CN105973890A - 一种植物活性物质的筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种活性物质的筛选方法，包括：a)从猪脑中分离并纯化微管蛋白；b)对微管蛋白进行荧光标记，得到荧光标记的微管蛋白；c)将微管蛋白、荧光标记的微管蛋白和待筛选物质混合后进行聚合反应；d)对聚合产物进行显微观察，获得显微照片；运用计算机软件定量显微照片中微管蛋白的数量、长度和粗度；对数据进行转化分析，根据结果确定待筛选物质的活性。本发明在离体条件下对猪脑微管蛋白进行荧光标记，运用计算机软件定量聚合反应后微管蛋白的密度、长度频率分布等作为衡量影响微管蛋白成核化、伸长或缩减因素的评价指标，从而判断植物活性物质对微管蛋白聚合的影响，为发掘植物活性物质的高通量筛选研究提供了方法模型。

Description

一种植物活性物质的筛选方法

技术领域

本发明属于植物活性成分利用技术领域，尤其涉及一种植物活性物质的筛选方法。

背景技术

随着分子生物学、免疫学、活性成分提取和分离等技术的发展和成熟，活性物质的研究也快速发展，尤其是抗肿瘤药物的筛选。

现有技术公开了两种活性成分筛选方法，一种是运用分子生物信息学手段进行细胞系突变体构建(Vajihe Akbari et al.,2011)，或通过序列比对提出理论上假定的作用位点(Dostal&Libusova,2014)，发掘对外源信号(如：次生代谢产物、病原菌)刺激的相关响应基因(如：抗癌相关基因、抗病相关基因)，其典型过程如图1所示。这种方法涉及到载体构建、遗传转化等步骤，实验周期较长。

第二种方法是构建微管蛋白荧光标记细胞系，对该细胞系进行外源信号(如：次生代谢产物、病原菌)刺激，运用转牒激光共聚焦显微镜技术，对微管蛋白进行实时示踪，观察微管蛋白的变化(Guan etal.,2015)，其典型过程如图2所示。这种方法需要构建微管蛋白荧光标记细胞系，从而需要进行遗传转化，而获得转基因植物较难，涉及到愈伤组织的发生、农杆菌介导的遗传转化、植株再生等步骤，不仅转化周期长，而且成功率低。同时，获得荧光标记细胞系后进行显微观察不仅需要分辨率高、对待观察样品漂白程度低的转碟激光共聚焦显微镜，而且对操作人员的实验技术要求较高。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种活性物质的筛选方法，不仅周期较短，而且操作简便。

本发明提供了一种活性物质的筛选方法，包括：

a)从猪脑中分离并纯化微管蛋白；

b)对步骤a)得到的微管蛋白进行荧光标记，得到荧光标记的微管蛋白；

c)将步骤a)得到的微管蛋白、步骤b)得到的荧光标记的微管蛋白和待筛选物质混合后进行聚合反应；

d)对步骤c)得到的聚合产物进行显微观察，获得显微照片；采用计算机软件定量所述显微照片中微管蛋白的数量、长度和粗度数据；

e)对步骤d)得到的数据进行转化分析，获得微管蛋白的密度和长度频率分布，并根据所述密度和长度频率分布确定待筛选物质的活性。本发明在离体条件下对微管蛋白进行荧光标记，通过读取并运用计算机软件定量聚合反应后微管蛋白的密度、长度的频率分布等作为衡量影响微管蛋白成核化、伸长或缩减因素的评价指标，从而获得植物，尤其是柑橘活性物质对微管蛋白聚合程度的影响，为发掘具有抗癌作用的植物活性物质的高通量筛选研究提供了方法模型。

优选的，所述步骤a)具体为：

将切碎的猪脑在再组装溶液中洗涤后研磨，4℃、100000Xg离心1小时后取上清；

将上清液与含有甘油的再组装溶液混合后37℃温浴20分钟，然后25℃、100000Xg离心1小时，弃上清；

将得到的沉淀用预冷的再组装溶液悬浮，在冰上放置30分钟，然后4℃、100000Xg离心1小时，弃沉淀；

将得到的上清再次用含有甘油的再组装溶液混匀，加入三磷酸鸟苷37℃温浴20分钟，然后25℃，100000Xg离心1小时，弃上清；

将得到的沉淀在预冷的再组装溶液悬浮，0℃下放置30分钟，得到微管蛋白；

所述再组装溶液包括磺基脂肪酸甲酯钠盐、乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸、三磷酸鸟苷和氯化钠，所述再组装溶液的pH值为6.4。

