in Verbindung steht. Die genannten Platten 19 und 21 sowie die genannten Dichtungen 20 und 22 werden durch eine in eine Bohrung 53 des Körpers 50 eingeschraubte Schraube 54 aneinander ge­ preßt, durch deren Axialbohrung 55 die genannten Leitungen 16 und 18 nach außen verlaufen. Beim Betrieb der Zentrifu­ geneinrichtung 30 drehen sich der Körper 50, die Schraube 54, die Platten 19 und 21 sowie die Dichtungen 20 und 22, während die Leitungen 16 und 18 nichtdrehende Teile sind, die über nicht dargestellte Kugellager in Bezug auf die drehenden Teile abgestützt sind.

Es hat sich herausgestellt, daß Silikongummi als Material für die genannten Dichtungsscheiben 20 und 22 besonders vorteilhaft ist, weil der an den Außenumfängen der Leitun­ gen 16 bzw. 18 auftretende Verschleiß beim Drehen der Zen­ trifugeneinrichtung 30 minimal ist. Die Silikongummi- Dichtungsscheiben 20 und 22 können nach erfolgtem Ver­ schleiß durch einfaches Aufdrehen der Schraube 54 und Ent­ nahme der Platten 19 und 21 besonders leicht ausgewechselt werden.

Vorzugsweise kann das Ankoppeln von unterschiedlichen zen­ tralen Kanülen 5 an den Durchgang 52 über eine abgedichtete Schraubverbindung 56 erfolgen.

Zweckmäßigerweise kann die sich nicht drehende Doppelkanüle 16, 18 bei laufender Zentrifugeneinrichtung 30 entfernt werden. Dadurch können extrem hohe Umdrehungszahlen, ohne Abrieb an den Dichtungen erreicht werden, bei denen auch subzellulare Partikel fraktionierbar sind. Zum Zwecke der späteren Gradientenentnahme bei geringeren Drehzahlen wird die Doppelkanüle wieder eingesetzt.

Das oben genannte Deckelteil 31 des Zentrifugenbehälters 1 kann dadurch realisiert werden, daß der Behälterrand 1'' ge­ gen einen Dichtungsring 32 gedrückt wird, der in einer Aus­ sparung 33 des Rotorkörpers 50 enthalten ist. In diesem Fall führt der die weitere Kanüle 17 bildende Durchgang des Rotorkörpers 50 zum Boden der Aussparung 33 innerhalb des Dichtungsringes 32 und wird die zentrale Kanüle 5 mit Hilfe der bereits genannten Schraubverbindung 56 am Rotorkörper 50 befestigt.

Vorzugsweise wird ein Zentrifugenbehälter 1 verwendet, des­ sen Länge von der Spitze 1' bis zur Öffnung etwa 10 bis 15 cm beträgt und dessen Öff­ nung einen Durchmesser von etwa 3 bis 8 cm aufweist.

Am folgenden Beispiel wird im Vergleich mit konventionellen Zentrifugationssystemen gezeigt, wie sich alle diese Para­ meter kombinieren und im Hinblick auf die Reindarstellung von neutrophilen Granulozyten aus Meerschweinchenblut (gegen die es keine käuflichen Antikörper zur Ausnutzung immunologischer Trennmethoden gibt) optimieren lassen. Es handelt sich dabei bekanntlich um kernhaltige Zellen des Blutes, die neben anderen kernhaltigen Zellen (andere Gra­ nulozyten, Lymphozyten, Monozyten) - zu den "weißen Blut­ körperchen" bzw. "Leukozyten" gehören. Die Gesamtheit aller Leukozyten macht nur ca. 0.1-0,2% aller Blutzellen aus, die neutrophilen Granulozyten sogar nur 0,03-0,09%. Ne­ ben den Thrombozyten (ca. 4% aller Blutzellen) besteht Blut zu ca. 96% vorwiegend aus Erythrozyten. Die Reinigung der Granulozyten durch Zentrifugation stellt also ein Ex­ trembeispiel dar, das noch zusätzlich erschwert wird durch die Tatsache, daß Erythrozyten die schwersten Blutzellen darstellen. Sie wandern also am weitesten in den eigenen Dichtegradienten ein und müssen deshalb als erste (völlig überladene) Bande eluiert werden.

