DE69735237T2

DE69735237T2 - Gerät und verfahren zum waschen von zellen

Info

Publication number: DE69735237T2
Application number: DE69735237T
Authority: DE
Inventors: Eric Walnut Creek CHASE; Jr Howard L Oldwick NORTH; Harvey Los Altos SCHULTE
Original assignee: Cytek Development Inc
Current assignee: Cytek Development Inc
Priority date: 1996-06-20
Filing date: 1997-06-19
Publication date: 2006-11-02
Anticipated expiration: 2017-06-20
Also published as: DE69735237D1; JP2000516099A; JP3847348B2; US6235537B1; EP0938257A4; EP0938257B1; US5840253A; WO1998019528A1; EP0938257A1; ES2256892T3

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Waschen von biologischen Zellen, das/die mit einer automatisierten Anlage kompatibel ist.
Hintergrund der Erfindung
Viele Verfahren, die die Vorbereitung von biologischen Zellen für die Analyse beinhalten, erfordern, dass nicht zur Reaktion gebrachte Reagenzien und Zellenabriebteilchen von den interessierenden Zellen getrennt werden. Üblicherweise war die Chargenzentrifugation das Verfahren der Wahl zum Durchführen dieser Trennung. Die Chargenzentrifugation ist jedoch nicht leicht an automatisierte Probenvorbereitungssysteme anpassbar. Die meisten automatisierten Probenvorbereitungsanlagen verwenden kreisförmige oder rechteckige Anordnungen mit wegwerfbaren Teströhrchen. Die Teströhrchen werden zu geeigneten Stellen transportiert, so dass verschiedene Vorgänge nacheinander und diskret an jedem Teströhrchen durchgeführt werden können. Bei vielen Probenvorbereitungsprozeduren muss die Zeit zwischen diskreten Vorgängen sorgfältig gesteuert werden, um zuverlässige und reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten. Der Vorgang des Zellenwaschens durch Zentrifugation, wie es auf dem Fachgebiet praktiziert wird, ist jedoch ein diskontinuierlicher Prozess. Dieser diskontinuierliche Prozess kann nicht nacheinander und diskret an jedem Teströhrchen ausgeführt werden. Das Vorliegen eines diskontinuierlichen Prozesses unterbricht per Definition den Zeitablauf der diskreten Vorgänge, die dem diskontinuierlichen Prozess vorangehen und folgen.
Chargenzentrifugationen erfordern im Wesentlichen gleiche Volumina von Flüssigkeit in jedem Röhrchen, um den Zentrifugenrotor ins Gleichgewicht zu bringen, was in einem automatisierten Probenvorbereitungssystem nicht immer erwünscht sein kann. Chargenzentrifugationen erfordern eine Drehausrichtung des Zentrifugenrotors auf das Belade-/Entladesystem, was zusätzliche Komplexität in den Zentrifugenantrieb einführt. Proben erfordern auch eine zwangsläufige Probenidentifikation nach der Zentrifugation, um zu überprüfen, ob die Drehausrichtung erreicht wurde. Schließlich erhöhen der Zentrifugenrotor und die Belade-/Entladevorrichtung die Größe, das Gewicht und die Komplexität des Systems.
Trotz dieser Begrenzungen existieren automatisierte Probenhandhabungssysteme, die die Chargenzentrifugation verwenden. Das ASHS-System, das von Automed vermarktet wird, automatisiert das Beladen und Entladen von herkömmlichen Zentrifugen unter Verwendung von Robotern; solche Systeme sind jedoch groß und kostspielig und nur für Labors mit großem Volumen geeignet.
Eine weitere Kategorie von Instrumenten wurde für das Waschen von Blut und die Blutverarbeitung entwickelt, wie in den Patenten 5 405 308, 4 983 158, 4 668 214, 4 300 717 und 4 086 924 beschrieben. Im Allgemeinen bestehen diese Instrumente aus einer Schalenanordnung mit einer zentralen Zuführungsröhre, um Blut oder Waschlösung in die Schale einzuführen, einer Zuführungsröhren- und Dichtungsanordnung, die eine Eingangszuführungsröhre in die Schale und eine Ausgangsleitung aus der Schale vorsieht, und einer Kernanordnung, die dem einströmenden Fluid eine Winkelgeschwindigkeit verleiht. Diese Instrumente sind zum Zellenwaschen bei einer automatisierten Probenvorbereitungsanlage nicht geeignet, da sie spezialisierte Schalen/Kern-Strukturen erfordern, um die Verarbeitung von großen Mengen (ca. 500 ml) von unverdünntem Blut zu verbessern.
Eine Anzahl von Firmen vermarkten automatische Zellenwaschvorrichtungen. Eine solche Vorrichtung, der Centra-W Automatic Cell Washer, der von IEC vermarktet wird, automatisiert die Ansaugung eines Flüssigkeitüberstands und die Zugabe von Verdünnungsmittel, erfordert jedoch immer noch manuelles Beladen und Entladen der Probenbehälter in den und aus dem Zentrifugenrotor. Folglich sind diese Arten von Instrumenten nicht mit einer automatisierten Probenvorbereitungsanlage kompatibel.
