DE3780050T2 - Partikeltrennungsverfahren. - Google Patents
Partikeltrennungsverfahren.Info
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Teilchen- Trennung und insbesondere ein Verfahren zur Abtrennung biologischer Zellen aus Mischungen.
- Verfahren zur Teilchen-Trennung haben eine diverse Vielfalt von Anwendungen. Auf medizinischem Gebiet in der Entwicklung befindliche Techniken erfordern eine effiziente Blut-Verarbeitung. Zell-Komponenten des Blutes werden typischerweise durch Zentrifugieren und/oder Ausschlämmen getrennt. Verbesserte Verfahren zur Abtrennung von Zell-Populationen aus Blut mit einem Minimum an Kontamination durch unerwünschte Zellen sind auf medizinischem Gebiet von Interesse.
- Die folgenden Literaturstellen offenbaren Methoden zur Abtrennung von Teilchen aus gemischten Populationen. Die US-A- 4 350 283 offenbart einen Zentrifugen-Rotor, der für eine kontinuierliche Abtrennung spezifischer Teilchen aus gemischten Populationen derselben durch zentrifugales Ausschlämmen hergerichtet ist. Der Rotor ist so ausgebildet, daß er auf einer Zentrifugen-Antriebswelle gehaltert wird, und besitzt ein Gehäusemittel zum Ausschlämmen der Zellen mit wenigstens zwei in gleichen Abständen voneinander vorgesehenen länglichen Hohlräumen, die in bezug auf die Rotationsachse des Rotors symmetrisch angeordnet sind. Eine Spindel für die Flüssigkeitszuführung ist in dem Rotor angeordnet und hat Durchgänge für den Flüssigkeits-Einlaß und -Auslaß, die mit jedem der länglichen Hohlräume des Rotors in Verbindung stehen. Eine Ausschlämm-Flüssigkeit wird mittels einer externen Pumpe durch den Rotor hindurchgepumpt.
- Die GB-A-1 313 753 offenbart ein Verfahren und einen Apparat zur Durchführung einer Teilchengrößen-Analyse eines teilchenförmigen festen Materials. Das Verfahren umfaßt das Einleiten einer Suspension eines festen Materials in eine Drehkessel- Zentrifuge und das Hindurchfließenlassen einer Ausschlämm- Flüssigkeit durch die Suspension. Die ausgeschlämmten Teilchen werden in einer Vorlage gesammelt. Das Verfahren wird als besonders geeignet beschrieben zur Trennung von Teilchen einer Größe von 0,1 bis 5 um aus einem teilchenförmigen festen Material. Der Apparat umfaßt einen Vorratsbehälter zur Aufnahme eines Vorrats an Ausschlämm-Flüssigkeit, eine Zentrifugier-Kammer, die einen Einlaß und einen Auslaß und ein Leitungsmittel besitzt, das den Vorratsbehälter mit der Zentrifugier-Kammer verbindet.
- Die DE-A-2 918 384 (Zusammenfassung) offenbart ein modulares System zum Fraktionieren (Trennen) biologischer Zellen. Eine Zell-Suspension wird in eine Zellen-Zerreißvorrichtung eingespeist und dann durch einen oder mehrere, in Reihe geschaltete Rotor(en) (z.B. Gegenstrom-Zentrifugen mit Ausschlämmer/Rotor) geschickt. Die Trennung von Zellkernen, Teilchen-Fraktionen und Ribosomen wird offenbart. Das modulare System verkürzt den Weg, den das biologische Material durchlaufen muß.
- Die folgenden Literaturstellen offenbaren Methoden und Apparate zur Trennung von Blut-Komponenten. Die US-A-4 268 393 offenbart einen Apparat zur Abtrennung von blutplättchenreichem Plasma (PRP) aus Vollblut. Eine Blutprobe wird in eine Kammer gebracht und der Einwirkung einer Zentrifugalkraft unterworfen. Ein relativ kleines Volumen Kochsalz-Lösung wird in das zentrifugal äußere Ende der Kammer eingespritzt, wobei das PRP aus der Kammer in einen Sammelbeutel verdrängt wird.
- Rote und weiße Blutkörperchen werden in einem stationären Gleichgewicht in der Kammer gehalten. In einem bevorzugten Apparat wird die Kochsalz-Lösung dadurch in die Blutprobe eingespritzt, daß die die Blutprobe tragende Kammer unter dem Einfluß der Zentrifugalkraft gegen eine mit Kochsalz-Lösung gefüllte zusammenlegbare Höhlung getrieben wird.
- Die US-A-4 304 357 offenbart einen Apparat und ein Verfahren zur Auftrennung von Blut in eine plasmareiche Komponente und eine plasmaarme Komponente. Ein Vollblut enthaltender Verarbeitungsbeutel und eine flexible Verdrängungstasche mit einer ein Diaphragma betätigenden Flüssigkeit werden in eine Blut-Verarbeitungskammer in einem Zentrifugen-Rotor gebracht. Die Kammer umfaßt ein Paar konturierter Trägerschuhe und eine Druckplatte, die gegen die Innenwand des dem Rotationszentrum des Rotors nächsten Trägerschuhs Positioniert ist. Wenn Verdränger-Flüssigkeit in die Verdrängungstasche eingeleitet wird, werden Blut oder Blut-Komponenten aus dem Verarbeitungsbeutel herausgedrückt und in einem Vorlagenbehälter gesammelt.
- Die US-A-4 416 654 und die US-A-4 464 167 offenbaren ein Verfahren und einen Apparat zu Trennung spezifischer Zellen. Eine Zentrifugierungs-Pherese-Schüssel mit zwei Öffnungen wird zum Zentrifugieren und Hochgeschwindigkeits-Ausschlämmen benutzt. In einer besonderen Ausführungsform werden von roten Blutkörperchen freie Plättchen dadurch von Blut getrennt, daß eine Flüssigkeit niedriger Dichte, vorzugsweise Plasma, durch zentrifugal getrennte Zellen hindurchgepumpt wird, um die Zellen entsprechend ihrer Sedimentationsrate auszuschlämmen.
