EP0800867A1 - Verfahren zur zentrifugationstechnischen Durchführung von Partikeltrennungen, insbesondere auf biologischem Sektor - Google Patents

Verfahren zur zentrifugationstechnischen Durchführung von Partikeltrennungen, insbesondere auf biologischem Sektor Download PDF

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EP0800867A1
EP0800867A1 EP97104626A EP97104626A EP0800867A1 EP 0800867 A1 EP0800867 A1 EP 0800867A1 EP 97104626 A EP97104626 A EP 97104626A EP 97104626 A EP97104626 A EP 97104626A EP 0800867 A1 EP0800867 A1 EP 0800867A1
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EP
European Patent Office
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cannula
container
centrifuge
centrifuge container
gradient solution
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Withdrawn
Application number
EP97104626A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Stephan Prof.Dr.Rer.Nat. Dr.Med.Habil Nees
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Original Assignee
Individual
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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B04—CENTRIFUGAL APPARATUS OR MACHINES FOR CARRYING-OUT PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES
    • B04B—CENTRIFUGES
    • B04B13/00—Control arrangements specially designed for centrifuges; Programme control of centrifuges
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B04—CENTRIFUGAL APPARATUS OR MACHINES FOR CARRYING-OUT PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES
    • B04B—CENTRIFUGES
    • B04B5/00—Other centrifuges
    • B04B5/04—Radial chamber apparatus for separating predominantly liquid mixtures, e.g. butyrometers
    • B04B5/0442—Radial chamber apparatus for separating predominantly liquid mixtures, e.g. butyrometers with means for adding or withdrawing liquid substances during the centrifugation, e.g. continuous centrifugation
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/11—Automated chemical analysis
    • Y10T436/111666—Utilizing a centrifuge or compartmented rotor

Definitions

  • the invention relates to a method for the centrifugation-related implementation of particle separations according to the preamble of patent claim 1.
  • cell-specific antibodies are often extremely species-specific (and therefore often not available) and are also very expensive.
  • the evaluability of antigenic structures does not meet the requirements for successful cell separation also quickly to insurmountable limits if they are to be used for the separation of cell types - which are not in a physiological suspension like the cells of the blood, but are initially firmly connected to one another in commercial types.
  • the first task of these media is to stabilize the desired cell separations against thermal convection and mechanical vibration.
  • the cells are separated in an increasingly dense, but relatively flat continuous or step-shaped gradient of the selected separation medium in the sedimentation direction (various products on the market, e.g. Ficoll, Metrizamid, Percoll etc.), so that none of the cell types has an isopycnic ( density range corresponding to their own specific density). As a consequence, all cell types would collect again at the bottom of the separation vessel if the centrifugation were not interrupted in time. Separation occurs primarily due to the different size of the cell types (see formula above).
  • a density gradient is filled in which also contains areas of the same specific density as that of the cells. If a cell type reaches the "isopyknic" region of the gradient, its sedimentation rate drops to zero (see formula above) and cells of different specific weights separate in the gradient if its profile in the centrifuge tube has a suitable spatial profile. Depending on the separation problem, it is better to fill in linear, or convex, or concave gradients.
  • DE-OS 34 04 236 shows the construction of a rotor suitable for such cell separations, which allows the briefly described centrifugation methods to be exploited in that the interior of the separation vessel remains accessible during the entire ongoing centrifugation and the gradient via a corresponding cannula can be suctioned off.
  • An additional advantage is the autoclavability of the entire rotor, thereby creating the conditions for sterile (aseptic) work and possibly subsequent, long-term cultivation of the separated cells in the tissue laboratory.
  • the object of the present invention is to provide a method for centrifugation in which an optimal selectivity can be achieved and damage to the particle fractionation is avoided.
  • the invention advantageously also creates a completely new centrifugation method combining the two basic centrifugal techniques explained above, wherein a liquid flow can also be used for the separation.
  • the unfavorable influence of the Coriolis forces is minimized by a continuously conical centrifuge container.
  • the inside is coated hydrophobically, eg siliconized using standard processes.
  • Teflon or polycarbonate is recommended as the wall material.
  • the hydrophobic inner wall layers lead to the hydrophilic cells being repelled and preventing their direct wall contact.
  • An airtight sealable double cannula advantageously allows the introduction of a central cannula as in the previously known rotor type, but also creates a second gas and liquid sealable access to the separation vessel.
  • a pressure medium can be introduced at the end of the separation process and the gradient can thus be expressed via the central cannula and fractionated with the aid of a fraction collector, which is also part of the optimal equipment of this centrifuge system.
  • This fractionation technique allows for the perfect maintenance of the cell separations, which are optimally widely separated in the conically thinning centrifuge tube, in the course of the gradient fractionation supported by the almost punctiform removal.
  • the centrifugation method according to the invention immediately brings into play several typical cell parameters for the separation process and results in separations that can no longer be increased.
  • the sample is inserted into the centrifuge container via the inner central cannula. It is expediently brought to a specific density with gradient medium which is just above that of the lightest cell type in the mixture. During the further centrifugation, this therefore already floats in the pure form as the uppermost band.
  • both an electronically continuously adjustable pump device and a centrifuge device are used in combination with the newly developed rotor, both devices can therefore also be programmed to be coordinated. If, now, under program control, pumping in the gradient, which is usually mixed from two solutions, two forces act on the cell mixture to be separated, the centrifugal force and the flow force. At this stage of centrifugation, the former leads primarily to the separation of cells due to their different cell diameters and specific densities, the latter primarily detects bulky cells or aggregates, while compact, heavy single cells are hardly affected.
  • the direction of migration of the cells can be influenced in a targeted manner by changing the osmolarity of the gradient medium quickly by adding appropriate salt concentrations via the program (erythrocytes shrink, e.g. rapidly in hypertonic media and thus gain a greater specific weight and therefore sediment more quickly).
  • Program-controlled density gradient ranges can also soon be filled in such that certain cell types of the initial sample reach a range which is isopycnic for them and then remain in accordance with the formula given above. Other Cell types may move further under the given conditions and only collect in gradient areas further away from the centrifuge axis.