US-A-5 244 635, die den nächsten Stand der Technik darstellt, offenbart ein Zentrifugengefäß zum Durchführen von Immuntests, Affinitätschromatographie und ähnlichen Experimenten. Das Zentrifugengefäß umfasst ein zentrales Röhrchen und eine äußere Abfallkammer. Ein Biomaterial wird innerhalb des zentralen Röhrchens gehalten und ist in der Lage, spezifische Analyten in Testproben zu binden. Im Betrieb wird das Zentrifugengefäß mit hoher Drehzahl um seine Längsachse gedreht, wodurch bewirkt wird, dass das ganze Fluid innerhalb des zentralen Röhrchens in die äußere Abfallkammer transportiert wird, während der interessierende Analyt an das Biomaterial, das im zentralen Röhrchen angeordnet ist, gebunden bleibt. Im Zentrifugengefäß umfasst eine Kappe, die mit der äußeren Abfallkammer verbunden ist und sich über das zentrale Röhrchen erstreckt, eine Struktur zum Verhindern, dass Abfallfluid, das zur Abfallkammer ausgestoßen wird, wieder in das zentrale Röhrchen eintritt.
Es wäre erwünscht, ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Waschen von Zellen zu haben, die mit einer automatisierten Probenvorbereitungsanlage kompatibel sind. Ein solches Verfahren und eine solche Vorrichtung sollten jede Probe einzeln verarbeiten, so dass sie mit den anderen diskreten Vorgängen, die an den Proben durchgeführt werden, synchronisiert werden kann.
Es wäre auch erwünscht, eine Vorrichtung zu haben, die als diskrete Verarbeitungsstation am Umfang eines Karussells oder eines Probenvorbereitungssystems mit geradliniger Schiene implementiert werden könnte.
Ferner wäre es erwünscht, den Waschschritt in denselben wegwerfbaren Teströhrchen durchzuführen, die üblicherweise in einer automatisierten Probenvorbereitungs- und -Analyseanlage verwendet werden.
Es wäre auch erwünscht, dass die Zellenwaschvorrichtung die unerwünschten Zellenabriebteilchen und nicht zur Reaktion gebrachten Reagenzien wirksam auswäscht und die gewünschten Zellen konzentriert.
Schließlich wäre es erwünscht, dass die Zellenwaschvorrichtung ohne ein umfangreiches System zum Transportieren der Probenbehälter in die und aus der Zellenwaschvorrichtung arbeitet.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung ist im Anspruch 1 bzw. 5 definiert. Spezielle Ausführungsbeispiele der Erfindung sind in den abhängigen Ansprüchen dargelegt.
Die hierin beschriebene Erfindung stellt eine verbesserte Vorrichtung und ein verbessertes Verfahren zum Entfernen von Abriebteilchenn und nicht gebundenen Reagenzien von Zellsuspensionen, die in wegwerfbaren Teströhrchen enthalten sind, bereit. Die erfindungsgemäße Zellenwaschvorrichtung kann bei einer Vielzahl von Probenverarbeitungssystemen durch eine Vielzahl von geeigneten Handhabungssystem-Ausführungsbeispielen, die Fachleuten vertraut sind, implementiert werden.
Ein wegwerfbares Teströhrchen, das die zu waschende Zellsuspension enthält, wird um seine Längsmittellinie mit Drehzahlen gedreht, die ausreichen, um die Zellsuspension die Innenwand des Teströhrchens hochzutreiben. Dieser Film, der typischerweise weniger als einen Millimeter dick ist, wird von einem O-Ring nahe dem Ende einer Spindelanordnung, die zum Teströhrchen konzentrisch ist, festgehalten. Der O-Ring überträgt auch ein Drehmoment von der Spindel auf das Teströhrchen, um es zu drehen. Nach einigen Sekunden Drehung wandern die größeren, dichteren Zellen radial zur Innenwand des Teströhrchens unter der Wirkung von Zentrifugalkräften. Zu diesem Zeitpunkt wird ein mit den Zellen kompatibles Waschfluid aus einem externen Aufnahmebehälter zum Boden des Teströhrchens geliefert. Dieses Waschfluid verdrängt das Fluid, das kleinere und weniger dichte Zellen enthält, Zellenabriebteilchen und ungebundene Reagenzien nach oben, durch radiale Durchgänge in der Spindel und durch geeignete Durchgänge in einen externen Abfallaufnahmebehälter nach außen. Das Waschfluid verdrängt und entfernt somit das ungewollte Überstandszellsuspensionsfluid und bewirkt folglich ein Waschen der Zellen. Dieser Prozess fährt fort, bis der gewünschte Zellenwaschgrad erreicht ist. Das Waschfluid und die Abfallfluide können durch geeignete Pumpen bewegt werden, die ein Vakuum innerhalb des Teströhrchens erzeugen können. Beim beschriebenen bevorzugten Ausführungsbeispiel wird eine Pumpe, die ein Vakuum erzeugt, verwendet, da es sich um ein einfaches System handelt und eine leichte Einführung und Entfernung von Luft und Waschfluid ermöglicht. Der ringförmige Ausströmungsdurchgang in der Spindelanordnung weist einen Außendurchmesser auf, der in Verbindung mit dem Teströhrchen-Innendurchmesser die radiale Dicke des Zellsuspensionsfluids festlegt. Das endgültige Suspensionsvolumen kann durch die Enddrehzahl der Spindel gesteuert werden. Wenn die Drehzahl am Ende des Waschzyklus nicht verringert wird, wird das endgültige Suspensionsvolumen durch das ringförmige Volumen zwischen dem Außendurchmesser der Spindel dargestellt. Wenn die Drehzahl der Spindel verringert wird, während weiterhin Waschfluid eingeführt wird, verursacht die Verringerung der Drehzahl, dass das Waschfluid eine Paraboloidform annimmt, wobei somit das endgültige Suspensionsvolumen erhöht wird. Auf diese Weise kann das endgültige Suspensionsvolumen der Probe gesteuert werden.
