-
1, Begründung UND GEGENWÄRTIGER STAND
-
Im gesamten Bereich der analytischen Biochemie und biochemisch orientierten
Zellbiologie, insbesondere bei Arbeiten mit Gewebe von Eukarionten, müssen Zellen
aufgebrochen und verschiedene Zellorganellen isoliert werden. Die Isolation von
instr zelluläre Organellen (Zellkernen, Mitochondrien, intrazellulären Vesikeln
und Granulae,Ribosomen, rauhem oder glattem endoplasmatischem Reticulum, Plasmamembrc
fragmenten) und ihre Abtrennung vom Cytoplasma ist heute als Standardprozedur anzusehen.
Während sich bisher die Untersucher auf die Isolation nur einer bestir ten Fraktion
festlegten und die anderen Fraktionen verwarfen, machen es neue Problemstellungen
notwendig, zwei oder drei Zellfraktionen gleichzeitig zu isolii ren, um Probleme
molekularer Interaktionen während z.B. des Zellzyklus untersucht zu können. Damit
wir4 die Entwicklung schnell verlaufender Zellfraktionierungstechniken, die umständliche
Reinigungsmethoden umgehen, vonnöten. Gegenwärtig isl die Methodik zur Isolation
von Zellorganellen auf diskontinuierliche Fraktionier techniken fokussiert, was
durch die in der Biochemie und Zellbiologie traditione Art des Zellaufbruches höherer
Zellen begründet ist.
-
Der Zellaufbruch, der Schlusselschritt für die gesamte Zellfraktionierung,
wird normalerweise noch in einem diskontinuierlichen Verfahren durchgeführt, wobei
si die Zellorganellen längere Zeit im enzymatisch aktiven Homogenat befinden. Dem
essentiellen Schritt des Zellaufbruchs folgt nun auch diskontinuierlich die Frak
tionierung der einzelnen Zellorganellen. (Verschiedentlich werden für die Auf art
tung großer Mengen Durchflußrotoren, wie sie von den auf dem Markt vertretenen F
men angeboten werden, verwendet, um eine spezielle Fraktion anzureichern.) Um di
se differentielle Fraktionierung durchführen zu können, sind meist zwei bis drei
Zentrifugen unterschiedlichen Drehzahlbereichs notwendig. Neben diesem apparativ
Aufwand sind bei der diskontinuierlichen Fraktionierung eine Reihe weiterer schw
wiegender Nachteile in Betracht zu ziehen:
i) Die Zellorganellen
befinden sich längere Zeit im enzymatisch aktiven Homogenat, wodurch die Zellorganellen
verändert werden (z.B. durch Proteasen). Der Zellaufbruch muß daher bei der relativ
unphysiologischen Temperatur von 40C durchgeführt werden (um die enzymatische Aktivitat
gering zu halten), bei der verschiedene Zellorganellen destruiert (Mikrotubuli)
bzw. verändert (Phasenentmischung bei Lipiden) sind.
-
ii) Plasmamembranvesikel, die in einem der Endschritte der Zellfraktionierung
gewonnen werden, stehen bei der traditionellen Methodik erst nach ein bis eineinhalb
Tagen zur Verfugung.
-
iii) Das immer wieder durchzuführende Be- und Entladen der Rotoren
stellt einen großen Arbeitsaufwand dar.
-
iv) Für die Reproduzierbarkeit ergeben sich durch verschiedene subjektive
Parameter, wie Resuspendieren der Niederschläge, das Einhalten von Zeitintervallen
zwischen einzelnen Zentrifugenschritten, die Temperaturkontrolle beim Hantieren
mit dem biologischen Material, immer wieder Schwierigkeiten.
-
lis BESCHREIBUNG DES ZELLFRAKTIONATORS Diese oben beschriebenen Probleme
sollen durch einen kontinuierlich arbeitenden Zellfraktionator umgangen und die
gesamte Arbeitsprozedur der differentiellen Zentrifugation automatisiert werden.
-
Eine wichtige Voraussetzung für das Arbeiten mit dem Zellfraktionator
IStr daß das biologische Material als Einzelsellsuspension vorliegt. Durch die Einführung
der Methoden der Trypsinierung bzw. Gollagenasebehandlung wurde es in den letzten
Jahrell ermöglicht, Gewebe in eine Einzelzellsuspension zu desintegrieren. Verschiedene
Techniken der Zellkultur von Mammaliazellen resultieren ebenfalls in Einzelzellsuspensionen.