- Die US-A-4 322 298 offenbart eine Methode und eine Apparatur zur Fraktionierung einer Suspension feinteiliger fester Teilchen unterschiedlicher Sedimentationsgeschwindigkeit. Die Abtrennung von plättchen-reichem Plasma (PRP) von Vollblut wird dadurch bewerkstelligt, daß eine Blutprobe zentrifugiert wird und in ihr äußeres zentrifugales Ende ein Volumen Kochsalz-Lösung injiziert wird. Die Kochsalz-Lösung verdrängt PRP aus der Blutprobe, nachdem die roten Blutkörperchen von dem anderen Ende des Beutels hinwegsedimentiert worden sind. Die bevorzugte Apparatur ist als geschlossenes System miteinander verbundener Beutel konzipiert, die in einer Trägereinrichtung gehalten werden, die so ausgeführt ist, daß sie in einen großen Zentrifugen-Kübel paßt.
- Die US-A-4 098 456 offenbart einen Zentrifugen-Becher mit einem ein Mundstück definierenden Rand, einem Paar trennbarer Deckel-Element-Hälften und Mitteln zum Greifen des oberen Endes einer Position eines flexiblen Beutels in dem Becher. Der flexible Beutel wird als besonders wünschenswert beschrieben zum Waschen von Blut und zum Trennen von Blut-Bestandteilen. Der Beutel enthält einen Einlaß und einen Auslaß und eine dritte abgedichtete Öffnung für den Zugang zu Blut-Zellen nach dem Zentrifugieren. Das Waschen der Blut-Zellen erfolgt mittels Perkolieren einer Waschlösung durch die Zellen.
- Die US-A-4 269 718 offenbart eine Methode und einen Apparat für die Trennung feinteiliger fester Teilchen, die nach Größe und/oder Dichte unterschiedlich sind, z.B. Plättchen und andere Blut-Zellen. Die Abtrennung der Plättchen wird dadurch bewerkstelligt, daß eine Blut-Probe in einer Kammer der Einwirkung einer Zentrifugalkraft ausgesetzt wird und ein relativ kleines Volumen Kochsalz-Lösung in das zentrifugal äußere Ende der Kammer injiziert wird, wodurch Plättchen aus der Blut-Probe verdrängt werden. In dem bevorzugten Apparat wird die Kochsalz-Lösung in der Weise in die Blut-Probe injiziert, daß die die Blut-Probe tragende Kammer unter dem Einfluß der Zentrifugalkraft in einen mit Kochsalz-Lösung gefüllten Hohlraum hineingetrieben wird.
- Diese Literatustellen offenbaren Verfahrensweisen des zentrifugalen Ausschlämmens, bei denen Teilchen mit unterschiedlichen Sedimentations-Kenngrößen aus Mischungen getrennt werden. Diese Mischungen werden der Einwirkung einer Zentrifugalkraft ausgesetzt, während eine Trennflüssigkeit mit einer Rate gegen diese Kraft gepumpt wird, die größer ist als die Sedimentationsrate der gewünschten Teilchen. Die Trennflüssigkeit ist leichter, d.h. weniger dicht, als die gewünschten Teilchen. Die abgetrennten Teilchen werden durch viskoses Schleppen verdrängt, das aus dem Bewegen von Flüssigkeit auf der Oberfläche der Teilchen resultiert. Da kleine dichte Teilchen den gleichen Effekt des viskosen Schleppens haben können wie größere, weniger dichte Teilchen, trennt das Ausschlämmen Teilchen mit unterschiedlichen Dichten nicht in wirksamer Weise. Bei vielen Verfahren der Trennung von Teilchen, insbesondere von Blut-Zellen, ist eine Trennung auf der Grundlage der Dichte der Teilchen wünschenswert. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung bewirkt, verglichen mit dem Ausschlämmen, eine verbesserte Trennung der Teilchen mit unterschiedlichen Dichten.
- Boyum, Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigations 21:77 (1968), offenbart die Isolierung einkerniger Zellen und Granulocyten aus menschlichem Blut. Die Literaturstelle offenbart, daß beim überschichten von antikoaguliertem Blut über eine Mischung aus Isopaque und Ficoll in einem Zentrifugenrohr und anschließendem Zentrifugieren die zellulären Elemente in zwei Hauptfraktionen geteilt wurden: Granulocyten und Erythrocyten sedimentierten zum Boden des Rohres, während einkernige Zellen zusammen mit Plättchen an der Grenzfläche verblieben. Es wurde mitgeteilt, daß die Ausbeute an einkernigen Zellen fast 100 % betrug, wenn das Blut vor dem Zentrifugieren mit Kochsalz-Lösug verdünnt wurde. In dem Verfahren der vorliegenden Erfindung können einkernige (mononukleäre) Zellen aus einer Mischung von Blut-Zellen in einer geschlossenen Apparatur und ohne Verdünnung vor der Trennung abgetrennt werden.
- Die vorliegende Erfindung macht ein Verfahren zur Abtrennung vorgewählter Teilchen aus einer die Teilchen enthaltenden Mischung verfügbar, das das Halten der Mischung in einer Zentrifugen-Kammer, das Einwirkenlassen einer Zentrifugalkraft auf die Kammer und das Hindurchdrücken einer Verdrängungsflüssigkeit durch die Kammer gegen die Zentrifugalkraft umfaßt, um dadurch die vorgewählten Teilchen von der Mischung abzutrennen, worin die Verdrängungsflüssigkeit eine Dichte hat, die größer als die Dichte oder gleich der Dichte der vorgewählten Teilchen ist.