Nachdem die Zellen angemessen gewaschen sind und das Volumen der erneuten Suspension festgelegt wurde, wird die Waschfluidströmung gestoppt. Dann wird der Antriebsmotor durch mechanisches oder elektrisches Bremsen schnell gestoppt. Das dynamische Bremsen eines Permanentmagnetfeld-Gleichstrommotors wird beim bevorzugten Ausführungsbeispiel verwendet, da es einfach und bequem ist und keine Teile hinzufügt, die verschleißen können. Das schnelle Stoppen der Teströhrchendrehung bewirkt, dass sich das Fluid innerhalb des Teströhrchens weiterhin dreht, was die Zellen an der Teströhrcheninnenwand überspült, was wiederum die Zellen erneut suspendiert. Nicht alle Zellen können durch ein einzelnes schnelles Stoppen der Teströhrchendrehung erneut suspendiert werden, so dass das Teströhrchen mehrere Male gedreht und gestoppt werden kann, um die Zellenrückgewinnungen zu steigern. Die Verwendung eines mit den Zellen kompatiblen Tensids kann auch in dem Waschfluid verwendet werden, um das Kleben der Zellen am Teströhrchen zu verhindern. An diesem Punkt sind das Zellenwaschen und die Zellensuspension abgeschlossen. Das Vakuum innerhalb des Teströhrchens wird aufgehoben und die Spindel wird vom Teströhrchen gelöst. Die Zellenwaschvorrichtung ist dann zum Eingriff mit dem nächsten Teströhrchen zum Waschen bereit.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 ist eine Querschnittsansicht der Zellenwaschvorrichtung, die ein Teströhrchen zeigt, das an der Vorrichtung angebracht ist.
2 ist eine Querschnittsansicht entlang der Linie 2-2 von 1.
3 stellt das Vakuumsystem der vorliegenden Erfindung dar. Diese Figur ist eine erweiterte Ansicht des in 1 gezeigten Gegenstandes 13.
4 stellt das Waschfluid-Zuführungssystem der vorliegenden Erfindung dar. Diese Figur ist eine erweiterte Ansicht des in 1 gezeigten Gegenstandes 14.
5 stellt das Luftzuführungssystem der vorliegenden Erfindung dar. Diese Figur ist eine erweiterte Ansicht des in 1 gezeigten Gegenstandes 30.
Beschreibung von bevorzugten Ausführungsbeispielen: Mit Bezug auf 1 beginnt der Zellenwaschzyklus, wenn das Karussell 29 das Teströhrchen 1, das eine zu waschende Zellsuspension enthält, direkt unter der Zellenwaschvorrichtungsspindel 2 in Position bringt. Das Steuersystem 15 veranlasst dann, dass die Spindel 2 durch ein Stellglied 12 abgesenkt wird. Ein Spindelträger 21 und Führungsstangen 18 im Führungsgehäuse 19 koppeln die lineare Bewegung des Stellgliedes 12 mit der Spindel 2. Die Spindel 2 wird derart abgesenkt, dass ein O-Ring 4 mit der Innenwand des Teströhrchen 1 einen Dichtungskontakt herstellt und das Ende der Spindel 2 in der gewünschten Höhe über dem Boden des Teströhrchens 1 liegt. Durch die Reibung zwischen dem O-Ring 4 und dem Teströhrchen 1 hebt das Stellglied 12 das Teströhrchen 1 um eine kleine Wegstrecke aus dem Karussell 29 heraus. Das Steuersystem 15 veranlasst dann, dass der Motor 6 die Spindel 2 und das Teströhrchen 1 über Zahnräder 31 und 32 mit einer Drehzahl dreht, so dass die Zellsuspension schnell einen ringförmigen Zylinder von Flüssigkeit mit einem Innendurchmesser, der sich bei 9a befindet, bildet. Der O-Ring 4 verhindert, dass sich die Zellsuspension weiter die Innenwand des Teströhrchens 1 hinauf bewegt.
Das Teströhrchen 1 wird für einen Zeitraum gedreht, so dass die größeren, dichteren Zellen in der Suspension mit der Innenwand des Teströhrchens 1 in Kontakt gebracht werden, jedoch nicht zur Reaktion gebrachte Reagenzien und die meisten kleineren, weniger dichten Zellen und Zellenabriebteilchen innerhalb des ringförmigen Zylinders von Flüssigkeit 7 mit dem Innendurchmesser bei 9a bleiben.