So
kann nunmehr beim Zellaufbruch generell von einer Einzelzelisuspension ausgegangen
werden. Dies ist besonders wichtig für die Isolation der Plasmamembran, da nur bei
einem solchen Ausgangsmaterial, das aus Einzelzellen besteht mit einer annähernd
quantitativen Isolation der Zellmembran gerechnet werden kan Der hier vorgeschlagene
kontinuierlich arbeitende Zellfraktionator kann wie folg charakterisiert werden:
i) Ausgangsmaterial ist eine Einzelzellsuspension in einem Behälter, die in ein
kontinuierlich arbeitendes Zellaufbruchgerät gepumpt wird.
-
ii) Der Zellaufbruch erfolgt mechanisch durch Scheerkrafte an einer
Düse.
-
iii) Vom Zellaufbruch wird das Homogenat direkt in eine Reihe hintereinander
geschalteter Durchflußrotoren geleitet. Je nach Konstruktion der Durchflußrotoren
wird das Material in den Rotoren pelletiert oder aus den Rotoren eluiert.
-
iv) Um nicht mehrere Zentrifugen hintereinander schalten zu müssen,
wird der ZE fraktionator aus Modulen zusammengesetzt aufgebaut.
-
v) Nach jedem Fraktionierungsschritt fließt das biologische Material
durch eir 55Detektorstraße'11 die je nach Fragestellung die Messung folgender Parametel
erlaubt: Trübung, Absorption bei verschiedenen Wellenlängen (286 nm, 254 nr Fluoreszenz,
Radioaktivität (ß-Strahlung). Die Intensitäten werden von einf Mehrkanalschreiber
aufgenommen und über einen Rechner integriert. Mit diese Detektorsystem ist ein
genaues Reproduzieren der Zellfraktionierung möglid da noch während einer Fraktionierungsprozedur
Abweichungen im Sedimentation verhalten einer Fraktion festgestellt und korrigiert
werden kann. Dies ist den bisherigen Techniken nicht möglich. Der Einbau von Detektoren
für Radio aktivitätsmessungen wird es erlauben, mit Minimalmengen an biologischem
Material zu arbeiten.
-
Der Schutzanspruch wird erhoben auf (1) die Kombination von kontinuierlichem
Zellaufbruch mit Durchlaufrotor, (2) auf den Aufbau eines Zellfraktionators als
Modulsystem aus Elementen der handelsüblichen Zentrifugen, und (3) auf die kontinuierliche
Beobachtung des Fraktionierungsvorganges, der eine Korrektur wahrend der Zellfraktionierung
durch den Einbau einer "Detektorstraße" nach jedem Fraktionierungsschritt erlaubt.
-
Die Vorteile dieses Systems sind im folgenden zu sehen: ad 1) a) Durch
die Kombination yon kontinuierlichem Zellaufbruch mit Durchflußrotoren wird es vermieden,
daß die Zellorganellen sich für längere Zeit im eigenen Homogenat befinden, da sie
direkt sofort nach Aufbruch an der Düse der Fraktionierung unterzogen werden. Der
Zellaufbruch kann bei physiologischen Teuypcraturen durchgeführt werden, da das
Material nach dem Zellaufbruch sofort abgekühlt und fraktioniert wird. Damit wird
das Problem temperaturinduziertcr Artefakte umgangen (Mikrotubulidesintegration,
Lipidphasenentmischung).
-
b) Dadurch werden subjektive Parameter, wie Einhalten von Zeitintervallen,
Temperaturkontrolle beim Hantieren, die die Reproduzierbarkeit des Zellaufschlus
ses beeinflussen, ausgeschaltet. Ebenso reduziert sich die Arbeitsintensitat, die
sich durch das Be- und Entladen der Rotoren bei diskontinuierlicher Fraktionierung
ergibt.
-
c) Ein wesentlicher Vorteil ergibt sich durch den geringen Zeitaufwand,
da die Fraktionierungszeit für die leichteres Zellfraktionen von einem bis eineinhalb
Tagen reduziert wird auf etwa zwei bis drei Stunden. Dies ist für die Qualität des
isolierten biologischen Materials von besonderer Wichtigkeit.