优选的，所述步骤b)具体为：

将步骤a)得到的微管蛋白在37℃下聚合30分钟，然后在包括羟乙基哌嗪乙磺酸钠、氯化镁、乙二醇二乙醚二胺四乙酸和甘油的混合液中30℃离心，弃上清；

将得到的沉淀用包括羟乙基哌嗪乙磺酸钠、氯化镁、乙二醇二乙醚二胺四乙酸和甘油的混合液中悬浮，加入荧光染色剂混匀，37℃反应10分钟，然后在包括哌嗪-N，N-双(2-乙磺酸)、乙二醇二乙醚二胺四乙酸、氯化镁、三磷酸鸟苷、谷氨酸钾、甘油的终止液中，终止反应。30℃离心，弃上清；

将得到的沉淀用包括哌嗪-N，N-双(2-乙磺酸)、乙二醇二乙醚二胺四乙酸、氯化镁和三磷酸鸟苷的混合液重悬，得到荧光标记的微管蛋白。

优选的，所述步骤c)具体为：

将步骤a)得到的微管蛋白、步骤b)得到的荧光标记的微管蛋白和三磷酸鸟苷溶于包括哌嗪-N,N'-双(2-乙磺酸)/氢氧化钠、硫酸镁、乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸的PME缓冲液，分别加入待筛选物质和对照物质，37℃聚合1小时，分别获得实验组聚合产物和对照组聚合产物。

优选的，所述对照物质为二甲基亚砜。

优选的，所述步骤d)具体为：

d1)分别对步骤c)得到的实验组聚合产物和对照组聚合产物进行显微观察，分别获得实验组显微照片和对照组显微照片；

d2)采用ImageJ软件分别对实验组显微照片和对照组显微照片中微管蛋白的数量和长度，根据所述数量和长度获得所述待筛选物质的活性。

优选的，所述待筛选物质为柑橘次生代谢产物。

优选的，所述柑橘次生代谢产物按照以下方法制备：

将柑橘果实烘干后粉碎，用乙醇热提，获得的提取物过滤、浓缩后冻干。

优选的，所述热提的温度为80℃，时间为2小时；

所述乙醇的体积浓度为90％。

参见图3，图3为本发明实施例提供的筛选方法的流程示意图，首先分离微管蛋白，然后进行荧光标记，最后离体聚合后加入次生代谢产物(待筛选物质)进行侵染，将得到的产物进行显微观察，最后采用计算机软件进行定量分析，最终获得待筛选物质的活性。

与现有技术相比，本发明首先从猪脑中分离并纯化微管蛋白，然后对所述微管蛋白进行荧光标记，将微管蛋白、荧光标记的微管蛋白和待筛选物质混合后进行聚合反应，对得到的聚合产物进行显微观察，计算得到的显微照片中微管蛋白的数量和长度，从而判断待筛选物质的活性。在本发明中，利用微管蛋白的聚合特性作为理论依据，与现有方法相比具有独创性。将微管蛋白离体后与待筛选物质进行聚合反应，操作简便，降低了筛选难度。更为重要的是，本发明采用计算机对显微照片中微管蛋白的数量和长度进行计算，判断待筛选物质对微管蛋白聚合的影响程度，从而获得待筛选物质的活性，不仅实验周期较短，而且操作简便。

附图说明

图1为现有技术提供的第一种筛选方法流程示意图；

图2为现有技术提供的第二筛选方法流程示意图；

图3为本发明实施例提供的筛选方法的流程示意图；

图4是不同来源柑橘活性物质对离体猪脑微管蛋白数目的影响；

图5是不同来源柑橘活性物质对离体猪脑微管蛋白长度的影响；

图6是不同来源柑橘活性物质对离体猪脑微管蛋白粗度的影响；

图7～图17是不同实验组微管蛋白长度数据的频率分布图。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

1、待筛选物质的提取：

将柑橘果实在50℃烘干，用粉碎机研成粉末；在80℃用90％乙醇将上述粉末提取2小时；将提取物通过Whatman1号滤纸过滤，然后在40℃用旋转蒸发仪通过逐渐降低压力的方式将滤液浓缩，最后进行冻干，得到待筛选物质，-20℃保存；