Ein normalerweise geschlossenes Magnetventil 35 von 3 wird dann durch das Steuersystem 15 aktiviert, um ein Vakuum mit dem Inneren des Teströhrchens 1 über einen Abflusskanal 5 und Abflussdurchgänge 3 zu verbinden. Flüssigkeit, die kleinere, weniger dichte Zellen, Zellenabriebteilchen und nicht zur Reaktion gebrachte Reagenzien enthält, wird durch die Abflussdurchgänge 3, durch den Abflusskanal 5 nach oben zum Vakuumakkumulator 36, durch die Vakuumpumpe 38 und nach außen in den Abfallaufnahmebehälter 39 gesaugt. Wie in 2 gezeigt, wird der Abflusskanal 5 durch den Innendurchmesser der sich drehenden Spindel 2 und den Außendurchmesser des sich nicht drehenden Lüftungskanalröhrchens 25 gebildet. Eine Abflussflächendichtung 23 dichtet die Oberseite der sich drehenden Spindel 2 am sich nicht drehenden Abflussgehäuse 22 ab.
Luft strömt durch den Filter 57 und den Durchflusswiderstand 56 von 5, durch ein Lüftungsgehäuse 24 und durch den Lüftungskanal 33 nach unten in das Innere des Teströhrchens. Wie in 2 gezeigt, ist der Lüftungskanal 33 durch den Innendurchmesser des sich nicht drehenden Lüftungskanalröhrchens 25 und durch den Außendurchmesser des sich nicht drehenden Waschröhrchenkanals 28 festgelegt. Das Lüftungskanalröhrchen 25 ist an seinem Auslassende durch ein Lager 10 abgestützt und durch eine Dichtung 11 in der Spindel 2 abgedichtet. Der Lüftungskanal 33 ist gegen die Atmosphäre durch eine obere Lüftungskanaldichtung 27 und eine untere Lüftungskanaldichtung 26 abgedichtet.
Die durch den Lüftungskanal 33 strömende Luft ersetzt die Flüssigkeit, die aus dem Teströhrchen 1 über das Vakuumsystem 13 gesaugt wird. Flüssigkeit strömt vom Teströhrchen 1 durch den Abflusskanal 5, bis sich der Innendurchmesser des ringförmigen Zylinders von Flüssigkeit von 9a zu 9b bewegt. An diesem Punkt beginnt das Vakuumsystem 13, Luft, die vom Lüftungskanal 33 geliefert wird, durch die Abflussdurchgänge 3 zu saugen.
Die Luft wird dann in den Abflusskanal 5 und von dort zum Vakuumakkumulator 36 und schließlich zum Abfallaufnahmebehälter 39 gesaugt. Da sehr wenig Druckabfall in den Abflussdurchgängen 3 und im Abflusskanal 5 besteht, nähert sich das Vakuum im Teströhrchen 1 dem Wert im Vakuumakkumulator 36.
Das durch den Durchmesser 9b definierte ringförmige Volumen ist typischerweise die Hälfte bis ein Zehntel des durch den Durchmesser 9a definierten Volumens, was zu einer erwünschten Zunahme der Zellenkonzentration in der gewaschenen Suspension im Vergleich zur anfänglichen ungewaschenen Suspension führt.
Während sich das Teströhrchen 1 dreht und nachdem das ringförmige Volumen im Teströhrchen 1 auf jenes verringert wurde, das durch den Durchmesser 9b definiert ist, wird das Magnetventil 47 von 4 durch das Steuersystem 15 geöffnet, während das Magnetventil 35 von 3 geöffnet bleibt, so dass Waschfluid durch die Vakuumpumpe 38 aus dem Waschfluidaufnahmebehälter 46, durch den Waschfluidkanal 8 und in das Teströhrchen 1 gesaugt wird. Das Waschfluid strömt theoretisch in einem festen Strom von der unteren Spitze des waschfluidkanalröhrchens 28 zum Boden des Teströhrchens 1.
Der Innendurchmesser 9b des ringförmigen Zylinders von Flüssigkeit bewegt sich aufgrund der Zugabe von Waschfluid geringfügig in Richtung der Mitte des Teströhrchens 1. Wenn die Abflussdurchgänge 3 durch die Einwärtsbewegung der Flüssigkeit blockiert werden, erhöht Luft, die durch den Lüftungskanal 33 in das Teströhrchen 1 strömt, den Druck innerhalb des Teströhrchens 1, während das Vakuum innerhalb des Abflusskanals 5 im Wesentlichen konstant bleibt. Dies erzeugt eine Druckdifferenz über den Abflussdurchgängen 3. Wenn eine ausreichende Druckdifferenz über den Abflussdurchgängen 3 erzeugt wird, um den durch die Zentrifugalkraft an der Flüssigkeit in den Abflussdurchgängen 3 erzeugten Druck zu überwinden, strömt die Flüssigkeit durch den Abflusskanal 5 aus. Luft, die von der Luftzuführung 30 geliefert wird, spült somit die Durchgänge 3 und den Abflusskanal 5 von der Flüssigkeit und das Vakuum innerhalb des Teströhrchens 1 nimmt wieder zu. Der Innendurchmesser 9b des ringförmigen Zylinders von Flüssigkeit nimmt aufgrund der Einströmung von Waschfluid wieder ab. Dieser Zyklus wird wiederholt, solange das Waschfluid durch den Waschfluidkanal 8 geliefert wird, ein Vakuum auf den Abflusskanal 5 aufgebracht wird und Luft über den Lüftungskanal 33 strömt.