- Die Erfindung macht ebenfalls die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Abtrennung mononukleärer Zellen aus einer Mischung von Blutzellen verfügbar.
- Figur 1 zeigt eine stilisierte Darstellung einer Apparatur, die zur Abtrennung mononukleärer Zellen aus einer Mischung von Blutzellen eingesetzt wird.
- Die Figuren 2, 3 und 4 zeigen die Cytotoxizität für Tumor- Zellen von mit IL-2 (Interleukin-2) behandelten mononukleären Zellen, die aus Mischungen von Blut-Zellen abgetrennt worden sind.
- Das vorliegende Verfahren trennt vorher ausgewählte Teilchen aus einer die Teilchen enthaltenden Mischung auf der Basis der relativen Dichten der Teilchen in der Mischung ab. Der Begriff "vorher ausgewählte Teilchen", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet die Teilchen, die von dichteren Komponenten der Mischung abzutrennen sind. Der Begriff "Mischung" bezeichnet eine Kombination aus zwei oder mehr Typen fester oder halbfester Teilchen in wechselnden Mengenverhältnissen. Die Größe der Teilchen in der Mischung ist nicht kritisch. Vorzugsweise haben die vorher ausgewählten Teilchen einen Durchmesser von etwa 1 um bis etwa 0,25 cm und am meisten bevorzugt von etwa 2 um bis etwa 20 um. Eine partielle Liste von Teilchen, die sich zur Abtrennung mittels des vorliegenden Verfahrens eignen, umfaßt biologische Zellen, gemahlenes Erz, Katalysator- Teilchen und Polymer-Teilchen. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die vorher ausgewählten Teilchen biologische Zellen und am meisten bevorzugt Blutzellen.
- Es wurde gefunden, daß das Verfahren der vorliegenden Erfindung in wirksamer Weise mononukleäre Zellen aus Mischungen von Blutzellen abtrennt. Der Ausdruck "mononukleäre Zellen" bezieht sich auf Lymphocyten und Monocyten. Es ist bekannt, daß mononukleäre Zellen Lymphocyten einschließen, die mit einem Lymphokin, Interleukin-2 (IL-2), behandelt werden können, um Lymphokin-aktivierte Killer-(LAK-)Zellen mit Antitumor-Reaktivität zu erzeugen. Vollblut und verarbeitete Blut-Fraktionen sind geeignete Mischungen für die Abtrennung mononuklärer Zellen. Vorzugsweise werden mononukleäre Zellen aus einem an Lymphocyten reichen Blutzellen-Gemisch abgetrennt, das durch Zentrifugieren von Vollblut hergestellt ist.
- Die in dem vorliegenden Verfahren abgetrennten mononukleären Zellen haben ein Minimum an unerwünschter Zell-Verunreinigung und sind von Nutzen bei einem adoptiven Transfer-Therapie- Verfahren, wie es bei Rosenberg, Journal of the National Cancer Institute, 75(4):595 (1985), und Rosenberg et al., New England Journal of Medicine, 313(23):1485 (1985), offenbart ist, auf deren relevante Offenbarungen hier ausdrücklich Bezug genommen wird. Gemäß dem vorliegenden Verfahren aus einer Mischung von Blutzellen abgetrennte mononukleäre Zellen werden mit einem Lymphokin, IL-2, behandelt, um Lymphokin-aktivierte Killer-Zellen (LAK-Zellen) in den mononukleären Zellen zu aktivieren und Lymphokine mit Antitumor-Reaktivität zu erzeugen. Die aktivierten LAK-Zellen können in Gewebe eingeführt werden, um Tumor-Wachstum zu unterdrücken. Ein anderer Vorteil des Verfahrens besteht darin, daß Blut-Zellen in einem großen Volumen ohne Verdünnung abgetrennt werden können.
- In dem vorliegenden Verfahren wird die Mischung in einer Zentrifugen-Kammer gehalten. Der Begriff "gehalten", wie er hierin verwendet wird, bedeutet, daß die Teilchen in einer Zentrifugen-Kammer festgehalten werden. Vorzugsweise werden die Teilchen mit einer Trägerflüssigkeit vermischt, die die Mobilität der Teilchen verstärkt. Die Trägerflüssigkeit sollte mit den Teilchen in der Mischung kompatibel sein und eine Dichte haben, die kleiner als die Dichte der vorher ausgewählten Teilchen ist. Mischungen von Zellen, wie Blutzellen, können in einer Vielfalt von Flüssigkeiten gehalten werden, darunter Kochsalz-Lösungen, gepufferten Kochsalz-Lösungen und anderen nicht-cyctotoxischen Flüssigkeiten mit einem osmotischen Druck, der demjenigen der natürlichen Umgebung der ausgewählten Zellen ähnlich ist. Plasma stellt eine geeignete Träger-Flüssigkeit für die Abtrennung von Blutzellen dar. In einer Ausführungsform des vorliegenden Verfahrens wird die Mischung in die Zentrifugen-Kammer eingeführt, während die Kammer einer Zentrifugalkraft ausgesetzt wird. In diesem Fall sollte die Mischung mit einer solchen Rate eingeführt werden, daß die Turbulenz in der Kammer minimiert wird.
- Geeignete Zentrifugen-Kammern sind Behälter, auf die eine Zentrifugalkraft zur Einwirkung gebracht werden kann. Eine Vielfalt geeigneter Zentrifugen-Kammern sind in der Technik bekannt. Das erfindungsgemäße Verfahren kann in zylindrischen, konischen, ringförmigen Kammern oder anderen Kammern ohne Unregelmäßigkeiten, die die angestrebte Teilchen-Trennung nachteilig beeinflussen würden, durchgeführt werden. Die Kammer sollte ein Mittel zum Einführen von Material in das äußere Zentrifugen-Ende und ein Mittel zum Herausführen von Material durch das innere Zentrifugen-Ende haben. Vorzugsweise ist die Zentrifugen-Kammer eine ringförmige (toroidal geformte) Kammer.