2、分离微管蛋白：

运用依赖于温度的两次循环实现微管蛋白的组装/去组装，将微管蛋白从新鲜的猪脑中纯化(Shelanski et al.,1973)，详细步骤为：

在猪被屠宰后2小时内分离获得新鲜的猪脑，并将猪脑置于冰上；将猪脑切碎，浸泡在4℃再组装溶液中，再组装溶液包括：0.1M磺基脂肪酸甲酯钠盐、1mM乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸、1mM三磷酸鸟苷、0.5mM氯化钠(pH 6.4)。将切碎的猪脑组织在再组装溶液里洗涤两次，按1g组织：1ml溶剂的比例加入再组装溶液充分研磨。然后4℃，100000Xg离心1小时，取上清，加入同等体积的含有8M甘油的再组装溶液，混合均匀。37℃温浴20分钟。25℃，100000Xg离心1小时。弃上清，将沉淀用预冷的再组装溶液悬浮，在冰上放置30分钟。4℃，100000Xg离心1小时，弃沉淀。将上清再次用等体积的含有8M甘油的再组装溶液混匀，加入三磷酸鸟苷至1mM终浓度。37℃温浴20分钟。25℃，100000Xg离心1小时，将微管蛋白收集在沉淀中。用预冷的再组装溶液将沉淀悬浮，0℃，30分钟，使微管蛋白充分解聚，然后用等体积的含有8M甘油的再组装溶液混匀，-20℃保存，使用时用再组装溶液稀释到4M甘油浓度。

3、微管蛋白的标记和离体聚合

参照Altshuler et al.(2013)的方法，将以上得到的溶解于再组装溶液里的微管蛋白浓度调整为10mg/ml，通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳确定微管蛋白的纯度和质量，然后将部分纯化的微管蛋白与荧光团ATTO-488进行共轭效应结合(Portran et al.,2013)，详细步骤为：

将微管蛋白放置在37℃，30分钟，使其聚合。然后将其置于第一混合液中，30℃高速离心，所述第一混合液包括0.1M羟乙基哌嗪乙磺酸钠，pH8.6、1mM氯化镁、1mM乙二醇二乙醚二胺四乙酸、60％体积比甘油。弃上清，将沉淀用第二混合液悬浮，第二混合液包括0.1M羟乙基哌嗪乙磺酸钠，pH8.6、1mM氯化镁、1mM乙二醇二乙醚二胺四乙酸、40％体积比甘油，并加入1/10体积的100mM荧光染色剂NHS-ATTO，混匀，37℃，10分钟。加入2倍体积的终止液，终止液包括160mM哌嗪-N，N-双(2-乙磺酸)，pH 6.8、2mM乙二醇二乙醚二胺四乙酸、2mM氯化镁、2mM三磷酸鸟苷、100mM谷氨酸钾、40％体积比的甘油将荧光标记反应终止。30℃高速离心，将微管蛋白沉淀。将微管蛋白用溶液第三混合液重悬，所述第三混合液包括80mM哌嗪-N，N-双(2-乙磺酸)，pH 6.8、1mM乙二醇二乙醚二胺四乙酸、1mM氯化镁、1mM三磷酸鸟苷。使用前再进行一次聚合/解聚反应。值得注意的是，因为该微管蛋白没有经过离子交换色层分析，所以微管相关蛋白与微管蛋白同时存在。

纯化的猪脑微管蛋白与ATTO-488标记的微管蛋白聚合方法参照(Altshuler et al.,2013)聚合。具体步骤为：

12μl 10mg/ml步骤2获得的微管蛋白、4μl 10mg/ml ATTO-488标记的微管蛋白和0.8μl 100mM三磷酸鸟苷溶解于40μl PME缓冲液，PME缓冲液包括：100mM哌嗪-N,N'-双(2-乙磺酸)/氢氧化钠，pH 6.9、1mM硫酸镁、1mM乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸。上述溶液加100μM(经浓度梯度测试以确定饱和曲线，选择最佳作用浓度)步骤1获得的次生代谢产物和0.01％二甲基亚砜分别作为实验组和对照组，37℃，60分钟。