Das Volumen der Flüssigkeit, das in jedem Zyklus entfernt wird, und die Länge von jedem Zyklus hängen von der Größe des Durchflusswiderstandes 48, der Größe des Durchflusswiderstandes 56, dem Vakuumpegel im Vakuumakkumulator 36 und der Drehzahl der Spindel 2 ab. Um den Vakuumpegel im Vakuumakkumulator 36 zu steuern, stellt ein Vakuumsensor 37 das Vakuum im Vakuumakkumulator 36 fest. Die Vakuumsteuerelektronik 40 vergleicht das Vakuum im Vakuumakkumulator 36 mit einem vorgegebenen Bezugspegel und steuert die zur Vakuumpumpe 38 gelieferte Leistung, um das gewünschte Vakuum aufrechtzuerhalten.
Es ist erwünscht, das Volumen von Flüssigkeit, das zu jedem Zyklus gehört, auf einige Prozent des Volumens des ringförmigen Volumens von Flüssigkeit, das durch den Durchmesser 9b definiert ist, zu begrenzen, um ein exaktes und reproduzierbares Volumen von Flüssigkeit, das im Teströhrchen 1 am Ende des Waschzyklus verbleibt, vorzusehen.
Die Verdünnung von ungebundenem Reagenz durch die vorliegende Erfindung ist nicht durch die Größe des Teströhrchens begrenzt, wohingegen die Verdünnung von ungebundenem Reagenz durch herkömmliche Zentrifugation durch die Größe des Teströhrchens begrenzt ist. Bei der vorliegenden Erfindung wird Fluid, das ungebundenes Reagenz enthält, durch das Waschfluid verdrängt und ein laminares Strömungsgeschwindigkeitsprofil wird innerhalb des Flüssigkeitsrings 7 mit einer Geschwindigkeit von Null an der Teströhrchenwand und einer maximalen Aufwärtsgeschwindigkeit am Innendurchmesser des Rings 9b hergestellt. Beim Fehlen von Diffusion und Mischen ist das einzige ungebundene Reagenz, das nach einem Waschzyklus verbleibt, innerhalb eines keilförmigen Rings enthalten, dessen untere Breite Null ist und dessen obere Breite durch den Abstand zwischen der Innenwand des Teströhrchens 1 und dem Kreis definiert ist, an dem die Aufwärtsgeschwindigkeit gerade ausreicht, um die Abflussdurchgänge 5 während des Waschzyklus zu erreichen.
Wenn die anfängliche Zellsuspension beispielsweise 1,0 ml ist, die endgültige Zellsuspension 0,5 ml ist, Waschfluid mit 1,0 ml/s für 15 s geliefert wird, die Höhe des Rings 7 2,0 cm ist und der Durchmesser des Teströhrchens 1 1,0 cm ist, so beträgt die mittlere Aufwärtsgeschwindigkeit des Fluids 4,0 cm/s. An einem Punkt 0,00125 cm von der Teströhrchenwand beträgt die Geschwindigkeit 0,13 cm/s, welches die minimale Geschwindigkeit ist, die erforderlich ist, um die Abflussdurchgänge während des Waschzyklus zu erreichen. Das Fluidvolumen, das in diesem keilförmigen Ring enthalten ist, ist 0,0039 ml, daher ist die Verdünnung des ungebundenen Reagenz durch die vorliegende Erfindung 120x und der Zellenkonzentrationsfaktor ist 2x. Mit herkömmlicher Zentrifugation mit demselben Anfangsvolumen von 1,0 ml und Endvolumen von 0,5 ml und unter der Annahme eines restlichen Volumens von 0,1 ml von Flüssigkeit nach der Zentrifugation und Entfernung des Überstands ist die Verdünnung nur 5x und der Zellenkonzentrationsfaktor ist 2x.
Nachdem ausreichend Waschzeit abgelaufen ist, kann die Drehzahl der Spindel 2 verringert werden, um das endgültige Suspensionsvolumen der Probe zu erhöhen. Bei verringerten Drehzahlen ändert das Suspensionsvolumen die Form von einem Ring mit zylindrischen Innen- und Außenwänden zu einem Ring mit einer zylindrischen Außenwand und einer parabolischen Innenwand. Waschfluid wird während dieses Zeitraums weiterhin eingeleitet.
