DE1945147A1 - Biochemisches Verfahren - Google Patents

Description

Dr. F Zumiteln ten. - Dr. E. Awmann Dr. R. Koenigsberger - Dipl. Phys. R. Holzbauer

Dr. F. Zurrmtein jun.

Patentanwälte

8 Mönchen 2, Bräuhaimtraße 4/ill

87-457

ΪΗΕ COOJTOIi, SILK ASD HAN-IULDEB FIBRES HESiAEeB ASSOCIATION Shirley Institute, Didsbury, Manchester 20 (England)

Biochemisches Verfahren

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Enzymkomplexe mit verbesserter Cellulaseaktivität.

Ton vielen Fungi ist bekannt} daß sie die ^Fähigkeit besitzen, Cellulose abzubauen, und diese Aktivität kann der äußerlichen 3?reisetzung eines Ensymkomplexes zugeschrieben werden. Die Isolierung dieses Komplexes und die Auftrennung seiner Komponenten hat gezeigt, daß die verschiedenen vorhandenen Enzyme synergistisch wirken. Im einzelnen ist eine Komponente, die entdeckt worden ist, da ihre Anwesenheit für den Abbau von Celluloseformen hoher Ordnung wesentlich ist, wie Ble normalerweise in faserförmigen Cellulosematerialien vorliegen, als 0-, [C_eiua3 bezeichnet worden (Selby & Maitland, Biochem. J. (1967)ι 104·, 716). Die restlichen Komponenten, die mit O^ synergistiseh wirken, werden kollektiv als 0_χ beseich.net und besitzen beispielsweise Garboxyme-

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thyleellulase- und Gellobiasea&tivltttt. Wenngleioh die vorliegende Erfindung nicht an theoretische Überlegungen gebunden werden β oll, wird angenommen* daß die Komponente O₁ auf der kristallinen 6-1,4-uluoanatruktur wirksam wird, die in den faserförmigen Materialien auf Cellulosebasis» wie Baumwolle, vorliegt, wodurch, die Auf trennung der eineeinen Ketten verursacht wird, die auf diese Weise Gegenstand des Angriffes durch andere Enzyme in dem Komplex werden. Die Komponente C₁ scheint jedoch nloht in der Lage su sein, derartige Cellulose zu solubilisiejren» und die an· deren Oellulasekomponenten sind deshalb erforderlich, um dies BU erreichen.

Die Untersuchung derartiger Oellulaeekonponenten ist hauptsächlich an Präparaten aus frichoderaa viride und dem nah verwandten Ϊ. koningii durchgeführt worden. Ss wurde nun gefunden, daß eic ähnlicher Eczjiakoiaplex aus bestimmten Stämmen von Penioilllum funioulosum erhalten werden kann, und es wurde weiterhin gefunden, daß die O^-Komponente dieses Komplexes charakteristleoherweise eine ausgeprägt höhere thermisch© Stabilität besitzt als die aus T. viride erhaltene Komponente. Da die Komponente C^ für den Angriff auf die natürlich vorkommenden faserförmigeu Cellulosen wesentlich ist, in denen die Cellulose in ihrer dicht gepackten, kristallinen JOrm vorliegt, und da gute thermische Stabilität bei einem Enzympräparat für die Verwendung beim industriellen Abbau von Cellulose besonders erwünscht 1st, besitst der erfindungsgemäße neue Cellulasekomplex in Hinblick auf die praktische Brauchbarkeit auegeprägte Torteile gegenüber dem aus S. viride erhaltenen Komplex.

Der neue öellulasekomplex oder Komponenten davon und insbesondere die O^-Komponente sind von besonderem Nutzen beispielsweise bei der Herstellung von Monosaccharide^ wie Glucose, aus faserförmigen Cellulosen und insbesondere bei

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der Modifizierung der Struktur von faserförmigen Cellulosematerlalien durch relativ kurze Einwirkung der Cellulaee. Insbesondere 1st es möglich, die Extrahierbarkeit von Materialien wie Protein aus pflanzlichen oder mikrobischen Quellen zu verbessern oder den Nährwert von Tierfuttermitteln zu verbessern. Sie Oellulase kann auch bei der Entfernung von Cellulosematerialien aus Abströmen verwendet werden.