- Die Kammer wird einer Zentrifugalkraft ausgesetzt. Der Betrag der Zentrifugalkraft ist nicht kritisch. Die Kraft sollte ausreichen, um den Effekt der verdrängenden Flüssigkeit auf Teilchen mit einer größeren Dichte als derjenigen der verdrängenden Flüssigkeit zu minimieren und dabei gleichzeitig zu ermöglichen, daß die vorher ausgewählten Teilchen gegen die Zentrifugalkraft von den dichteren Komponenten der Mischung hinwegschwimmen. Wenn mononukleäre Zellen aus einer Mischung von Blutzellen abgetrennnt werden, beträgt die zentrifugalkraft vorzugsweise etwa 100 x g bis etwa 15 000 x g und am meisten bevorzugt von etwa 400 x g bis etwa 2 000 x g. Die Zentrifugalkraft wird dadurch bewirkt, daß man die Kammer in einem Rotor einer Zentrifuge sich drehen läßt. Eine Mannigfaltigkeit geeigneter Zentrifugen-Rotoren sind in der Technik bekannt.
- In dem vorliegenden Verfahren wird eine Verdrängungsflüssigkeit gegen die Zentrifugalkraft durch die Kammer hindurchgedrückt, wodurch die vorher ausgewählten Teilchen aus der Mischung abgetrennt werden. Die Verdrängungsflüssigkeit hat eine Dichte, die größer ist als diejenige oder gleich derjenigen der Dichte der vorher ausgewählten Teilchen. Vorher ausgewählte Teilchen mit einer Dichte, die gleich der Dichte der gewählten Verdrängungsflüssigkeit oder kleiner ist, schwimmen gegen die Zentrifugalkraft von dichteren Komponenten der Mischung weg. Die Verdrängungsflüssigkeit sollte eine im wesentlichen einheitliche Dichte haben und mit den vorher ausgewählten Teilchen kompatibel sein. Vorzugsweise hat die Verdrängungsflüssigkeit eine Dichte, die gleich der Dichte oder größer als die Dichte der vorher ausgewählten Teilchen ist und kleiner als die Dichte der dichteren Komponenten der Mischung ist. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Mischung einer Zentrifugalkraft ausgesetzt, um die Mischung zu schichten, bevor die Verdrängungsflüssigkeit gegen die Zentrifugalkraft durch die Kammer hindurchgedrückt wird. Der Ausdruck die "Mischung zu schichten" bedeutet, die in der Zentrifugen-Kammer gehaltenen Teilchen in Schichten oder Strata entsprechend ihren jeweiligen Dichten auf zutrennen.
- Eine partielle Liste von Verdrängungsflüssigkeiten, die für die Auftrennung biologischer Zellen geeignet sind, umfaßt kolloidale Suspensionen, Lösungen hochmolekularer Salze, Mischungen von Polymeren mit hochmolekularen Salzen, Mischungen von Polysacchariden mit hochmolekularen Salzen und andere, biologisch inerte Lösungen mit gewünschter Dichte. Vorzugsweise werden biologische Zellen unter Verwendung eines Gemisch aus einem Polysaccharid mit einem Molekulargewicht 400 000 und Natriumdiatrizoat getrennt, das von A.B. Pharmacia, Uppsala, Schweden, unter dem eingetragenen Warenzeichen Ficoll-Pague(R) erhältlich ist. Bevorzugte Verdrängungsflüssigkeiten zur Abtrennung mononukleärer Zellen aus Mischungen von Blutzellen haben eine Dichte von etwa 1,06 g/ml bis etwa 1,08 g/ml, und am meisten bevorzugt von etwa 1,07 g/ml bis etwa 1,08 g/ml.
- Die Rate, mit der die Verdrängungsflüssigkeit gegen die Zentrifugalkraft durch die Kammer hindurchgedrückt wird, ist nicht kritisch. Die Rate sollte so sein, daß die gewünschte Trennung innerhalb eines vernünftigen Zeitraums erzielt wird, ohne in der Kammer eine übermäßige Turbulenz herbeizuführen. Die Rate sollte ebenfalls so sein, daß die Lineargeschwindigkeit der Teilchen in der Mischung mit einer Dichte, die größer ist als diejenige der Verdrängungsflüssigkeit hinreichend kleiner ist als die Lineargeschwindigkeit der Verdrängungsflüssigkeit, um die gewünschte Trennung zu bewirken. "Lineargeschwindigkeit" bezieht sich auf die Geschwindigkeit, mit der Stoffe sich vom äußeren zentrifugalen Ende der Zentrifugen- Kammer hinweg zu dem inneren zentrifugalen Ende der Kammer hinbewegen. Vorzugsweise ist die Geschwindigkeit kleiner als diejenige, die nötig ist, um eine positive Lineargeschwindigkeit bei Teilchen in der Mischung herzustellen, die eine größere Dichte als die Verdrängungsflüssigkeit haben. Zu geeigneten Mitteln zum Hindurchdrücken der Verdrängungsflüssigkeit durch die Kammer zählen das Pumpen und eine durch Zentrifugalkraft oder Schwerkraft bewirkte Druckdifferenz. Nachdem die gewünschte Trennung herbeigeführt wurde, werden die vorher ausgewählten Teilchen mit einer Dichte, die kleiner als diejenige oder gleich derjenigen der gewählten Verdrängungsflüssigkeit ist, gesammelt. Vorzugsweise werden diese Teilchen gesammelt, sobald sie aus dem inneren zentrifugalen Ende der Zentrifugen-Kammer austreten.