4.微管蛋白聚合的显微观察与定量分析

分别将实验组和对照组获得的聚合产物用PME缓冲液稀释50倍，轻轻混合均匀后，取5μl溶液置于预热的载玻片上进行显微观察，在固定曝光度条件下获得实验组和对照组聚合产物的显微图像，进行3次独立生物重复实验。

用ImageJ软件(http://rsb.info.nih.gov/ij/)计算显微图像中微管蛋白的数量和长度：

首先，应用“阈值转化”功能(默认参数和对比度设置)将图片转换为二元图像。然后，应用“分析颗粒”工具设置下限为10平方像素，将背景去除并自动选取微管蛋白。最后，应用“适合椭圆”工具将颗粒进行调整。读取结果显示每一个颗粒的最长轴距和最短轴距。在本实验中，最长轴距代表微管蛋白的长度，最短轴距代表微管蛋白的粗度。汇总的颗粒数目即代表微管蛋白的数目。

颗粒数目多少反应出微管蛋白成核化的程度，与由柑橘次生代谢产物对γ-微管蛋白环形成造成的影响紧密相关。微管蛋白的长度与柑橘次生代谢产物对微管蛋白的增长端造成的影响紧密相关。进一步分析长度数据，对其做频率分布图，如果发现出现多于1个独立峰值，则表明该次生代谢产物对微管蛋白造成的解聚的影响出现了延迟。微管蛋白的粗度与柑橘次生代谢产物对微管蛋白之间的交联造成的影响紧密相关。

结果参见图4、图5、图6、图7、图8、图9、图10、图11、图12、图13、图14、图15、图16和图17，图4是不同来源柑橘活性物质对离体猪脑微管蛋白数目的影响，图5是不同来源柑橘活性物质对离体猪脑微管蛋白长度的影响，图6是不同来源柑橘活性物质对离体猪脑微管蛋白粗度的影响，图7～图17是不同实验组微管蛋白长度数据的频率分布图。图3～图6中，浅灰色代表阳性效应，深灰色代表阴性效应。各图中每一个结果来自至少对2000个微管蛋白的统计，2次生物学重复。对照组为水。

由图3～图17可知，经广西凭祥土柠檬果皮、宜昌橙果皮和宜昌橙果肉乙醇提取物处理，聚合的微管蛋白的数目增加(图4浅灰色星号)，而经北京柠檬果皮和牛肾柑果皮乙醇提取物处理，聚合的微管蛋白的数目减少(图4深灰色星号)。因为微管蛋白二聚体的初始浓度是一致的，聚合的微管蛋白数目的变化反映出生物活性物质对微管蛋白成核化的影响。接下来，对微管蛋白的长度进行测量，其结果可以用于反映生物活性物质对微管蛋白伸长活性的影响。经广西凭祥土柠檬果肉和罗浮金柑果肉乙醇提取物处理，微管蛋白的长度增加(图5浅灰色星号)，而经广西凭祥土柠檬果皮、北京柠檬果肉和牛肾柑果肉乙醇提取物处理，微管蛋白较对照组缩短(图5深灰色星号)。经生物活性物质处理后，推测可能对微管蛋白的交联和聚集成束造成影响，这种影响可以通过对微管蛋白的粗度的测量值进行反映。然而，在用于测定的柑橘果实乙醇提取物中，没有任何一种对微管蛋白的交联和聚集成束形成有显著差异的影响(图6)。有些生物活性物质可能对微管蛋白产生非线性伸长的影响效应，因此我们集合了柑橘果实乙醇提取物处理后所有单个微管蛋白的长度数据，对它们进行频率分布图的绘制(图7-17)。经柑橘果实乙醇提取物处理后，有些频率分布图呈现窄的泊松分布(图8，图15)；有些呈现宽的单峰分布图(图17)；有些呈现出第二个小波峰(图9)。这种两个波峰的微管蛋白长度频率分布图反映出经柑橘果实乙醇提取物处理后微管蛋白出现两个群体：大量相对短的微管蛋白和少量相对长的微管蛋白。通过比较相对应的同种柑橘(广西凭祥土柠檬)的果皮、果肉乙醇提取物发现：经果皮乙醇提取物处理后，微管蛋白长度的增加与数目的减少呈相关性；而经果肉的乙醇提取物处理，微管蛋白长度的显著增加并不与数目的变化呈相关性。由此可以排除长度的增加受微管蛋白二聚体数目限制的因素。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种活性物质的筛选方法，包括：