Nachdem ausreichend Waschzeit abgelaufen ist, wird das Magnetventil 47 von 4 geschlossen und die Waschfluidströmung wird angehalten. Das Magnetventil 49 wird dann kurz geöffnet, um Luft in das Teströhrchen 1 durch den Filter 60, den Durchflusswiderstand 50 und den Waschfluidkanal 8 eintreten zu lassen, um den Waschfluidkanal 8 vom Waschfluid zu spülen. Der Motor 6 wird dann durch die Systemsteuereinheit 15 schnell gestoppt. Da der Fluidring 7 sich weiterhin relativ zur Teströhrchenwand dreht, werden Zellen an der Wand des Teströhrchens 1 von der Wand gespült und werden dadurch erneut suspendiert. Ein geeignetes Tensid im Waschfluid kann die Anhaftung von Zellen an der Innenwand des Teströhrchens 1 verringern und bei der erneuten Suspension von Zellen unterstützen. Außerdem kann der Motor 6 dann einmal oder mehrere Male schnell beschleunigt und abgebremst werden, um die Zellen vollständiger von der Innenwand des Teströhrchens 1 zu entfernen. Der Motor 6 wird dann gestoppt, das Magnetventil 35 wird geschlossen. Das Stellglied 12 hebt dann die Spindel 2 über den Spindelträger 21 an. Wenn die Spindel 2 angehoben wird, hält das Halteelement 17 das Teströhrchen 1 nach unten, um es von der Spindel 2 zu trennen. Bevor die Spindel 2 vollständig vom Teströhrchen 1 entfernt ist, kann die Spindel mit einer geringen Drehzahl gedreht werden, um jegliche Flüssigkeit zu entfernen, die am unteren Ende der Spindel haften kann. Dies fördert mehr Fluid- und Zellenrückgewinnung und verringert die Probenüberführungseffekte. Nachdem die Spindel 2 vollständig vom Teströhrchen 1 gelöst ist, wird das Karussell 29 gedreht, um ein weiteres Teströhrchen zum Zellenwaschen in Position zu bringen.

Claims

Vorrichtung zum Waschen von Zellsuspensionen innerhalb eines Teströhrchens (1) mit einer Innenfläche und einer Symmetrieachse, aufweisend: einen Rahmen (21); ein Drehmittel (6, 31, 32) zum Drehen des Teströhrchens (1) um die Symmetrieachse; und ein Waschmittel (3, 5, 8) sowohl zum Zugeben einer Waschlösung zur Zellsuspension in dem Teströhrchen (1) als auch zum Entfernen von überschüssiger Waschlösung und Abfall aus der im Teströhrchen (1) befindlichen Zellsuspension während der Drehung des Teströhrchens um die Achse; gekennzeichnet durch ein drehbar an dem Rahmen (21) angeordnetes Stopfenmittel (2, 4) zum Reibungseingriff mit der Teströhrchen-Innenfläche, der ausreicht, um das Teströhrchen (1) zu drehen; wobei das Drehmittel (6, 31, 32) das Teströhrchen mittels des Stopfenmittels (2, 4) dreht, und wobei das Waschmittel (3, 5, 8) innerhalb des Stopfenmittels (2, 4) angeordnet ist.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Achse vertikal ist und die Vorrichtung so ausgelegt ist, dass das Teströhrchen (1) an die Vorrichtung in einem Karussell (29) oder Gestell übergeben wird, und wobei die Vorrichtung ferner ein Einsetz- und Entnahmemittel (12, 18) zum Einsetzen und Herausnehmen des Stopfenmittels (2, 4) in das und aus dem Teströhrchen (1) aufweist, wenn das Teströhrchen so übergeben wird, und wobei das Einsetz- und Entnahmemittel (12, 18) ferner ein Halteelement (17) zum Festhalten des Teströhrchens in seiner Position, wenn das Einsetz- und Entnahmemittel (12, 18) das Stopfenmittel (2, 4) aus dem Teströhrchen herausnimmt, umfasst, und wobei das Einsetz- und Entnahmemittel ein lineares Stellglied (12) und eine Führung (18) umfasst, die am Rahmen (21) angeordnet sind, um eine vertikale Bewegung des Rahmens vorzusehen, um für das Einsetzen und Entnehmen des Stopfenmittels (2, 4) in das und aus dem Teströhrchen (1) zu sorgen.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei das Stopfenmittel (2, 4) ferner einen O-Ring (4) aufweist, der in einem O-Ring-Sitz am Umfang des Stopfenmittels angeordnet ist, um einen Reibungsgriff mit der Innenfläche des Teströhrchens (1) vorzusehen, der zum Abstützen und zur Drehung des Teströhrchens ausreicht, und wobei das Stopfenmittel (2, 4) ein drehbares Spindelanordnungsmittel (2) zum Drehen des Stopfenmittels und des abgestützten Teströhrchens aufweist, wobei das drehbare Spindelanordnungsmittel (2) eine ringförmige Wand mit einem Innendurchmesser aufweist, und wobei das Waschmittel (3, 5, 8) ein Waschlösungseinführungs- und -entfernungsmittel aufweist, wobei das Waschlösungseinführungs- und -entfernungsmittel zwei koaxiale Röhrchen (5, 8) aufweist, die in dem Spindelanordnungsmittel (2) angeordnet sind und einen kreisförmigen und zwei ringförmige Kanäle (5, 8, 33) bilden, ein erstes, festes, inneres