  • the speed of the pump device or centrifuge rotation which can be adjusted with each cell mixture, enables cell separations of unprecedented sharpness and in the shortest possible time (sometimes only in a few minutes). This can be crucial for the vitality of biological preparations.
  • the process described is also extremely adaptable and cheap.
  • FIG. 3 shows a device for performing the present method.
  • This device essentially comprises a first container 10 for a denser gradient solution, a second container 9 for a comparatively thinner gradient solution, one Pump device 12, a centrifuge device 30, which will be explained in more detail later, and a computing device 90.
  • a centrifuge container 1 is held and rotated, which has the tapered or conical shape shown in FIG which prevents the action of Coriolis forces.
  • the specially conical shape means that the fractions can be separated better in the area of the syringe 51 of the central cannula 5 because the individual fractions are pulled apart at the tip 51 in the area of the small diameter.
  • the central cannula 5 which runs along the axis of the centrifuge container 1, projects into the interior of the centrifuge container 1 in such a way that its free end 51 ends immediately in front of the tip 1 ′ of the conical centrifuge container 1.
  • the entire end 51 is preferably pointed as shown in Figure 4.
  • a further cannula 17 also projects into the centrifuge container 1 at a location outside the longitudinal axis thereof, which ends approximately at the end of the centrifuge container 1 closed by a cover part 31.
  • the computing device 90 is connected via lines 91 and 92 to the pump device 12 and the centrifuge device 30, so that these can be controlled with regard to the delivery rate or the speed by a program stored in the computing device 90.
  • the device described is used in the following manner.
  • a gradient solution of a desired density is produced.
  • a denser gradient solution 13 in which a thinner gradient solution 14 is located, is introduced from the first container 10 via the line 11 with the help of the pump device 12 into the second container 9 .
  • the introduced thicker gradient solution 13 and the thinner gradient solution 14 located in the container 9 are continuously mixed until a desired degree of density is achieved.
  • the mixed gradient solution 7 of the desired tightness is introduced via the line 16 into the interior of the centrifuge container 1 in the region of the tip 1 'thereof via the line 16 with the help of the pump device 12.
  • the sample 26 to be fractionated is already in the area of the tip 1 ′ in the container 1, since the gradient layering takes place after the introduction of the sample 26.
  • the gradient solution 7 is introduced, the sample 26 is displaced in the direction of the arrow 40 against the centrifugal force 41. wherein the cell particles of the sample 26 migrate into the gradient solution 7.
  • the gradient solution 7 can be computer-controlled continuously varied with regard to its density so that the density increases continuously or stepwise to a precisely predetermined extent.
  • fractionation is achieved by the processes of equilibrium centrifugation which take place during the centrifugation, in which the particles of sample 26 migrate until they reach the gradient density corresponding to them, and sedimentation centrifugation, in which the cell particles of sample 26 in Depending on their shape and / or size and / or aggregation into different particle zones (bands) can be separated.
  • the conicity of the centrifuge container 1 prevents the resulting fractions from being smeared as a result of the Coriolis force occurring, since their effects are not relevant to the small container diameters achieved by the taper.
  • the fraction separation can be designed to an extent not previously achieved.
  • pressure medium preferably compressed air
  • the central cannula 5 preferably branches off via a T-piece 81 to a then opened hose clamp 80 or another closure, so that the fractions can be removed via the line 83.
  • the feed lines 18 for the central cannula 5 and 16 for the further cannula 17 are preferably coaxial arranged to each other in the form of a double cannula. Both lines 16 and 18 run, the line 18 being inside the line 16, first through an upper plate 19, in the center of which there is a bore 41 through which the double cannula runs. Below the plate 19, which is preferably made of steel, there is a sealing washer 20 for the outer line 16, which is preferably made of silicone rubber. The end of the line 16 ends in a central bore 20 'of the sealing washer 20. Below the sealing washer 20 there is another plate 21, which is preferably made of steel and through whose bore 25 the inner conduit 18 runs.
  • the end of the line 16, which is sealed by the sealing washer 20, is therefore tightly connected to the bore 25, which in turn is connected to the cannula 17 via a passage 23 running radially in the plate 21.
  • the line 18 running through the bore 25 provisionally through a central bore 22 'of a further sealing washer 22, which preferably also consists of silicone rubber and seals the line 18 on its outer circumference.
  • the sealing disk 22 is preferably made of a softer silicone rubber than the sealing disk 20.
  • silicone rubber is particularly advantageous as a material for the sealing disks 20 and 22 mentioned, because the wear on the outer circumferences of the lines 16 and 18, respectively, is minimal when the centrifuge device 30 is rotated.
  • the silicone rubber sealing disks 20 and 22 can be replaced particularly easily after wear by simply unscrewing the screw 54 and removing the plates 19 and 21.
  • Different central cannulas 5 can preferably be coupled to the passage 52 via a sealed screw connection 56.
  • the non-rotating double cannula 16, 18 can expediently be removed with the centrifuge device 30 running will. This allows extremely high speeds to be achieved without abrasion on the seals, in which sub-cellular particles can also be fractionated.
  • the double cannula is reinserted for the purpose of later gradient extraction at lower speeds.
  • the above-mentioned lid part 31 of the centrifuge container 1 can be realized in that the container edge 1 ′′ is pressed against a sealing ring 32, which is contained in a recess 33 in the rotor body 50.
  • the passage of the rotor body 50 forming the further cannula 17 leads to the bottom of the recess 33 within the sealing ring 32 and the central cannula 5 is fastened to the rotor body 50 with the aid of the screw connection 56 already mentioned.
  • a centrifuge container 1 is preferably used, the length of which from the tip 1 ′ to the opening is approximately 10 to 15 cm and the opening has a diameter of approximately 3 to 8 cm.
  • 96% of blood consists mainly of erythrocytes.
  • the cleaning of the granulocytes by centrifugation is therefore an extreme example, which is made even more difficult by the fact that erythrocytes are the heaviest blood cells. So they migrate furthest in their own density gradients and must therefore be eluted as the first (completely overloaded) gang.