a)从猪脑中分离并纯化微管蛋白；

b)对步骤a)得到的微管蛋白进行荧光标记，得到荧光标记的微管蛋白；

c)将步骤a)得到的微管蛋白、步骤b)得到的荧光标记的微管蛋白和待筛选物质混合后进行聚合反应；

d)对步骤c)得到的聚合产物进行显微观察，获得显微照片；采用计算机软件定量所述显微照片中微管蛋白的数量、长度和粗度数据；

e)对步骤d)得到的数据进行转化分析，获得微管蛋白的密度和长度频率分布，并根据所述密度和长度频率分布确定待筛选物质的活性。

2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤a)具体为：将切碎的猪脑在再组装溶液中洗涤后研磨，4℃、100000Xg离心1小时后取上清；

将上清液与含有甘油的再组装溶液混合后37℃温浴20分钟，然后25℃、100000Xg离心1小时，弃上清；

将得到的沉淀用预冷的再组装溶液悬浮，在冰上放置30分钟，然后4℃、100000Xg离心1小时，弃沉淀；

将得到的上清再次用含有甘油的再组装溶液混匀，加入三磷酸鸟苷37℃温浴20分钟，然后25℃，100000Xg离心1小时，弃上清；

将得到的沉淀在预冷的再组装溶液悬浮，0℃下放置30分钟，得到微管蛋白；

所述再组装溶液包括磺基脂肪酸甲酯钠盐、乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸、三磷酸鸟苷和氯化钠，所述再组装溶液的pH值为6.4。

3.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤b)具体为：

将步骤a)得到的微管蛋白在37℃下聚合30分钟，然后在包括羟乙基哌嗪乙磺酸钠、氯化镁、乙二醇二乙醚二胺四乙酸和甘油的混合液中30℃离心，弃上清；

将得到的沉淀用包括羟乙基哌嗪乙磺酸钠、氯化镁、乙二醇二乙醚二胺四乙酸和甘油的混合液中悬浮，加入荧光染色剂混匀，37℃反应10分钟，然后在包括哌嗪-N，N-双(2-乙磺酸)、乙二醇二乙醚二胺四乙酸、氯化镁、三磷酸鸟苷、谷氨酸钾和甘油的终止液中，终止反应；30℃离心，弃上清；

将得到的沉淀用包括哌嗪-N，N-双(2-乙磺酸)、乙二醇二乙醚二胺四乙酸、氯化镁和三磷酸鸟苷的混合液重悬，得到荧光标记的微管蛋白。

4.根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤c)具体为：

将步骤a)得到的微管蛋白、步骤b)得到的荧光标记的微管蛋白和三磷酸鸟苷溶于包括哌嗪-N,N'-双(2-乙磺酸)/氢氧化钠、硫酸镁、乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸的PME缓冲液，分别加入待筛选物质和对照物质，37℃聚合1小时，分别获得实验组聚合产物和对照组聚合产物。

5.根据权利要求4所述的筛选方法，其特征在于，所述对照物质为二甲基亚砜。

6.根据权利要求4或5所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤d)具体为：

d1)分别对步骤c)得到的实验组聚合产物和对照组聚合产物进行显微观察，分别获得实验组显微照片和对照组显微照片；

d2)采用ImageJ软件分别对实验组显微照片和对照组显微照片中微管蛋白的数量和长度，根据所述数量和长度获得所述待筛选物质的活性。

7.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述待筛选物质为柑橘次生代谢产物。

8.根据权利要求8所述的筛选方法，其特征在于，所述柑橘次生代谢产物按照以下方法制备：

将柑橘果实烘干后粉碎，用乙醇热提，获得的提取物过滤、浓缩后冻干。

9.根据权利要求8所述的筛选方法，其特征在于，所述热提的温度为80℃，时间为2小时；

所述乙醇的体积浓度为90％。