Waschfluid-Eingangsröhrchen (8), das einen kreisförmigen Waschlösungs-Eingangskanal zum Leiten einer Waschlösung durch das Stopfenmittel (2, 4) in das Teströhrchen bildet, ein zweites, zwischenliegendes, festes Lüftungsröhrchen (33), das zum inneren Waschfluid-Eingangsröhrchen (8) konzentrisch ist und einen ringförmigen Lüftungskanal zum Leiten eines steuerbaren Luftdurchflusses durch das Stopfenmittel (2, 4) in das Teströhrchen vorsieht, und ein dritter, ringförmiger, äußerer Entsorgungskanal (5), der eine feste Innenwand des Lüftungsröhrchens aufweist, und wobei der Innendurchmesser des drehbaren Spindelanordnungsmittels (2) eine drehbare Außenwand bereitstellt und wobei das Spindelanordnungsmittel (2) ferner eine Spindellager- und Dichtungsanordnung aufweist, die zwischen dem zweiten, zwischenliegenden, festen Lüftungsröhrchen (33) und der drehbaren ringförmigen Wand mit Innendurchmesser des Spindelanordnungsmittels (2) angeordnet ist, um das zweite, zwischenliegende, feste Lüftungsröhrchen (33) abzustützen und anzuordnen, und wobei das Spindelanordnungsmittel (2) Austrittsdurchgänge (3) umfasst, die sich an einem vorbestimmten Außendurchmesser des Spindelanordnungsmittels (2) befinden, so dass, wenn das Teströhrchen gedreht wird und ein Vakuum auf die Austrittsdurchgänge (3) aufgebracht wird, überschüssiges Waschfluid, das biologischen Abfall enthalten kann, durch die Austrittsdurchgänge (3) ausströmt und ein festes reproduzierbares Volumen an Waschfluid, das die Zellsuspension enthält, in einem zylindrischen Ring gehalten wird, der zwischen dem Innenwanddurchmesser des Teströhrchens (1) und dem vorbestimmten Außendurchmesser des Spindelanordnungsmittels, wo die Austrittsdurchgänge (3) angeordnet sind, liegt und durch diese festgelegt ist, wobei der dritte ringförmige äußere Entsorgungskanal mit den Austrittsdurchgängen (3) in Fluidverbindung steht, um überschüssige Wasch- und biologische Abfallflüssigkeit aus dem Teströhrchen (1) zu entfernen.
Vorrichtung nach Anspruch 3, welche ferner ein Vakuummittel (38) umfasst, das in Fluidverbindung mit dem dritten ringförmigen, äußeren Entsorgungskanal (5) des Waschlösungseinführungs- und -entfernungsmittels angeordnet ist, um die Waschlösung aus dem Teströhrchen (1) zu einem externen Aufnahmebehälter (39) zu entfernen und um ein Vakuum innerhalb des Teströhrchens zu erzeugen, das bewirkt, dass Waschlösung in das Teströhrchen (1) durch das Waschfluid-Eingangsröhrchen (8) gesaugt wird, wobei das ringförmige Lüftungsröhrchen (33) eine steuerbare Luftströmung in das Teströhrchen (1) und durch den Entsorgungskanal (5) heraus vorsieht, um die Strömung von Flüssigkeit durch die Austrittsdurchgänge (3) zu unterstützen.
Verfahren zum Waschen einer zellulären Teilchensuspension innerhalb eines Teströhrchens, das eine Innenfläche und eine Symmetrieachse aufweist, mit den Schritten: a) Drehen des Teströhrchens (1) und der Teilchensuspension um die Symmetrieachse; b) Zugeben einer Waschlösung zu der Teilchensuspension innerhalb des Teströhrchens (1) während der Drehung des Teströhrchens um die Symmetrieachse; und c) Entfernen der überschüssigen Waschlösung und des Abfalls aus dem Teströhrchen (1) während der Drehung des Teströhrchens um die Symmetrieachse; dadurch gekennzeichnet, dass es ferner den vorherigen Schritt umfasst: d) Reibungseingriff mit dem Teströhrchen, der ausreicht, um das Teströhrchen (1) zu drehen, indem ein Stopfenmittel (2, 4) an die Innenfläche des Teströhrchens gesetzt wird und mit dieser in Reibungseingriff kommt, welcher ausreicht, um das Teströhrchen zu drehen, und wobei Schritt a), Drehen des Teströhrchens und der Teilchensuspension um die Symmetrieachse, die vorherigen Schritte umfasst: e) drehbares Anordnen des Stopfenmittels (2, 4) an einem Rahmen (21) und f) dann Drehen des Stopfenmittels (2, 4) und des durch Reibung befestigten Teströhrchens (1).
Verfahren zum Waschen einer zellulären Teilchensuspension nach Anspruch 5, wobei Schritt d), Setzen eines Stopfenmittels an die Innenfläche des Teströhrchens und Reibungseingriff mit dieser, der ausreicht, um das Teströhrchen zu drehen, den vorherigen Schritt umfasst: g) Übergeben des Teströhrchens (1) an das Stopfenmittel (2, 4) in einem Karussell (29) oder Gestell; und wobei im Anschluss an Schritt c), Entfernen der überschüssigen Waschlösung und des Abfalls aus dem Teströhrchen während der Drehung des Teströhrchens um die Symmetrieachse, ferner den Schritt des Herausziehens des Stopfenmittels (2, 4) aus dem Teströhrchen (1) aufweist.