Die hohe thermische Stabilität der neuen C,-Komponente macht nicht nur den ganzen Komplex für industrielle Anwendungen besonders brauchbar, da die Notwendigkeit vermieden wird, genau regulierte Temperaturbedingungen zu verwenden, sondern erhöht auch die synergistische Wirkung der C^-Komponente mit Enzymen aus anderen Quellen. So"sind zwar beispielsweise die Ο.,- und Cellobiasekomponenten des neuen Cellulasekomplexes aus P. funiculosum besonders thermisch stabil, die Carboxymethylcellulase-Komponente ist jedoch nicht so thermisch stabil wie die aus T. viride. Es wurde somit gefunden, daß Mischungen der C,-Komponeutt aus P. funiculosum und der C -Komponente aus T. viride oder einfach Mischungen des gesamten P. funiculosum-Cellulasekomplexes und des ganzen T. viride-Cellulasekomplexes hervorragende thermische Gesamt Stabilität besitzen. Wiederum sind andere Enzyakomplexe zu spezialisierten Abbauprozessen befähigt, haben jedoch nicht die anfängliche Fähigkeit, kristalline Cellulose oder verwandte ß-l,4-Glucansy8teme anzugreifen. Diese Fähigkeit kann durch Mischen mit dem Cellulasekomplex aus P. funiculosum oder der isolierten C-,-Komponente daraus geschaffen werden.

Der in Verbindung mit der neuen C,-Komponente verwendete Ausdruck "hohe thermische Stabilität" soll die thermische Stabilität in Relation zu der C^-Komponente aus anderen Quellen, insbesondere aus I* viride, beschreiben. Tatsächlich ist nicht der Fall, daß die C^-Koniponente die thermisch sta-

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feilste Komponente des Komplexes 1st. Es ist die Verbesserung der thermischen Stabilität der neuen (^-Komponente, die von besonderer Bedeutung ist, und insbesondere die Schaffung einer C^-Komponente, welche bei 6O⁰C und pH 4»5 thermisch stabil ist«

Nachfolgend werden die physikalischen Eigenschaften von einigen isolierten Komponenten des neuen Cellulasekomplexes beschrieben. Sie tatsächlichen Isolierungsmethoden werden anschließend beschrieben„

Molekulargewichte

Die einzelnen Komponenten werden auf einer geeichten Säule von Sephadex G~75 gemäß der von Sei by % Maitland, Biochem. Jo (1965), jfctt 578 beschriebenen Methode geprüft. Die gemäß dieser Methode abgeschätzten Molekulargewichte sind für C₁ 57 500, für Cellobiase 160 000 und für Carboxymethylcellulase 15 500, Diese Zahlen stehen im Vergleich mit den Werten, die für die G₁-Komponente (56 000), die Cellobiase-Komponente (40 000) und die Carboxymethylcellulase-Komponente (33 000 und 12 600) τοη Τ» viride-Cellulase gefunden worden sind*

pH-Stabilität der C₁-Komponente

Proben von C, werden bei verschiedenen pH-Werten 4 1/2 Stunden lang bei 40⁰C gehalten, wieder auf pH 4,5 eingestellt und hinsichtlich ihrer Fähigkeit getestet, mit der gemischten Cellobiase und Carboxymethylcellulase aus der neuen Cellulase synergistisch zu wirken₇ Die Restaktivitäten werden durch Klärung von Bagassecellulose/Agar-Schalen gemessen (Savory, Mather, Maitland & Selby, Chem. & Ind. (1967), 153), worin die einzige Kohlenstofi'quelle entweder, wie beschrieben, in der Kugelmühle behandelte V/hatman-Celluloee

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oder in der Kugelmühle "behandelte del.igEiiM.55i.erte, Alkaliextrahierte Bagasse 1st· Die C^-Kompoaente ist zwischen pH 2,75 und 7»O relativ stabil«.