Das zweite Beispiel soll deutlich machen, daß sich eine derartige Trenneffizienz zentrifugaler Methodik auch für Zellgemische anwenden läßt, die erst durch aufwendige pro­ teolytische Dissoziationsverfahren aus nativen Organen her­ ausgelöst werden müssen. Es handelt sich beim konkreten Beispiel um die schwierige Aufgabe, die im Herzmuskel ex­ trem zahlreich und multidispersen Mikrogefäße mit Begleit­ zellen von den Herzmuskelzellen (Kardiomyozyten) komplett abzutrennen. Die Kardiomyozyten besitzen einen zellspezifi­ schen Stoffwechsel, der nur bei ihrer vollkommenen Reindar­ stellung richtig erfaßt werden kann. Diese für die pharma­ kologischen Zielsetzungen in der Medizin wichtige Aufgabe wird durch eine extreme Empfindlichkeit der Herzmuskelzel­ len erschwert, die sich bekanntlich schnell kontrahieren können und im isolierten Zustand dann irreversibel abster­ ben.

Claims (15)

1. Verfahren zur zentrifugationstechnischen Durchfüh­ rung von Partikeltrennungen, insbesondere auf bio­ logischem Sektor, bei dem in einen Zentrifugenbe­ hälter (1) eine zu fraktionierende Probe (26) über eine erste Kanüle (5) eingebracht wird, die mit ih­ rem freien Ende (51) zur Minimierung unerwünschter Auswirkungen der Corioliskraft zur Spitze (1') ei­ nes sich zur Spitze (1') hin stark verjüngenden Zentrifugenbehälters (1) verläuft, wobei über die erste Kanüle (5) nachfolgend eine Gradientenlösung (7) mit sich zunehmend kontinuierlich oder stufen­ weise vergrößernder Dichte eingebracht wird, wobei aus der Probe (26) Partikel durch die Wirkung der Gleichgewichts- und/oder Sedimentationszentrifuga­ tion in die Gradientenlösung (7) wandern, und wobei nach einer vorbestimmten Zentrifugationszeit über eine weitere Kanüle (17) ein Druckfluid in das In­ nere des verschlossenen Zentrifugenbehälters (1) eingebracht wird, um die die fraktionierten Parti­ kel der Probe (26) enthaltende Gradientenlösung (7) über die erste Kanüle (5) auszubringen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Gradientenlösung (7) mit sich zunehmend kontinuierlich oder stufenweise vergrößernder Dich­ te aus wenigstens einer Gradientenlösung (13) einer größeren Dichte und einer Gradientenlösung (14) ei­ ner vergleichsweise kleineren Dichte zur Erzielung einer gewünschten Dichte zusammengemischt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Gradientenlösung (13) der größeren Dichte einem ersten Behältnis (10) entnommen und mit der Hilfe einer ersten Pumpeneinrichtung (12) in ein die Gradientenlösung (14) der kleineren Dichte ent­ haltendes zweites Behältnis (9) befördert wird, daß die in dem zweiten Behältnis (9) enthaltenen Gra­ dientenlösungen (13, 14) fortlaufend miteinander vermischt und aus dem zweiten Behältnis (9) der Ka­ nüle (5) über eine weitere Pumpeneinrichtung (12) zugeführt werden.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Pumpeneinrichtungen (12) durch das Programm einer Recheneinrichtung (90) fortlaufend gesteuert werden, um fortlaufend eine vorbestimmte Dichte der Gradientenlösung zu erhalten.