-
ad 2) Prinzipiell wäre ein kontinuierlich arbeitendes Zellfraktionierungssystem
aus den Hintereinanderschalten von mehreren Zentrifugen hinter eine kontinuierlich
arbeitende Zellaufbruchsmaschine aufbaubar. Da jede Zentrifuge aus Antrieb mit Rotorkammer,
Kühlungssystem, Vakuumpumpe mit blkontrollsystem, Diffusionspumpe, Transformatoreinheit
und elektronischer Steuereinheit besteht, wurden beim Aufbau eine solchen Systems
mehrere Maschinenteile wie Kühlung, Vakuumsystem usw. in mehrfacher Ausfertigung
aufgestellt und Verbindungsleitungen zwischen den einzelnen Zer fugen von unnötiger
Länge erfordern. Dies schlagt sich sowohl im Platzbedarf als auch in den Kosten
nieder Aus diesem Grund wurde der Aufbau eines Zellfraktionators als Baukasten-
oder Modulsystem konzipiert, bestehend aus Transformatormodul, elektronischem Steuerun
modul, Vakuummodul, Diffusionspumpenmodul, Kühlmodul, Antrueb-Rotorenkammermodul,
Reservoir/Pumpenmodul und Detektormodul. Der Vorteil eines solchen Systems ist,
d a) ein Zellfraktionator nach und nach aufgebaut werden kann, b) eine variable
Bestückung gem. der Problemstellung in Abhängigkeit des zu unter suchenden biologischen
Materials möglich ist, d.h. der Zellfraktionator ist fü das Seperationsproblem adaptierbar;
c) dadurch, daß die Module einzeln ansteuerbar sind, kann ein ausgebauter Zellfraktionator
gleichzeitig auch als konventionelle Zentrifuge verwendet werden.
-
Als Zellfraktionator verwendet, werden sie kollektiv über ein Programnl
gesteue Wird mit traditionellen Durchlaufrotoren gearbeitet, so wird das biologische
N terial sedimentiert. Werden hingegen neue Rotortypen (siehe G. Brunner, Beschr
bung eines asymmetrischen Flügelrotors) verwendet, die eine Elution des Materi erlauben,
so wird dasvfraktionierte Material bereits in suspendierter Form erhalten.
-
d) bei Verwendung des Modul systems legt das zu fraktionierende biologische
Mater zwischen den einzelnen Durchlaufrotoren kürzere Wegstrecken zurück.
-
ad 3) Nach jedem Fraktionierungsgang, d.h. nach Austritt des biologischen
Materials von einem Durchflußrotor passiert es eine "Detektorstraße", an der verschiedene
Meßzellen angeordnet sind. Im einfachsten Fall wird eine optische Absorptionsmessung
bei 286 nm und 254 nm durchgeführt. Die Intensitäten werden von einem Schreiber
aufgezeichnet. Durch Erhohung oder Erniedrigung der Umdrehungszahlen des Rotors
oder der Pumpgeschwindigkeit kann der Schreiberausschlag auf die genormte Position
eingestellt werden. Dadurch sind Korrekturen zu Beginn einer Fraktionierungsprozedur
moglich, womit die Reproduzierbarkeit eines Fraktionierungsschemas gewahrleistet
wird. Gleichzeitige Integration der Intensitäten erlaubt eine Quantifizierung der
Fraktionierung, sodaß mit vollendeter Fraktionierung auch eine erste Quantifizierung
vorliegt. Die Sensibilität dieses Systems kann erhoht werden durch Zugabe fluoreszierender
Markersubstanzen vor dem Zellaufbruch oder durch einen kurzen radioaktiven Puls
des biologischen Materials vor dem Zellaufbruch und durch den Einbau entsprechender
Detektoren in der Detektorstraße.
-
III. ERLÄUTERUNGEN ZU DEN ABBILDUNGEN Abb. 1 gibt ein Blockschema,
wie durch das Hintereinanderschalten mehrerer Zentrifugen mit Durchflußrotoren nach
einem kontinuierlich arbeitenden Zelldisrupter ein kontinuierlich arbeitender Zellfraktionator
mit zur Zeit auf dem Markt befindlichen Geräten zusammengestellt werden konnte.
Eine solche Konstruktion hat neben dem erhöhten Platzbedarf und den hohen Kosten
eine Reihe weiterer Nachteile: Uberleitungsprobleme von einer Zentrifuge in die
nächste, Abstimmung der Pumpgeschwindigkeiten, Kühlung der Reservoirs, usw.
-
Diese Probleme werden durch den Aufbau des Zellfraktionators als
Modulsystem weist~ gehend umgangen. Dabei solleh folgende Module Verwendung finden:
raum'
zur Verfügung zu haben. Das Reservoir ist an einer Seite von einem beweg lichen
Stempel abgeschlossen, sodaß sich der benötigte Reservoirraum beliebig einstellen
läßt.