- Das vorliegende Verfahren kann chargenweise, kontinuierlich oder als Kombination beider Arbeitsweisen durchgeführt werden. Vorzugsweise wird das Verfahren in einer geschlossenen Apparatur durchgeführt, und am meisten bevorzugt in einer geschlossenen Apparatur, die eine Zentrifugen-Kammer und Vorratsbeutel umfaßt, die miteinander durch Schläuche verbunden sind. Die Apparatur umfaßt ein Mittel zum Hindurchdrücken der Verdrängungsflüssigkeit durch die Zentrifugen-Kammer, oder sie ist so gestaltet, daß sie an ein solches Mittel angeschlossen werden kann. Die Apparatur wird in den Rotor einer Zentrifuge gebracht, der eine Mehrzahl von Hohlräumen enthält, die befähigt sind, die Kammer und die Aufbewahrungsbeutel zu umschließen. Der Rotor kann auch ein Mittel zum Hindurchdrücken der Verdrängungsflüssigkeit durch die Zentrifugen-Kammer aufweisen. Vorzugsweise ist das Mittel eine Schlauchpumpe, und die Apparatur ist mit sterilen Anschlußvorrichtungen kompatibel.
- Das Verfahren der vorliegenden Erfindung wird weiter beschrieben in den folgenden Beispielen, in denen alle Angaben betreffend Teile und Prozente sich auf die Zahlen beziehen und die Grad-Angaben Grad Celsius sind, sofern nichts anderes angegeben ist. Die folgenden Bereiche der spezifischen Gewichte sind für normale menschliche Blutzellen angegeben bei Sanderson, Cell Separation: Methods and Selected Applications, Band 1 (Academic Press, Inc., 1982): Lymphocyten von 1,065 bis 1,075 g/ml; Monocyten von 1,058 bis 1,068 g/ml; Granulocyten von 1,078 bis 1,09 g/ml; und rote Blutkörperchen von 1,04 bis 1,1 g/ml. Die Cytotoxizität von IL-2-behandelten mononukleären Zellen für Tumor-Zellen wurde gemäß der nachfolgenden Arbeitsweise im wesentlichen so bestimmt, wie dies in Selected Methods in Cellular Immunology, Hrsg. B.B. Mishell et al. (W.H. Freeman, San Francisco, 1980) auf S. 134-137 beschrieben ist, auf deren relevante Offenbarung hier ausdrücklich Bezug genommen wird.
- Eine Analyse der Freisetzung von &sup5;¹Cr über vier Stunden wurde zur Messung der Phytotoxizität der IL-2-behandelten mononukleären Zellen herangezogen. Mononukleäre Zellen wurden zu 1 x 10&sup6; Zellen/ml in einem Zellkulturmedium suspendiert, das RPMI 1640, einer bei M.A, Bioproducts, Walkersville, Maryland, im Handel erhältlichen gepufferten Lösung, 1 (Vol.-)% Pen-strep, einer Penicillin- und Streptomycin-Zusammensetzung, die bei Gibco Co., Grand Island, N.Y., im Handel erhältlich ist, 1 (Vol.-)% Glutamin, 1 (Vol.-)% ABM, eine antibiotische und antimycotische Zusammensetzung, die bei Gibco Co. im Handel erhältlich ist, enthielt und 20 mmolar an HEPES war, einem CO&sub2;-Puffer, der bei Gibco Co. im Handel erhältlich ist. Das Zellkulturmedium wurde mit 1500 pmolarem rekombinanten IL-2 und 10 (Vol.-)% Human-Serum vereinigt. Das resultierende Gemisch wurde 3 bis 5 Tage bei 37 ºC inkubiert. Nach der inkubationsperiode wurden nichtanhaftende Zellen geerntet und erneut in dem oben beschriebenen Zellkulturmedium, das durch 10 (Vol.-)% Human-Serum ergänzt war, suspendiert.
- Zwei Millionen Burkitt-Lymphom-Zellen (Raji, ATCC CCL 86) wurden mit 50 uCi Na&sub2; &sup5;¹CrO&sub2; in 0,4 ml tris-phosphat-gepufferter Kochsalz-Lösung 1 h bei 37 ºC inkubiert. Die Zellen wurden dann viermal mit der oben beschriebenen gepufferten Lösung (RPMI 1640) gewaschen, die 5 (Vol.-)% fötales Kalbsserum enthielt, und zu einer Konzentration von 10&sup5; Zellen/ml erneut in der gepufferten Lösung (RPMI-1640) mit 10 (Vol.-)% Human- Serum suspendiert. Die IL-2-behandelten mononukleären Zellen und die mit &sup5;¹Cr behandelten Lymphom-Zellen wurden in Zell- Verhältnissen (mononukleär : Lymphom) von 5 : 1, 20 : 1 und 50 : 1 in Rundboden-Mikrotiter-Platten gegeben. Die Platten wurden 5 min bei 200 x g zentrifugiert, 4 h bei 37 ºC inkubiert und wiederum bei 200 x g zentrifugiert. 0,1 ml der resultierenden Überstände wurden aus jedem Näpfchen (Well) entnommen und in einem gamma-Zähler gezählt. Der Überstand von mit &sup5;¹Cr behandelten Lymphom-Zellen, die nicht mit den IL-2- behandelten mononukleären Zellen kombiniert wurden, und von lysierten, mit &sup5;¹Cr behandelten Lymphom-Zellen wurden ebenfalls in einem gamma-Zähler gezählt. Die prozentuale Toxizität wurde gemäß der nachstehenden Formel errechnet, worin "Experiment cpm" die Counts pro Minute (cpm) des Überstandes der Kombination aus den IL-2-behandelten mononukleären Zellen und den mit &sup5;¹Cr behandelten Lymphom-Zellen, "Spontan cpm" die cpm des Überstandes der mit &sup5;¹Cr behandelten Lymphom-Zellen und "Total cpm" die cpm des Überstandes der lysierten, mit &sup5;¹Cr behandelten Lymphom-Zellen bedeuten.