5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Zuführung der Gradientenlösung (7) mit sich zunehmend kontinuierlich oder stufen­ weise vergrößernder Dichte durch Ansteuerung der weiteren Pumpeneinrichtung (12) durch das in der Recheneinrichtung (90) enthaltene Programm zur vor­ bestimmten Änderung der Zufuhrraten erfolgt.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß ein Zentrifugenbehälter (1) verwendet wird, bei dem die erste Kanüle (5) in dem Zentrifugenbehälter (1) zentral verläuft.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß ein Zentrifugenbehälter (1) verwendet wird, bei dem die weitere Kanüle (17) au­ ßerhalb der Längsachse des Zentrifugenbehälters (1) verläuft.

8. Einrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 7 mit einer Zentrifu­ geneinrichtung (30) mit einem Zentrifugenbehälter (1) mit einer ersten zentralen Kanüle (5), deren freies Ende (51) bis zur Spitze (1') des sich ver­ jüngenden Zentrifugenbehälters (1) verläuft, und mit einer weiteren Kanüle (17), die in das Innere des Zentrifugenbehälters (1) zum Zuführen eines Druckfluids führt, wobei die erste Kanüle (5) und die weitere Kanüle (17) mit einer Leitungsanordnung verbunden sind, die in bezug auf einen Rotorkörper (50) der Zentrifugeneinrichtung (30) drehfest ange­ ordnet ist.

9. Einrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeich­ net, daß die Leitungsanordnung eine innere Leitung (18) und eine diese umgebende äußere Leitung (16) aufweist.

10. Einrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeich­ net, daß in einer Ausnehmung des Rotorkörpers (50) eine erste Dichtungsscheibe (22), darauf eine erste Platte (21), auf dieser eine zweite Dichtungsschei­ be (20) und auf dieser eine zweite Platte (19) an­ geordnet sind, daß die innere und äußere Leitung (16, 18) durch eine Aussparung (41) der zweiten Platte (19) verlaufen, daß die äußere Leitung (18) in einer Aussparung (20') der zweiten Dichtungs­ scheibe (20) dicht endet, daß die innere Leitung (18) durch eine Aussparung (25) der ersten Platte (21) verläuft und in einer Aussparung (22') der er­ sten Dichtungsscheibe (22) abgedichtet ist, daß die Aussparung (25) der ersten Platte (21) über einen Durchgang (23) in der ersten Platte (21) und einen die weitere Kanüle bildenden Durchgang (17) in dem Rotorkörper (50) mit dem Inneren des Zentrifugenbe­ hälters (1) in Verbindung steht, daß die Aussparung (22') der ersten Dichtungsscheibe (22) mit einem weiteren Durchgang (52) in dem Rotorkörper (50) in Verbindung steht, der zur Kanüle (5) führt.

11. Einrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeich­ net, daß die Dichtungsscheiben (20, 22) aus Sili­ kongummi bestehen.

12. Einrichtung nach einem der Ansprüche 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß die zweite Dichtungs­ scheibe (20) aus einem weniger harten Material be­ steht als die erste Dichtungsscheibe (22).

13. Einrichtung nach einem der Ansprüche 10 bis 12, da­ durch gekennzeichnet, daß die Platten (19, 21) Stahlplatten sind.

14. Einrichtung nach einem der Ansprüche 10 bis 13, da­ durch gekennzeichnet, daß die Dichtungen (20, 22) und die Platten (19, 20) durch ein im Rotorkörper (50) verschraubtes Schraubenelement (54) in die Ausnehmung des Rotorkörpers (50) gedrückt werden, und daß die Leitungsanordnung durch eine Bohrung (55) des Schraubenelements (54) verlaufen.

15. Einrichtung nach einem der Ansprüche 8 bis 14, da­ durch gekennzeichnet, daß die Länge des Zentrifu­ genbehälters (1) etwa 10 bis 15 cm beträgt und die Öffnung desselben einen Durchmesser von etwa 3 bis 8 cm besitzt.