  • the second example is intended to make it clear that such a separation efficiency of centrifugal methodology can also be used for cell mixtures which first have to be removed from native organs by complex proteolytic dissociation processes.
  • the concrete example is the difficult task of completely separating the extremely numerous and multidisperse microvessels in the heart muscle with accompanying cells from the heart muscle cells (cardiomyocytes).
  • the cardiomyocytes have a cell-specific metabolism, which can only be properly understood if they are shown completely.

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  • Centrifugal Separators (AREA)

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur zentrifugationstechnischen Durchführung von Partikeltrennungen, insbesondere auf biologischem Sektor, bei dem in einen Zentrifugenbehälter (1) eine zu fraktionierende Probe (26) über eine Kanüle (5) eingebracht wird, die mit ihrem freien Ende (51) zur Minimierung unerwünschter Auswirkungen der Corioliskraft zur Spitze (1') eines sich zur Spitze (1') hin stark verjüngenden Zentrifugenbehälters (1) verläuft, wobei über die Kanüle (5) nachfolgend eine Gradientenlösung (7) mit sich zunehmend kontinuierlich oder stufenweise vergrößernder Dichte eingebracht wird, wobei aus der Probe (26) Partikel durch die Wirkung der Gleichgewichts- und/oder Sedimentationszentrifugation in die Gradientenlösung (7) wandern und wobei nach einer vorbestimmten Zentrifugationszeit über eine weitere Kanüle (17) ein Druckfluid in das Innere des verschlossenen Zentrifugenbehälters (1) eingebracht wird, um die die fraktionierten Partikel der Probe (26) enthaltende Gradientenlösung (7) über die Kanüle (5) auszubringen. <IMAGE>

Description

  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur zentrifugationstechnischen Durchführung von Partikeltrennungen nach dem Oberbegriff des Patentanspruches 1.
  • Längst hat sich die Erforschung von Organfunktionen auf zellulärer Ebene enorm verbreitet. Im Zentrum der physiologischen Grundlagenforschung steht heute die Beschreibung spezifischer Funktionen differenzierter und spezialisierter Zelltypen, die die einzelnen Gewebearten bilden und im Zusammenwirken schließlich die zentralen Aufgaben der Körperorgane bedingen.
  • Die wichtigste Voraussetzung für die weitere Entwicklung dieser wichtigen Forschungsrichtung ist die Verfügbarkeit immer effizienterer Zelltrennungsmethoden. Dafür scheinen sich heute zunächst einmal vielversprechende immunologische Trennverfahren anzubieten. Deren Grundlage ist stets die Expression typischer zellulärer Antigene, die mit Hilfe hochspezifischer Antikörper erkannt und schließlich für die Trennung ausgenützt werden. Werden die Antikörper z.B. auf magnetischen Körnchen verankert, so kann es über diese Proteine auch zur Bindung der Zellen an die Partikel kommen. Im Idealfall läßt sich dieser Vorgang mit Hilfe eines Magneten auf bestechend einfache Weise für die Abtrennung der gebundenen Zeilen auswerten.
  • Zellspezifische Antikörper sind aber oft auch extrem speziespezifisch (und daher oft nicht verfügbar) und außerdem sehr teuer. Abgesehen von diesen in der Praxis oft entscheidenden Limitationen stößt die Auswertbarkeit antigener Strukturen für erfolgreiche Zelltrennungen aber auch immer dann rasch auf unüberwindbare Grenzen, wenn sie für die Separation von Zellarten - die nicht etwa wie die Zellen des Blutes in einer physiologischen Suspension vorliegen, sondern in Gewerbearten zunächst fest miteinander verbunden sind - herangezogen werden sollen.
  • Denn die wichtigste Vorbedingung dafür ist zunächst die komplette Dissoziation und Suspendierung solcher Zellen aus dem nativen Gewebeverband. Dies kann nur durch Einwirkung komplexer proteolytischer Gemische erreicht werden, die während ihres Angriffs unvermeidbarerweise auch das Antigenmuster der Gewebezellen substantiell verändern können. Bei der Proteolyse oft abgelöste bzw. maskierte oder auch unspezifisch neu entfaltete oder exprimierte Antigene machen das anschließende immunologische Trennverfahren rasch ineffizient und zahlreiche Fremdzellen schleichen sich typischerweise in die schließlich erhaltene Suspension der "gereinigten" Zielzellart ein. Zur Zeit erleben wir eine Inflation entsprechend falscher Mitteilungen in der Fachliteratur.
  • Wesentlich zuverlassiger als immunologisch erkennbare Zelleigenschaften überstehen bestimmte physikalische bzw. physikalisch-chemische Zellmerkmale die Einwirkung der Proteasen. Dazu gehören die Größe, Form und Aggregabilität der Zellen auf der einen Seite und ihr spezifisches Gewicht, das unter gegebenen physiologischen Bedingungen sehr von der Ionen- und Wasserpermeabilität ihrer Zellmembranen bzw. von dem in ihnen vorliegenden osmotischen Druck abhängt, auf der anderen Seite. Jede dieser physikalischen bzw. physikalisch-chemischen Größen kann als Trennparameter für eine erfolgreiche Zellseparation eingesetzt werden, wenn die Zellen in das Schwerefeld einer geeigneten Zentrifuge eingebracht werden. Üblicherweise erfolgt die Zellseparation in Zentrifugengefäßen in Flüssigmedien bestimmter Dichte, die auch als sogenannte "diskontinuierlich oder kontinuierliche Dichtegradienten" eingeschichtet werden. Diese Medien haben zunächst die Aufgabe, die angestrebten Zelltrennungen gegen thermische Konvektion und mechanische Vibration zu stabilisieren. Die Sedimentationsgeschwindigkeit v hängt von dem folgenden formelmäßigen Zusammenhang ab v = d 2 (ρ Z - ρ M ) 18 µ · ω 2 · r
    Figure imgb0001
     wobei d den Zellradius, ρZ bzw. ρM die spezifische Dichte der Zellen bzw. des Mediums, µ die Viskosität des Trennmediums, ω die Winkelgeschwindigkeit und r den Rotorradius bezeichnen.