-
Detektionsmodul, bestehend aus einer Zentraleinheit (DtM), in der
die Kontroll einheiten für die optischen Meßsysteme, Schreiber, Integrator und Rechner,
ver einigt sind und aus Peripherie-Detektormodulen (DtNp), die als Detektorstraße
dem Zellaufbruch und jedem Fraktionierungsschritt nachgeschaltet sind. An der Detektorstraße
sind die optischen Einheiten für die Absorptions- und Fluoreszenzmessungen und Bohrlochkristalle
mit Photomultiplier für die Radioaktivitätsmessung angeordnet.
-
Zelldisruptermodul (ZDM) (Zellaufbruchsmodul) besteht im wesentlichen
aus einer Hochdruckchromatographie-Pumpe, die das biologische Material, die Einzelzellsuspension,
anpumpt und durch eine Düse definierter Spaltbreite preßt, wodurch die Zellen mechanisch
aufgebrochen werden. Im Gegensatz zu dem sich bisher auf dem Markt befindlichen
Gerät (Stansted Cell Disrupter), das mit einer luftgetriebenen Pumpe arbeitet, soll
für den Zelldisrupter eines Zellfraktionators eine Hochdruckchromatographiepumpe
verwendet werden, da sich diese durch geringe Pulsation auszeichnet.
-
Abb. 2 gibt ein Verlaufschema von Zellaufbruch bis zum ersten Zentrifugationsschritt
weiser. Die Zellsuspension (ZS) wird mit Hilfe einer Hochdruckchromatographiepumpe
(HP) durch den Zelldisrupter (ZDM) gepreßt, wobei die Zellen desintegriert werden.
Beim Austritt aus dem Zelldisrupter, bevor das Material in das Peripherie-Detektormodul
(DtMp) gelangt, kann es durch Kühlschlangen auf 4°C abgekühlt werden. ArX der Detektorstraße,
aus einer Quarzküvette bestoher wird bei D1 und D2 die Absorption z.B. bei 280 nm
und 254 nm, bei D3 dio Fluoreszenz im 90° Winkel gemessen und bei D4, einem Bohrlochkristall
mit Photomultiplier, die Radioaktivität. Als Detektorgeräte können Geräte, wie
i)
Module homolog zu den Bausteinen bei heute verwendeten Zentrifugen: Transformatormodul
(TM) Antriebsmodul (AM), bestehend aus Antrieb-Rotorkammer mit Kühl schlange und
Durchflußrotor. Die Durchflußrotoren sind gegen konventionelle Rotoren austauschbar,
sodaß ein Modul auch für übliche Zentrifugationstechniken verwendet werden kann.
Dieses Antriebsmodul ist für verschiedene Drehzahlbereiche ausgelegt: - LZAM mit
einem Drehzahlbereich von Laborzentrifugen, - KZAM mit einem Drehzahlbereich von
Kühlzentrifugen, - UZAM mit einem Drehzahlbereich von Ultrazentrifugen, - DZAM differentielles
Zentrifugationsmodell mit dem Drehzahlbereich von hochtourigen Kühlzentrifugen,
jedoch für die Aufnhame asymmetrischer Flugelrotoren ausgebaut (siehe G. Brunner,
Beschreibung eines asymmetrischen Flügelrotors).
-
Kühimodul (KM); es ist mit einem wesentlich leistungsstärkeren Kühlaggregat
ausgestattet als bei einer einzelnen Zentrifuge üblich. Dieses Kühlaggregat versorgt
alle Antriebsmodule und Systeme, die gekühlt werden müssen (wie RPM und DtMp).
-
Vakuummodul (VM) Diffusionspumpenmodul (DM) Steuerungsmodule (SM),in
verschiedenen Varianten gefertigt, je nachdem ob sie für Einzelsteuerung oder als
programmierbare Mehrfachsteuereinheiten ausgelegt sind.
-
ii) Für die nachfolgenden Module gibt es bisher bei den verschiedenen
Zentrifugentypen keine homologen Bausteine: Reservoir/Pumpenmodul- (RPM) wird zwischen
den einzelnen Durchflußrotoren (AM) zwischengeschaltet. Das Reservoir ist notwendig,
um bei differenten Durchflußgeschwindigkeiten aufeinanderfolgende Durchflußrotoren,
die für das eine oder andere Separationsproblem notwendig sein könnten, einen bestimmten
'Puffersie
in der Säulenchromatographie üblich sind, adaptiert
werden. Von der Detektorstraße gelangt das biologische Material in das Reservoir-Pumpenmodu
(RPM) und von dort in das Antriebsmodul (AM) mit dem Durch fluß rotor, im vor liegenden
Fall als ersten Zentrifugationsschritt ein Antriebsmodul im Drehzahlbereich von
Laborzentrifugen (LZAM). Das biologische Material, im vorliegenden Fall Zellkerne,
werden pelletiert und nach Beendigung der Zentrifugation entnommen. Bei Verwendung
eines differentiellen Zentrifugationsmoduls (DZAM) (siehe G. Brunner, Beschreibung
eines asymmetrischen Flügelrotors) wird die Pelletion vermieden und die Kerne werden
in Suspension elu: Im Zellfraktionator würde dem Durchflußrotor nun eine Detektorstraße
(DtMp) ein Reservoir-Pumpenmodul (RPM) und wiederum ein Durchflußrotor (AM) folgen
Abb. 3 gibt die Anordnung einzelner Module eines Zellfraktionators bei einem Drehzahlbereich
einer Kühlzentrifuge wider. In dieser Anordnung ware das System auch als normale
Kühlzentrifuge verwendbar, da die Rotoren auswechselbar sind.