Verfahren zum Waschen einer zellulären Teilchensuspension nach Anspruch 5, wobei die Teilchensuspension größere, sich schnell absetzende Teilchen aufweist, die mit kleineren, sich langsamer absetzenden Teilchen in einer Suspensionsflüssigkeit suspendiert sind, und wobei Schritt a), Drehen des Teströhrchens (1) und der Teilchensuspension um die Symmetrieachse, die Schritte des Drehens des Teströhrchens mit einer vorbestimmten Kombination aus Zeit und Umdrehungen pro Minute umfasst, um eine Zentrifugalkraft vorzusehen, die die dichteren, sich schnell absetzenden Teilchen innerhalb der Suspensionsflüssigkeit zur Teströhrcheninnenfläche lenkt, so dass diese der Innenfläche benachbart sind, während die leichteren, sich langsamer absetzenden Teilchen im Wesentlichen innerhalb des Inneren der Suspensionsflüssigkeit innerhalb des Teströhrchens bleiben; und dann ferner die anschließenden Schritte aufweist: h) schnelles Stoppen der Drehung des Teströhrchens, um eine erneute Suspension der dichteren, sich schnell absetzenden Teilchen innerhalb der Suspensionsflüssigkeit durch eine Spülwirkung der sich drehenden Suspensionsflüssigkeit vorzusehen, die die dichteren, sich schnell absetzenden Teilchen von der Innenfläche des Teströhrchens weglenkt; i) Festhalten des Teströhrchens (1) an seiner Position; während j) das Stopfenmittel (2, 4) vom Reibungskontakt mit der Innenfläche des Teströhrchens gelöst wird; und k) das Stopfenmittel (2, 4) aus dem Teströhrchen (1) herausgezogen wird.
Verfahren zum Waschen einer zellulären Teilchensuspension nach Anspruch 7, wobei der Schritt c), Entfernen der überschüssigen Waschlösung und des Abfalls aus dem Teströhrchen (1) während der Drehung des Teströhrchens um die Symmetrieachse die Schritte aufweist: l) Anordnen von Austrittsdurchgängen (3) an einer vorbestimmten radialen Stelle innerhalb des Teströhrchens; und m) Anlegen eines Vakuums an die Austrittsdurchgänge, um zuerst zu bewirken, dass Waschlösung in das Teströhrchen gesaugt wird, und dann Entziehen von überschüssiger Waschlösung und Abfall aus dem Teströhrchen an der radialen Stelle der Austrittsdurchgänge, um ein festes, reproduzierbares Volumen an Waschfluid, das die Teilchensuspension/Zellsuspension enthält, vorzusehen, das in einem zylindrischen Ring gehalten wird, der sich zwischen dem Innenwandflächendurchmesser des Teströhrchens und der radialen Stelle der Austrittsdurchgänge befindet und durch diese festgelegt ist; n) Verbinden der Austrittsdurchgänge mit einem Entsorgungskanal (5), um die überschüssige Abfalllösung und biologische Abfallflüssigkeit aus dem Teströhrchen zu entfernen; o) Lüften des Teströhrchens (1) mittels eines ringförmigen Lüftungskanals, um eine steuerbare Strömung von Luft in das Teströhrchen und durch den Abfall/Waschlösungs-Entleerungskanal heraus vorzusehen, um die Strömung von Flüssigkeit durch die Austrittsdurchgänge zu unterstützen.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei Schritt a) die Schritte aufweist: p) Anordnen eines Aufnahmebehälters am Stopfenmittel (2, 4) derart, dass die ganze verunreinigte Teilchensuspension und ein im Wesentlichen größeres Luftvolumen gespeichert werden können; und wobei Schritt c) die Schritte aufweist: q) Fließenlassen der nicht-verunreinigten Flüssigkeit über die Teilchen und Verdrängen der verunreinigten Flüssigkeit in Richtung des Stopfenmittels; r) Entfernen der verunreinigten Flüssigkeit aus dem Aufnahmebehälter durch geeignete Kanäle im Stopfenmittel mittels eines geeigneten Pumpmittels; s) Liefern der entfernten verunreinigten Flüssigkeit zu einem geeigneten Abfallbehälter oder einer geeigneten Stelle; wobei das Verfahren ferner die Schritte aufweist: t) Stoppen der Strömung von nicht-verunreinigter Flüssigkeit in den Aufnahmebehälter und Stoppen der Strömung von verunreinigter Flüssigkeit aus dem Aufnahmebehälter, was dazu führt, dass ein vorbestimmtes Volumen von nicht-verunreinigter Flüssigkeit und der Teilchen im Aufnahmebehälter verbleiben; und u) erneutes Suspendieren der Teilchen im Aufnahmebehälter mit der nicht-verunreinigten Flüssigkeit mittels eines Mischmittels, vorzugsweise durch schnelles Stoppen der Drehung des Aufnahmebehälters, was dazu führt, dass die sich noch drehende Flüssigkeit die Teilchen von den Oberflächen des sich nicht-drehenden Aufnahmebehälters abspült.