  • Auf dieser Grundlage werden bis heute bei Zentrifugationsverfahren grundsätzlich wahlweise, aber nicht mit aller Konsequenz kombinierbar die folgenden zwei Techniken ausgeübt:
    • 1. "Zonenzentrifugationen"
  • Hierbei erfolgt die Trennung der Zellen in einem in Sedimentationsrichtung immer dichter werdenden, aber doch relativ flachen kontinuierlichen oder stufenförmigen Gradienten des ausgewählten Trennmediums (verschiedene Produkte auf dem Markt, z.B. Ficoll, Metrizamid, Percoll etc.), so daß keine der Zellarten einen isopyknischen (ihrer eigenen spezifischen Dichte entsprechenden) Dichtebereich auffinden kann. Als Konsequenz würden sich alle Zellarten am Boden des Separationsgefäßes wieder ansammeln, falls die Zentrifugation nicht rechtzeitig unterbrochen würde. Eine Trennung erfolgt vor allem auf Grund der unterschiedlichen Größe der Zellarten (siehe obige Formel).
    • 2. "Isopyknische Zentrifugationen"
  • In diesen Fällen wird ein Dichtegradient eingefüllt, der auch Bereiche gleicher spezifischer Dichte wie die der Zellen enthält. Erreicht eine Zellart den für sie "isopyknischen" Bereich des Gradienten, geht ihre Sedimentationsgeschwindigkeit gegen Null (siehe obige Formel) und Zellen verschiedenen spezifischen Gewichts trennen sich dann im Gradienten, wenn dessen Profil im Zentrifugengefäß einen geeigneten räumlichen Verlauf hat. Je nach Trennproblem werden besser lineare, oder konvexe, oder konkave Gradienten eingefüllt.
  • Aus der DE-OS 34 04 236 geht die Konstruktion eines für derartige Zellseparationen geeigneten Rotors hervor, der es gestattet, die kurz geschilderten Zentrifugationsmethoden auch dadurch auszunützen, daß das Innere des Separationsgefäßes während der gesamten laufenden Zentrifugation zugänglich bleibt und der Gradient über eine entsprechende Kanüle abgesaugt werden kann. Ein zusätzlicher Vorteil ist auch die Autoklavierbarkeit des gesamten Rotors und dadurch die Schaffung von Voraussetzungen zum sterilen (aseptischen) Arbeiten und eine sich eventuell anschließende, langfristige Kultivation der getrennten Zellen im Gewebelabor.
  • Die jahrelange Erfahrung mit diesem Rotor hat bewahrenswerte, konstruktive Merkmale deutlich gemacht, aber auch die folgenden Probleme und Einschränkungen dieser Konstruktion aufgezeigt:
    • a) In den Zentrifugengefäßen wirken sich Corioliskräften aus, wie dies die Figur 1 zeigt. Im rotierenden (Pfeil 4) Zentrifugenbehälter 1 würde sich ein Körper entlang der beabsichtigten Linie 2 bewegen, wenn die genannte Corioliskraft außer acht bleibt. Tatsächlich wirkt diese jedoch so auf den Körper ein, daß dieser sich entlang der Linie 2 bewegt. Dies hat zur Folge, daß die im Gradienten 7 getrennten Zellbanden 6, 8 gemäß Figur 2 beschaffen bzw. verformt sind. Werden diese Zellbanden 6, 8 über die Spitze einer am Ende des Zentrifugenbehälters 1 endenden Kanüle 5 fraktioniert, kommt es zur teilweisen Verschmierung der Zelltrennung. Die volle, prinzipiell mögliche Trennleistung des Systems wird daher im Endeffekt nicht nützbar, weil Teile der Bande 6 immer noch eluiert werden, wenn die Bande 8 bereits an der Spitze angekommen ist.
    • b) Die Konstruktion der Kanülenführung läßt eine Fraktionierung der getrennten Banden nur durch Absaugung zu. Bei laufender Zentrifuge muß der dazu notwendige Sog die Zentrifugalkraft übertreffen. Da letztere möglichst hoch sein soll, um eine Verwirbelung der getrennten Zellen zu vermeiden, muß der für die Absaugung der Zellen entwickelte Unterdruck so beträchtlich sein, daß es teilweise zum "Ausgasen" im Zellinneren physikalisch gelöster physiologischer Gase (Sauerstoff, Kohlendioxid, Stickstoff) kommen kann, was mit einer Zellsehädigung verbunden sein kann. Außerdem läßt sich eine kontinuierliche Elution aus praktischen Gründen kaum erreichen. Der Einsatz von peristaltischen Pumpen zum kontinuierlichen Abpumpen von Zellen wäre jedenfalls deletär für fast alle Zellarten. Es besteht außerdem ständig die Gefahr von Verwirbelungen, wenn beim Abziehen von häufig zum Ansaugen des Gradienten eingesetzten Spritzen vom Kanülenansatz in der Kanüle befindliches Volumen wieder in die Spitze des Zentrifugenglases zurückgeschleudert wird.
  • Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Zentrifugation zu schaffen, bei dem eine optimale Trennschärfe erreichbar ist und eine Schädigung bei der Partikelfraktionierung vermieden wird.
  • Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Patentanspruches 1 gelöst.
  • Die Erfindung schafft vorteilhafterweise darüber hinaus ein völlig neues Zentrifugationsverfahren unter Kombination der beiden grundsätzlichen, oben erläuterten Zentrifugentechniken miteinander, wobei zur Trennung zusätzlich ein Flüssigkeitsstrom einsetzbar ist.
  • Der ungünstige Einfluß der Coriolis-Kräfte wird durch einen durchgehend konischen Zentrifugenbehälter minimiert. Im Falle von Glasgefäßen wird die Innenseite hydrophob beschichtet, z.B. mit Standartverfahren silikonisiert. Im Falle von Plastikgefäßen empfiehlt sich Teflon oder Polycarbonat als Wandmaterial. Die hydrophoben Wandinnenschichten führen zum Abstoßen der hydrophilen Zellen und verhindern deren direkten Wandkontakt.