- % Cytotoxizität = (Experiment cpm - Spontan cpm) x 100/Total cpm - Spontan cpm
- In den Beispielen 4, 5 und 6 und den Vergleichsversuchen A, B und C wurde die Cytotoxizität in Dreifach-Bestimmungen ermittelt.
- Mononukleäre Zellen wurden aus einem Gemisch von Blut-Zellen in einer zylindrischen Zentrifugen-Kammer mit einem Innendurchmesser von etwa 5,08 cm (2 Zoll) abgetrennt. Jedes Ende der Kammer hatte Kegelform, so daß der gerade Seitenabstand der Kammer etwa 9,144 cm (3,6 Zoll) betrug und der Abstand Ende-zu-Ende etwa 11,684 cm (4,6 Zoll) betrug. Die Kammer wurde mit steriler, phosphat-gepufferter Kochsalz-Lösung gefüllt und der Einwirkung einer Zentrifugalkraft von etwa 900 x g ausgesetzt. 40 ml eines an Leukocyten reichen Gemischs von Blutzellen, das durch Zentrifugieren aus etwa 450 ml Vollblut hergestellt worden war, wurden mit Hilfe einer Injektionsspritze in das äußere zentrifugale Ende der Kammer hineingepumpt. Das an Leukocyten reiche Gemisch von Blutzellen enthielt etwa 2 x 10¹¹ rote Blutkörperchen und etwa 2 bis 4 x 10&sup9; weiße Zellen. Die Population der weißen Zellen enthielt etwa 1 bis 2 x 10&sup9; Granulocyten, etwa 0,8 bis 1,6 x 10&sup9; Lymphocyten und weniger als etwa 0,2 bis 0,4 x 10&sup9; Monocyten. Mit Hilfe eines Fensters im Oberteil der Zentrifuge und einem Stroboskop-Licht unterhalb der Kammer war zu erkennen, daß das Gemisch im äußeren Ende der Kammer verblieb.
- Sobald das Pumpen des Zellengemischs beendet war, wurde ein Gemisch aus einem Polysaccharid mit einem Molekulargewicht 400 000 und Natriumdiatrizoat, das von A.B. Pharmacia, Uppsala, Schweden, unter dem eingetragenen Warenzeichen Ficoll-Pague(R) erhältlich ist, mittels einer Schlauchpumpe mit einer Rate von 4 ml/min in das äußere Ende der Kammer hineingepumpt. Das Gemisch aus Polysaccharid und Natriumdiatrizoat hatte eine Dichte von 1,077 g/ml. Nach 7-minütigem Pumpen des Gemischs aus Polysaccharid und Natriumdiatrizoat trennte sich eine bestimmte Zellschicht von dem Rest des Gemischs. Dieses Pumpen wurde fortgesetzt, bis die Zellschicht aus dem inneren zentrifugalen Ende der Kammer herausgedrückt wurde. Aus dem inneren zentrifugalen Ende der Kammer herausgedrückte Proben wurden gesammelt und auf ihren Gehalt an weißen Zellen analysiert. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1 Probe Volumen (ml) Dichte (g/ml) Gesamtz. d. weißen Zellen n.b. = nicht bestimmt
- Es wurde gefunden, daß die Probe 1 etwa 85 % der gesammelten weißen Zellen enthielt und 100 % mononukleäre Zellen umfaßte, mit 65 % Lymphocyten, 17 % Monocyten und 13 % großen granulären Lymphocyten. Es wurde gefunden, daß der Rückstand aus der Zentrifugen-Kammer etwa 100 % Granulocyten und rote Blutkörperchen umfaßte.
- Die in Beispiel 1 beschriebene Arbeitsweise wurde im wesentlichen wiederholt, jedoch mit der Abweichung, daß das Gemisch aus Polysaccharid und Natriumdiatrizoat erst in die Kammer hineingepumpt wurde, nachdem sich das Gemisch aus Blutzellen in Schichten aus Plasma, weißen Zellen und roten Blutkörperchen aufgetrennt hatte (etwa 10 min). Die Zentrifugalkraft betrug etwa 900 x g, und das Gemisch aus Polysaccharid und Natriumdiatrizoat wurde mit einer Rate von 4,5 ml/min eingespeist. Aus dem inneren zentrifugalen Ende der Kammer herausgedrückte Proben wurden gesammelt und auf ihren Gehalt an weißen Zellen analysiert. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2 Probe Volumen (ml) Dichte (g/ml) Gesamtz. d. weißen Zellen n.b. = nicht bestimmt
- Es wurde gefunden, daß die Proben den in Tabelle 3 aufgeführten Gehalt an weißen Zellen aufwiesen. Tabelle 3 Probe Mononukleäre Zellen (%) Gehalt an weißen Zellen Lymphocyten, Monocyten, große granuläre Lymphocyten; Eosinophile, unbestimmt; segmentierte Neutrophile,
- Mononukleäre Zellen wurden aus einer Probe von 45 ml konzentrierter Blutzellen nach einer Arbeitsweise ähnlich der in Beispiel 2 beschriebenen abgetrennt. Die Probe, die eine Zell- Population von 15 % Lymphocyten, 2 % Monocyten und 83 % Granulocyten hatte, wurde in die Zentrifugen-Kammer gepumpt und sich in Schichten aus Plasma, weißen Zellen und roten Blutkörperchen trennen gelassen (etwa 20 min). Die Zentrifugalkraft betrug etwa 900 x g, und das Gemisch aus Polysaccharid und Natriumdiatrizoat wurde mit einer Rate von etwa 5,6 ml/min eingespeist. Nachdem etwa 118 ml des Gemischs aus Polysaccharid und Natriumdiatrizoat in das Zentrifugen-Rohr hineingepumpt worden waren, begann Plasma aus dem inneren Ende der Kammer herausgedrückt zu werden. Nachdem weitere 14 ml des Gemischs aus Polysaccharid und Natriumdiatrizoat in die Kammer hineingepumpt worden waren, begannen Zellen aus dem inneren Ende der Kammer herausgedrückt zu werden. Weitere 19 ml des Gemischs aus Polysaccharid und Natriumdiatrizoat wurden in die Kammer hineingepumpt, und das resultierende, aus der Zentrifuge austretende Material wurde gesammelt. Eine differenzierte Zählung der weißen Zellen in dem aus der Zentrifuge austretenden Material ergab eine Zell-Population von 88 % Lymphocyten, 9 % Monocyten, 2 % großen granulären Lymphocyten und 1 % Granulocyten. Eine Gesamtmenge von 1,1 x 10&sup9; Blutzellen wurde gesammelt.