-
Abb. 4 gibt ein Blockschema für den Aufbau eines Zellfraktionators
aus Modulen wide Dieses System würde dem in Abb. 1 gegebenen System aus Einzelzentrifugen
ent sprechen. Die Module, die der obersten Reihe (KM, TM, VM, DM), haben 3/4 Höhe,
sodaß die Module der mittleren Reihe (ZDM, SM) sowohl an die Antriebsmodule (AM)
der untersten Reihe als auch an die Versorgermodule der obersten Reihe gut anschließbar
und kombinierbar sind. Die Module RPM und DtMp werden auf den Antriebsmodulen positioniert,
sodaß sie hier wiederum mit den Durchflußrotoren, ebenso aber mit den Steuerungseinheiten
gut kombinierbar sind.
-
Abb. 5: Durch Verwendung von differentiellen Zentrifugationsmodulen
(DtAM) kann der Aufbau des Zellfraktionators vereinfacht und ein Antriebsmodul eingespart
werden.
-
IV. LITERATURHINWEISE G. Brunner, E. Ferber and K. Resch: Fractionation
of membrane vesicles. I. A separation method for different populations of membrane
vesicles of thymocytes by affinity chromatography on Con A-Sepharose. Analytical
Biochemistry 80, 420 -429, 1977 G. Brunner, H.G. Heidrich, J.R. Golecki, H.C. Bauer,
D. Suter, P.M. Plückhahn and E. Ferber: Fractionation of membrane vesicles. II.
A separation method of membrane vesicles bearing different enzymes by free-flow-electrophorcsis.
Biochim. Biophys.
-
Acta 471, 195 - 212, 1977 G. Brunner: Die Struktur der Zellmembran
und ihre Bedeutung für Zelltriggering und zelldifferenzierung. HabiLitationsschrift,
Universität Innsbruck, 1977 G. Brunner, H.C. Bauer, D. Suter and V. Speth: Artefacts
produced during plasma membrane isolation. I. Cell disruption causes alterations
in the structure of the plasma membrane of thymocytes. Biochim. Biophys. Acta 507,
419 - 424, 1978 D. Suter, G. Brunner and E. Ferber: Subcellular localization of
y-glutamyl-transferase in calf thymocytes. Biochem. J. 175, 643 - 647, 1978 H.C.
Bauer, E. Ferber, J.R. Golecki and G. Brunner: Preparation and fractionation of
membrane vesicles of thymocytes after osmotic cell disruption. Hoppe Seyler's Z.
Physiol. Chem. (submitted for publication).
-
ABKÜRZUNGEN MODULE AM Antriebsmodul mit Rotorkammer und Durchflußrotor
LZAM Antriebmodul im Drehzahlbereich der Laborzentrifuge (bis 6000 KZAM Antriebmodul
im Drehzahlbereich der kühlzentrifuge (bis 25000 UZAM Antriebsmodul im Drehzahlbereich
der Ultrazentrifuge (bis 60 000 DEAM Antriebmodul für asymmetrische Flügelrotoren
(bis 25000 KM Kühlmodul TM Transformatormodul VM Vakuumpumpenmodul DM Diffusionspumpenmodul
SM Steuerungsmodule RPM Reservoir/Pumpenmodul DtM Detektormodul Zentraleinheit (Rechner,
Schreiber, Integrator) DtMp Detektormodul, Peripherieeinheit (Sensoren) ZDM Zelldisruptermodul
(Zellaufbruch) Df Durchflußrotor HP Hochdruckpumpe KA Kühl aggregat L Lampen P Pumpe
Pe Pellet (Sediment) PuG PuffercJdfäß R Reservoir SG Sammelgefäß ZS Zellsuspension