  • Eine luftdicht abdichtbare Doppelkanüle, deren vertikale Achse genau durch den Rotormittelpunkt verläuft, erlaubt vorteilhafterweise die Einführung einer zentralen Kanüle wie beim vorbekannten Rotortyp, schafft aber noch einen zweiten gas- und flüssigkeitsabdichtbaren Zugang zum Separationsgefäß. Über diesen Weg kann am Ende des Trennprozesses ein Druckmedium eingebracht und dadurch der Gradient über die Zentralkanüle ausgedrückt und mit Hilfe eines ebenfalls zur optimalen Ausrüstung dieses Zentrifugensystems gehörenden Fraktionensammlers fraktioniert werden. Diese Fraktionierungstechnik erlaubt die vollkommene Aufrechterhaltung der im konisch immer dünner werdenden Zentrifugengefäß optimal weit auseinandergezogenen Zelltrennungen im Verlauf der der durch die nahezu punktförmige Abführung unterstützten Gradientenfraktionierung.
  • Schließlich bringt das erfindungsgemäße Zentrifugationsverfahren gleich mehrere typische Zellparameter für den Trennprozess ins Spiel und resultiert in nicht mehr steigerbaren Trennschärfen. Dabei wird zu allererst die Probe über die innere zentrale Kanüle in den Zentrifugenbehälter eingetragen. Zweckmäßigerweise wird sie mit Gradientenmedium auf eine spezifische Dichte gebracht, die gerade über der der leichtesten Zellart im Gemisch liegt. Diese schwimmt bei der weiteren Zentrifugation deshalb bereits in reiner Form als oberste Bande auf.
  • Grundlegend für die Optimierung des erfindungsgemäßen Zentrifugationsverfahrens ist nun weiterhin, daß sowohl eine jeweils elektronisch stufenlos regulierbare Pumpeneinrichtung und Zentrifugeneinrichtung in Kombination mit dem neuentwickelten Rotor eingesetzt werden, beide Geräte sind deshalb auch programmiert koordinierbar. Wird nun - programmgesteuert - mit dem Einpumpen des meist aus zwei Lösungen gemischten Gradienten begonnen, so wirken zwei Kräfte auf das zu trennende Zellgemisch gleichzeitig ein, die Zentrifugalkraft und die Strömungskraft. Erstere führt in diesem Stadium der Zentrifugation vor allem zur Trennung von Zellen auf Grund ihrer unterschiedlichen Zelldurchmesser und spezifische Dichte, letztere erfaßt vor allem sperrig geformte Zellen oder Aggregate, während kompakt gebaute, schwere Einzelzellen kaum beeinflußt werden. Zusätzlich kann die Wanderungsrichtung der Zellen noch dadurch gezielt beeinflußt werden, daß die Osmolarität des Gradientenmediums durch Beimischen entsprechender Salzkonzentrationen über das Programm rasch verändert wird (Erythrozyten schrumpfen, z.B. rasch in hypertonen Medien und erhalten so ein größeres spezifisches Gewicht und sedimentieren deshalb rascher). Programm-gesteuert können außerdem bald so hohe Dichtegradientenbereiche eingefüllt sein, daß bestimmte Zellarten der Ausgangsprobe im Bereich einer für sie isopyknischen Dichte anlangen und dann gemäß der oben angegebenen Formel liegen bleiben. Andere Zellarten wandern unter den jeweils gegebenen Bedingungen eventuell noch weiter und sammeln sich erst in weiter von der Zentrifugenachse entfernt gelegenen Gradientenbereichen. Durch jedem Zellgemisch anpaßbare Geschwindigkeiten der Pumpeneinrichtung bzw. Zentrifugenrotation lassen sich Zelltrennungen bisher nie erreichter Schärfen und in kürzesten Zeiträumen (teilweise nur in wenigen Minuten) erreichen. Dies kann für die Vitalität biologischer Präparate entscheidend sein. Das geschilderte Verfahren ist außerdem extrem anpassungsfähig und billig.
  • Im folgenden werden die Erfindung und deren Ausgestaltungen im Zusammenhang mit den Figuren näher erläutert. Es zeigen:
    • Fig. 1 und 2 Darstellungen zur Erläuterung des Prinzips des erfindungsgemäßen Zentrifugationsverfahrens und
    • Fig. 3 und 4 eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Zentrifugationsverfahrens.
  • In der Figur 3 ist eine Einrichtung zur Durchführung des vorliegenden Verfahrens dargestellt. Im wesentlichen umfaßt diese Einrichtung ein erstes Behältnis 10 für eine dichtere Gradientenlösung, ein zweites Behältnis 9 für eine vergleichsweise dünnere Gradientenlösung, eine Pumpeneinrichtung 12, eine Zentrifugeneinrichtung 30, die später näher erläutert werden wird, und eine Recheneinrichtung 90. In der Zentrifugeneinrichtung 30 wird ein Zentrifugenbehälter 1 gehalten und in Drehung versetzt, der die aus der Figur 3 ersichtliche, sich verjüngende bzw. konische Form besitzt, durch die die Einwirkung von Coriolis-Kräften vermieden wird. Außerdem wird durch die speziell konische Form erreicht, daß die Trennung der Fraktionen im Bereich der Spritze 51 der zentralen Kanüle 5 besser erfolgen kann, weil die einzelnen Fraktionen im Bereich des kleinen Durchmessers an der Spitze 51 auseinandergezogen werden. In das Innere des Zentrifugenbehälters 1 ragt die entlang der Achse des Zentrifugenbehälters 1 verlaufende zentrale Kanüle 5 derart hinein, daß ihr freies Ende 51 unmittelbar vor der Spitze 1' des konischen Zentrifugenbehälters 1 endet. Das gesamte Ende 51 ist vorzugsweise gemäß Figur 4 spitz ausgebildet. In den Zentrifugenbehälter 1 ragt ferner an einem Ort außerhalb der Längsachse desselben eine weitere Kanüle 17 hinein, die etwa am Ende des durch ein Deckelteil 31 verschlossenen Zentrifugenbehälters 1 endet.