- Mononukleäre Zellen wurden aus einer Mischung aus Blutzellen und Plasma aus Leukophorese in der in Figur 1 dargestellten Apparatur abgetrennt. Austauschbare Befüllungsbeutel (1 und 3) wurden mit dem äußeren zentrifugalen Ende einer Zentrifugen- Kammer (4) durch Schläuche verbunden. Eine 60 ml-Spritze (2) und eine Schlauchpumpe (7) wurden mit den Schläuchen zwischen den austauschbaren Befüllungsbeuteln (1 und 3) verbunden. Ein austauschbarer Sammelbeutel (6) wurde mit dem inneren zentrifugalen Ende der Zentrifugen-Kammer (4) durch Schläuche verbunden.
- Die Zentrifugen-Kammer (4) wurde durch eine Bypass-Leitung ersetzt, und der Befüllungsbeutel (3) wurde von der Apparatur gelöst. Die entstandene Apparatur wurde dadurch sterilisiert, daß eine Lösung von 6 (Vol.-)% Hydrogenperoxid aus dem Befüllungsbeutel (1) zu dein Sammelbeutel (6) geleitet wurde. Eine sterile Kochsalz-Lösung wurde dann von dem Befüllungsbeutel (1) zu dem Sammelbeutel (6) geleitet, um das Hydrogenperoxid aus der Apparatur zu entfernen. Die Zentrifugenkammer (4) wurde sterilisiert, mit Kochsalz-Lösung gespült, mit der Apparatur verbunden und in einen Zentrifugen-Rotor (8) in einer Zentrifuge (9) gebracht. Ein 190 ml einer Mischung aus Blutzellen und Plasma aus der Leukophorese, als Probe A bezeichnet, enthaltender Befüllungsbeutel wurde als Befüllungsbeutel (3) steril angeschlossen, und die Schlauchleitung wurde bei Punkt b verschlossen. Die Zentrifuge (9) wurde eingeschaltet, und die Apparatur wurde durch Einleiten steriler Kochsalz- Lösung aus dem Befüllungsbeutel (1) unter Einsatz der Schlauchpumpe (7) und der 60 ml-Spritze (2) als Pumpquellen entlüftet.
- Bei in der unteren Position stehendem Kolben der Spritze, abgeschalteter Schlauchpumpe (7) und bei den Punkten a und b geöffneter und Punkt c geschlossener Schlauchleitung wurde der Kolben angehoben, um etwa 50 ml des Blutzellen-Gemischs in die Spritze (2) hineinzuziehen. Dann wurde die Schlauchleitung bei Punkt b geschlossen und bei Punkt c geöffnet, und die Mischung in der Spritze (2) wurde in die Apparatur injiziert. Es wurde beobachtet, daß Blutzellen in die Zentrifugen-Kammer (4) eintraten. Die Arbeitsweise wurde wiederholt, bis im wesentlichen die gesamte Mischung in die Zentrifugen-Kammer (4) eingespritzt worden war. Man ließ die Zellen etwa 10 min sich absetzen. Während dieser Zeit wurde ein 250 ml eines Gemischs aus Polysaccharid und Natriumdiatrizoat ähnlich dem in Beispiel 1 beschriebenen mit einer Dichte von 1,075 enthaltender Beutel als Befüllungsbeutel (1) an die Apparatur angeschlossen. Das Gemisch aus Polysaccharid und Natriumdiatrizoat wurde bis zu dem Punkt c gepumpt, um die Schlauchleitung von der Kochsalz-Lösung zu befreien. Das Gemisch aus Polysaccharid und Natriumdiatrizoat wurde dann mit einer Rate von 4 ml/min in die Zentrifugen-Kammer (4) gepumpt, während die Kammer (4) der Einwirkung einer Zentrifugalkraft von etwa 900 x g ausgesetzt wurde. Nachdem etwa 135 ml des Gemischs aus Polysaccharid und Natriumdiatrizoat in die Kammer (4) hineingepumpt worden waren, wurde der Sammelbeutel (6), der eine Mischung aus Kochsalz-Lösung und Plasma enthielt, gegen einen sterilen Beutel ausgetauscht, um die nachfolgenden Fraktionen aufzufangen. Etwa 45 ml einer Probe, als Probe B bezeichnet, wurden in dem Beutel (6) gesammelt und auf den Gehalt an weißen Zellen analysiert. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 4 dargestellt. Tabelle 4 Probe Rote Blutkörperchen Weiße Blut-Zellen Zellen-Gehalt (weiße Zellen) Lymphocyten Monocyten Granulocyten
- Die LAK-Aktivität der Probe B nach 3-tägiger Inkubation in IL-2 wurde bestimmt, und die Ergebnisse sind in Tabelle 5 und Figur 2 dargestellt.