  • Die Recheneinrichtung 90 ist über Leitungen 91 bzw. 92 mit der Pumpeneinrichtung 12 und der Zentrifugeneinrichtung 30 verbunden, so daß diese durch ein in der Recheneinrichtung 90 gespeichertes Programm im Hinblick auf die Förderleistung bzw. die Drehzahl gesteuert werden können.
  • Mit der beschriebenen Einrichtung wird in der folgenden Weise gearbeitet.
  • In einem ersten Schritt wird eine Gradientenlösung einer gewünschten Dichte hergestellt. Zu diesem Zweck wird in einer genau programmierten Weise, durch die Recheneinrichtung 90 gesteuert, aus dem ersten Behältnis 10 über die Leitung 11 mit der Hilfe der Pumpeneinrichtung 12 eine dichtere Gradientenlösung 13 in das zweite Behältnis 9 eingeführt, in der sich eine dünnere Gradientenlösung 14 befindet. Vorteilhafterweise mit der Hilfe eines bekannten Magnetrührers 28 werden die eingeführte dichtere Gradientenlösung 13 und die im Behältnis 9 befindliche dünnere Gradientenlösung 14 fortlaufend gemischt, bis ein gewünschter Dichtegrad hergestellt ist. Nach dem Öffnen der Schlauchklemme 15 oder eines anderen Verschlusses wird mit der Hilfe der Pumpeneinrichtung 12 über die Leitung 16 die gemischte Gradientenlösung 7 der gewünschten Dichtigkeit über die zentrale Kanüle 5 in das Innere des Zentrifugenbehälters 1 im Bereich der Spitze 1' desselben eingeführt. In dem Behälter 1 befindet sich zu diesem Zeitpunkt bereits im Bereich der Spitze 1' die zu fraktionierende Probe 26, da die Gradienteneinschichtung nach dem Einbringen der Probe 26 erfolgt. Beim Einbringen der Gradientenlösung 7 wird die Probe 26 in der Richtung des Pfeiles 40 gegen die Zentrifugalkraft 41 verschoben, wobei die Zellpartikel der Probe 26 in die Gradientenlösung 7 einwandern. Die Gradientenlösung 7 kann rechnergesteuert fortlaufend im Hinblick auf ihre Dichte so variiert werden, daß die Dichte in einem genau vorbestimmten Maße kontinuierlich oder stufenweise zunimmt.
  • Dies hat zur Folge, daß die Fraktionierung durch die während der Zentrifugation ablaufenden Prozesse der Gleichgewichtszentrifugation, bei der die Partikel der Probe 26 solange wandern, bis sie die ihnen entsprechende Gradientendichte erreichen, und der Sedimentationszentrifugation erreicht wird, bei der die Zellpartikel der Probe 26 in Abhängigkeit von ihrer Form und/oder Größe und/oder Aggregation in unterschiedliche Partikelzonen (Banden) aufgetrennt werden.
  • Wie dies bereits erwähnt wurde, wird dabei durch die Konizität des Zentrifugenbehälters 1 verhindert, daß die entstehenden Fraktionen gemäß Figur 2 infolge der auftretenden Corioliskraft verschmiert werden, da deren Auswirkungen bei den durch die Verjüngung erzielten kleinen Behälterdurchmessern nicht relevant sind.
  • Da Möglichkeiten der Zugabe eines im Hinblick auf die zunehmende Dichte programmiert gesteuerten Lösungsgradienten 7 durch Bestimmung des Mischungsverhältnisses in dem Behältnis 9 durch Ansteuerung der Pumpeneinrichtung 12 sowie der Regelung der Drehzahl der Zentrifugeneinrichtung 30 bestehen, kann die Fraktionentrennung in einem bisher nicht erreichten Ausmaß gestaltet werden.
  • Nach der Trennung wird Druckmedium, vorzugsweise Druckluft über die Leitung 18 und die Kanüle 17 in das Innere des Zentrifugenbehälters 1 zum gezielten Ausbringen der erzeugten Fraktionen über die zentrale Kanüle 5 eingebracht. Diese werden durch den im Inneren des Zentrifugenbehälters 1 erzeugten Druck gegen die Zentrifugalkraft 41 über die Spitze 51 der zentralen Kanüle 5 (vorzugsweise bei verminderter Drehzahl) punktförmig abgesaugt und mit einer bisher nicht erreichbaren Schärfe ausgebracht. Vorzugsweise zweigt die zentrale Kanüle 5 über ein T-Stück 81 zu einer dann geöffneten Schlauchklemme 80 oder einen anderen Verschluß ab, so daß die Fraktionen über die Leitung 83 entnommen werden können.
  • Im folgenden wird im Zusammenhang mit der Figur 4 der konstruktive Aufbau des Rotors der Zentrifugeneinrichtung 30 im Hinblick auf die bevorzugte Leitungsführung der zentralen Kanüle 5 sowie der weiteren Kanüle 17 näher erläutert. Dabei ist der Körper dieses Rotors, an dem der Zentrifugenbehälter 1 befestigt ist, mit 50 bezeichnet.
  • Vorzugsweise sind die Zufuhrleitungen 18 für die zentrale Kanüle 5 und 16 für die weitere Kanüle 17 koaxial zueinander in der Form einer Doppelkanüle angeordnet. Dabei verlaufen beide Leitungen 16 und 18, wobei sich die Leitung 18 im Inneren der Leitung 16 befindet, zunächst durch eine obere Platte 19, in deren Mitte sich eine Bohrung 41 befindet, durch die die genannte Doppelkanüle verläuft. Unterhalb der vorzugsweise aus Stahl bestehenden Platte 19 befindet sich eine Dichtungscheibe 20 für die äußere Leitung 16, die vorzugsweise aus Silikongummi besteht. Das Ende der Leitung 16 endet in einer mittigen Bohrung 20' der Dichtungsscheibe 20. Unterhalb der Dichtungsscheibe 20 befindet sich eine weitere Platte 21, die vorzugsweise aus Stahl besteht und durch deren Bohrung 25 die innere Leitung 18 verläuft. Das Ende der Leitung 16, das durch die Dichtungsscheibe 20 abgedichtet ist, steht daher dicht mit der Bohrung 25 in Verbindung, die wiederum über einen radial in der Platte 21 verlaufenden Durchgang 23 mit der Kanüle 17 in Verbindung steht. Die durch die Bohrung 25 hindurch verlaufende Leitung 18 vorläufig durch eine mittige Bohrung 22' einer weitere Dichtungsscheibe 22, die vorzugsweise ebenfalls aus Silikongummi besteht und die Leitung 18 an ihrem Außenumfang abdichtet. Vorzugsweise besteht die Dichtungsscheibe 22 aus einem weicheren Silikongummi als die Dichtungsscheibe 20. Das Ende der Leitung 16 ragt in eine im Körper 50 des Rotors der Zentrifugeneinrichtung 30 befindliche Bohrung 51 hinein, die in radialer Richtung über einen Durchgang 52 mit der zentralen Kanüle 5 in Verbindung steht. Die genannten Platten 19 und 21 sowie die genannten Dichtungen 20 und 22 werden durch eine in eine Bohrung 53 des Körpers 50 eingeschraubte Schraube 54 aneinander gepreßt, durch deren Axialbohrung 55 die genannten Leitungen 16 und 18 nach außen verlaufen. Beim Betrieb der Zentrifugeneinrichtung 30 drehen sich der Körper 50, die Schraube 54, die Platten 19 und 21 sowie die Dichtungen 20 und 22, während die Leitungen 16 und 18 nichtdrehende Teile sind, die über nicht dargestellte Kugellager in Bezug auf die drehenden Teile abgestützt sind.
  • Es hat sich herausgestellt, daß Silikongummi als Material für die genannten Dichtungsscheiben 20 und 22 besonders vorteilhaft ist, weil der an den Außenumfängen der Leitungen 16 bzw. 18 auftretende Verschleiß beim Drehen der Zentrifugeneinrichtung 30 minimal ist. Die Silikongummi-Dichtungsscheiben 20 und 22 können nach erfolgtem Verschleiß durch einfaches Aufdrehen der Schraube 54 und Entnahme der Platten 19 und 21 besonders leicht ausgewechselt werden.
  • Vorzugsweise kann das Ankoppeln von unterschiedlichen zentralen Kanülen 5 an den Durchgang 52 über eine abgedichtete Schraubverbindung 56 erfolgen.
  • Zweckmäßigerweise kann die sich nicht drehende Doppelkanüle 16, 18 bei laufender Zentrifugeneinrichtung 30 entfernt werden. Dadurch können extrem hohe Umdrehungszahlen, ohne Abrieb an den Dichtungen erreicht werden, bei denen auch subzellulare Partikel fraktionierbar sind. Zum Zwecke der späteren Gradientenentnahme bei geringeren Drehzahlen wird die Doppelkanüle wieder eingesetzt.
  • Das oben genannte Deckelteil 31 des Zentrifugenbehälters 1 kann dadurch realisiert werden, daß der Behälterrand 1'' gegen einen Dichtungsring 32 gedrückt wird, der in einer Aussparung 33 des Rotorkörpers 50 enthalten ist. In diesem Fall führt der die weitere Kanüle 17 bildende Durchgang des Rotorkörpers 50 zum Boden der Aussparung 33 innerhalb des Dichtungsringes 32 und wird die zentrale Kanüle 5 mit der Hilfe der bereits genannten Schraubverbindung 56 am Rotorkörper 50 befestigt.
  • Vorzugsweise wird ein Zentrifugenbehälter 1 verwendet, dessen Länge von der Spitze 1' bis zur Öffnung etwa 10 bis 15 cm beträgt und dessen Öffnung einen Durchmesser von etwa 3 bis 8 cm aufweist.
  • Am folgenden Beispiel wird im Vergleich mit konventionellen Zentrifugationssystemen gezeigt, wie sich alle dieser Parameter kombinieren und im Hinblick auf die Reindarstellung von neutrophilen Granulozyten aus Meerschweinchenblut (gegen die es keine käuflichen Antikorper zur Ausnutzung immunologischer Trennmethode gibt) optimieren lassen. Es handelt sich dabei bekanntlich um kernhaltige Zellen des Blutes, die neben anderen kernhaltigen Zellen (andere Granulozyten, Lymphozyten, Monozyten) - zu den "weißen Blutkörperchen" bzw. "Leukozyten" gehören. Die Gesamtheit aller Leukozyten macht nur ca. 0.1 - 0,2 % aller Blutzellen aus, die neutrophilen Granulozyten sogar nur 0,03 - 0,09 %. Neben den Thrombozyten (ca. 4 % aller Blutzellen) besteht Blut zu ca. 96 % vorwiegend aus Erythrozyten. Die Reinigung der Granulozyten durch Zentrifugation stellt also ein Extrembeispiel dar, das noch zusätzlich erschwert wird durch die Tatsache, daß Erythrozyten die schwersten Blutzellen darstellen. Sie wandern also am weitesten in eigenen Dichtegradienten ein und müssen deshalb als erste (völlig überladene) Bande eluiert werden.
  • Das zweite Beispiel soll deutlich machen, daß sich eine derartige Trenneffizienz zentrifugaler Methodik auch für Zellgemische anwenden läßt, die erst durch aufwendige proteolytische Dissoziationsverfahren aus nativen Organen herausgelöst werden müssen. Es handelt sich beim konkreten Beispiel um die schwierige Aufgabe, die im Herzmuskel extrem zahlreich und multidispersen Mikrogefäße mit Begleitzellen von den Herzmuskelzellen (Kardiomyozyten) komplett abzutrennen. Die Kardiomyozyten besitzen einen zellspezifischen Stoffwechsel, der nur bei ihrer vollkommenen Reindarstellung richtig erfaßt werden kann.