- 10 ml der in Beispiel 4 verwendeten Mischung aus Blutzellen und Plasma aus der Leukophorese wurden im Volumenverhältnis 1 : 1 mit Seligmann's Balances Salt Solution (SBSS) verdünnt, einer bei Gibco. Co. im Handel erhältlichen sterilen Kochsalz- Lösung, und als Schicht über 20 ml des in Beispiel 4 beschriebenen Gemischs aus Polysaccharid und Natriumdiatrizoat in einem 50 ml-Zentrifugenrohr aufgebracht. Das Zentrifugenrohr wurde etwa 25 min der Einwirkung einer Zentrifugalkraft von etwa 400 x g ausgesetzt. Eine Schicht von Zellen an der Grenzfläche zwischen der Kochsalz-Lösung und dem Gemisch aus Polysaccharid und Natriumdiatrizoat wurde durch Pipettieren gesammelt und dreimal in der im Vorstehenden beschriebenen sterilen Kochsalz-Lösung 10 min bei 400 x g, 10 min bei 200 x g und 10 min bei 200 x g gewaschen. Die LAK-Aktivität der resultierenden Zellen nach 3-tägiger Inkubation in IL-2 wurde bestimmt, und die Ergebnisse sind in Tabelle 5 und Figur 2 dargestellt.
- Die in Beispiel 4 beschriebene Arbeitsweise wurde im wesentlichen wiederholt mit 154 ml einer Mischung aus Blutzellen und Plasma aus der Leukophorese. Während der Trennung wurde die Mischung einer Zentrifugalkraft von etwa 100 x g ausgesetzt. Die LAK-Aktivität der resultierenden Zellen nach 5-tägiger Inkubation in IL-2 wurde bestimmt, und die Ergebnisse sind in Tabelle 5 und Figur 3 dargestellt.
- Die in Vergleichsversuch A beschriebene Arbeitsweise wurde im wesentlichen wiederholt, wobei 10 ml der in Beispiel 5 verwendeten Mischung aus Blutzellen und Plasma aus der Leukophorese eingesetzt wurden. Die LAK-Aktivität der resultierenden Zellen nach 5-tägiger Inkubation in IL-2 wurde bestimmt, und die Ergebnisse sind in Tabelle 5 und Figur 3 dargestellt.
- Die in Beispiel 4 beschriebene Arbeitsweise wurde im wesentlichen wiederholt mit 185 ml einer Mischung aus Blutzellen und Plasma aus der Leukophorese. Während der Trennung wurde die Mischung einer Zentrifugalkraft von etwa 100 x g ausgesetzt. Die LAK-Aktivität der resultierenden Zellen nach 4-tägiger Inkubation in IL-2 wurde bestimmt, und die Ergebnisse sind in Tabelle 5 und Figur 4 dargestellt.
- Die in Vergleichsversuch A beschriebene Arbeitsweise wurde im wesentlichen wiederholt, wobei 10 ml der in Beispiel 5 verwendeten Mischung aus Blutzellen und Plasma aus der Leukophorese eingesetzt wurden. Die LAK-Aktivität der resultierenden Zellen nach 4-tägiger Inkubation in IL-2 wurde bestimmt, und die Ergebnisse sind in Tabelle 5 und Figur 4 dargestellt. Tabelle 5 Cytotoxizität von IL-2-behandelten mononukleären Zellen für Tumor-Zellen Beispiel oder Vergleichsbeispiel Zellen-Verhältnis IL-2-behandelte mononukleäre Zellen : Lymphom-Zellen % &sup5;¹Cr freigesetst
Claims (8)
1. Verfahren zur Abtrennung vorgewählter Teilchen aus einer die
Teilchen enthaltenden Mischung, umfassend
das Halten der Mischung in einer Zentrifugen-Kammer,
das Einwirkenlassen einer Zentrifugalkraft auf die Kammer
und
das Hindurchdrücken einer Verdrängungsflüssigkeit durch die
Kammer gegen die Zentrifugalkraft, um dadurch die
vorgewählten Teilchen von der Mischung abzutrennen,
worin die Verdrängungsflüssigkeit eine Dichte hat, die
größer als die Dichte oder gleich der Dichte der
vorgewählten Teilchen ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Mischung einer
Zentrifugalkraft ausgesetzt wird, um die Mischung zu schichten,
bevor die Verdrängungsflüssigkeit gegen die Zentrifugalkraft
durch die Kammer hindurchgedrückt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, worin die vorgewählten Teilchen
einen Durchmesser von etwa 1 um bis zu etwa 0,25 cm haben.
4. Verfahren nach Anspruch 1, worin die vorgewählten Teilchen
mononukleäre Blutzellen sind.
5. Verfahren nach Anspruch 4, worin die Verdrängungsflüssigkeit
eine Dichte von etwa 1,06 g/ml bis etwa 1,08 g/ml hat.
6. Verfahren nach Anspruch 5, worin die Verdrängungsflüssigkeit
ein Gemisch eines Polysaccharids mit einem Salz mit hohem
Molekulargewicht ist.
7. Verfahren nach Anspruch 2, worin die Zentrifugalkraft etwa
100 x g bis etwa 15 000 x g beträgt.
8. Verwendung des Verfahrens nach Anspruch 4 zur Abtrennung
mononukleärer Zellen aus einer Mischung von Blutzellen,
wobei die mononukleären Zellen mit einem Lymphokin,
Interleukin-2, in Berührung gebracht werden, um
Lymphokinaktivierte Killer-Zellen in den mononukleären Zellen zu
aktivieren und Lymphokine mit Antitumor-Reaktivität zu
erzeugen.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US06/844,959 US4708710A (en) | 1986-03-27 | 1986-03-27 | Particle separation process |
Publications (2)
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