  • Diese für die pharmakologischen Zielsetzungen in der Medizin wichtige Aufgabe wird durch eine extreme Empfindlichkeit der Herzmuskelzellen erschwert, die sich bekanntlich schnell kontrahieren können und im isolierten Zustand dann irreversibel absterben.

Claims (15)

  1. Verfahren zur zentrifugationstechnischen Durchführung von Partikeltrennungen, insbesondere auf biologischem Sektor, bei dem in einen Zentrifugenbehälter (1) eine zu fraktionierende Probe (26) über eine Kanüle (5) eingebracht wird, die mit ihrem freien Ende (51) zur Minimierung unerwünschter Auswirkungen der Corioliskraft zur Spitze (1') eines sich zur Spitze (1') hin stark verjüngenden Zentrifugenbehälters (1) verläuft, wobei über die Kanüle (5) nachfolgend eine Gradientenlösung (7) mit sich zunehmend kontinuierlich oder stufenweise vergrößernder Dichte eingebracht wird, wobei aus der Probe (26) Partikel durch die Wirkung der Gleichgewichts- und/oder Sedimentationszentrifugation in die Gradientenlösung (7) wandern, und wobei nach einer vorbestimmten Zentrifugationszeit über eine weitere Kanüle (17) ein Druckfluid in das Innere des verschlossenen Zentrifugenbehälters (1) eingebracht wird, um die die fraktionierten Partikel der Probe (26) enthaltende Gradientenlösung (7) über die Kanüle (5) auszubringen.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Gradientenlösung (7) aus wenigstens einer Gradientenlösung (13) einer größeren Dichte und einer Gradientenlösung (14) einer vergleichsweise kleineren Dichte zur Erzielung einer gewünschten Dichte zusammengemischt wird.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Gradientenlösung (13) der größeren Dichte einem ersten Behältnis (10) entnommen und mit der Hilfe einer Pumpeneinrichtung (12) in ein die Gradientenlösung (14) der kleineren Dichte enthaltendes zweites Behältnis (9) befördert wird, daß die in dem zweiten Behältnis (9) enthaltenen Gradientenlösungen (13, 14) fortlaufend miteinander vermischt und aus dem zweiten Behältnis (9) der Kanüle (5) über eine weitere Pumpeneinrichtung (12) zugeführt werden.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Pumpeneinrichtung (12) durch das Programm einer Recheneinrichtung (90) fortlaufend gesteuert wird, um fortlaufend eine vorbestimmte Dichte der Gradientenlösung zu erhalten.
  5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Zuführung der Gradientenlösung (7) durch Ansteuerung der weiteren Pumpeneinrichtung (12) durch das in der Recheneinrichtung (90) enthaltene Programm zur vorbestimmten Änderung der Zufuhrraten erfolgt.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß ein Zentrifugenbehälter (1) verwendet wird, bei dem die Kanüle (5) in dem Zentrifugenbehälter (1) zentral verläuft.
  7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß ein Zentrifugenbehälter (1) verwendet wird, bei dem die weitere Kanüle (17) außerhalb der Längsachse des Zentrifugenbehälters (1) verläuft.
  8. Einrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß eine Zentrifugeneinrichtung (30) mit einem Zentrifugenbehälter (1) mit einer zentralen Kanüle (1) vorgesehen ist, deren freies Ende (51) bis zur Spitze (1') des sich verjüngenden Zentrifugenbehälters (1) verläuft, daß eine weitere Kanüle (17) in das Innere des Zentrifugenbehälters (1) zum Zuführen eines Druckfluids führt, daß die zentrale Kanüle (5) und die weitere Kanüle (17) mit einer Leitungsanordnung verbunden sind, die in Bezug auf den Rotorkörper (50) der Zentrifugeneinrichtung (30) drehfest angeordnet ist.
  9. Einrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Leitungsanordnung eine innere Leitung (18) und eine diese umgebende äußere Leitung (16) aufweist.
  10. Einrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß in einer Ausnehmung des Rotorkörpers (50) eine erste Dichtungsscheibe (22), darauf eine erste Platte (21), auf dieser eine zweite Dichtungsscheibe (20) und auf dieser eine zweite Platte (19) angeordnet sind, daß die Leitungen (16, 18) durch eine Aussparung (41) der zweiten Platte (19) verlaufen, daß die äußere Leitung (18) in einer Aussparung (20') der zweiten Dichtungsscheibe (20) dicht endet, daß die innere Leitung (18) durch eine Aussparung (25) der ersten Platte (21) verläuft und in einer Aussparung (22') der ersten Dichtungsscheibe (22) abgedichtet ist, daß die Aussparung (25) der ersten Platte (21) über einen Durchgang (23) in der ersten Platte (21) und einen die weitere Kanüle bildenden Durchgang (17) in dem Rotorkörper (50) mit dem Inneren des Zentrifugenbehälters (1) in Verbindung steht, daß die Aussparung (22') der ersten Dichtung (22) mit einem weiteren Durchgang (52) in dem Rotorkörper (50) in Verbindung steht, der zur Kanüle (5) führt.
  11. Einrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Dichtungsscheiben (20, 22) aus Silikongummi bestehen.
  12. Einrichtung nach einem der Ansprüche 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß die zweite Dichtungsscheibe (20) aus einem weniger harten Material besteht als die erste Dichtungsscheibe (22).
  13. Einrichtung nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Platten (19, 21) Stahlplatten sind.
  14. Einrichtung nach einem der Ansprüche 10 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Dichtungen (20, 22) und die Platten (19, 20) durch ein im Rotorkörper (50) verschraubtes Schraubenelement (54) in die Ausnehmung des Rotorkörpers (50) gedrückt werden, und daß die Leitungsanordnung durch eine Bohrung (55) des Schraubenelements (54) verlaufen.
  15. Einrichtung nach einem der Ansprüche 8 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Länge des Zentrifugenbehälters (1) etwa 10 bis 15 cm beträgt und die Öffnung desselben einen Durchmesser von etwa 3 bis 8 cm besitzt.
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