Thermische Stabilität der O^Komponente

Vorbereitende Versuche, bei denen Proben von C^ bei pH 4,5 auf 6O°₉ 65° und 7O⁰O erhitzt werden „ sseigen unerwartete thermische Stabilität (6 Stunden) bei 6O⁰C₀ Die Geschwindigkeit des Aktivitätsverluatee bei 6<5⁰e ist in Pig, I der Zeichnung gezeigt. (Vergleiohsergebnisee mit der Komponente O₁ von I. viride zeigen, daö diese bei 6O⁰O etwas weniger stabil ist als die Komponente G^ der neuen Gellulaoe bei 65°G)

Das Verhalten der Komponenten bei seufetiweiser Hution, Gelfiltration und ilsoelektrischer Einstellung ("Fokussierung") ist ebenfalls charakteris-bißc*?.* W&tm. Medien auf Dextranbasis verwendet werden, so ist sneret die 3-ütfernung von Dextranase erforderlich« Diese &r?£olßt> üwscn Behandlung mit DiäthylaTöinoäthyl-Seplaadex [BS/«Ä«S©pliad3x (äquilibriert mit 0,01 molares: Succinatpuffer auf pK 3_P5).l bei pH 3,5»

Entf^rnun^.yon,

Eine Probe (10 ml) einer 3 $igen IiBaung des neuen Oellulaeepräparate v;irä dialysiert« auf pH 3_P5 eingestellt und durch eine Säule (25 x 1»8 em) von DÄAl-Sephader geschickt s die mit O₉Ol molarer Suecinatpufierlösung bei pH 3j5 ins Gleichgewicht gebracht worden ist» Die Dextranase wird durch 18-ßtündige «Solubilisierung einer Probe von Sephadex G-75 bei pH 4_S5 und 40⁰C gemessen [Sephadex (10 mg) plus die !Fraktion, die das Bnsym enthält (0,1 ml)_p plus 0,1 molarsr Sucoinatpiiffer (0₉4 ml, pH 4,5)]. Die Dextranase wird ohne Verlust bei den anderen Aktivitäten vollständig aua der Gellulaselösung entfernt*

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(a) Stufenweise Elution bzw, Gradientenelution an DiAA-. Sephadex

Eine Säule (25 χ 1,8 era) von DAAiL-Sephadex wird suerst mit 0,01 molarem Suooinatpuffer "bei pH 5*6 trad dann bei pH 4»8 ins Gleichgewicht gebracht. Eine Probe (40 ml) der neuen Cellulase, woraus Dextranase entfernt worden ist« wird konzentriert, dialysiert (Endvolumen 6 ml) und auf die Säule mit pH 4,8 aufgebracht. Dieße wird in einem einen Gradienten aufweisenden Puffer eluiert, der bei pH 3»6.endet. Carboxymethylcellulase, Celloblase und optische Dichte bei 280 JQ/U werden gemessen* Die Ergebnisse sind in 3?ig« 2 d#r Zeichnung gezeigt _o Die Gellofciaee-Komponente ist gegenüber Oelluloee Doch aktiv und diese Aktivität wird durch Zugabe der Carboxymethyloellulase erhöht, welche selbst keine Aktivität bei Cellulose besitzt«

Isoelgktrisohe

Bine Probe (3 ml) der neuen Cellulase, woraiie Dearbranase entfernt worden ist, wird Xn äle Mähe des geiatruras eines pH-Gradienten (3 bis 6) in eiaer 2onon-fö3nu3eierenö.en Amiuocarbonsäuresäule (115 ial) (Yeß-s©rb©rg & S7erisson₉ Acta Öhem, Scand (1966) 20, 820) gebrachte Die am Bnde des Versuchs aus der Säule austretenden ffraktiouiiti werden in Hinblick auf die optische Dichte bei 280 m/u. pH, Cellobiaae und Garboxymethylcellulase untersucht« Die Ergebnisse sind in Fig. 3 der Zeichnung gezeigt* Die Cellobiaae hat einen isoelektrisehen pH von 4_S35 und der is ο elektrische pH der Oarboxymethyleellulase ist 5,9, während die O^-Komponente einen isoelektrisehen pH von 4_sO5 besitzt. Ein Vergleiche-Versuch unter Verwendung der aus ϊ_ο viride isolierten C·^- Komponente.zseigt, daß dieee den gleichen isoelektrisch^ pH aufweist.

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(ο) gelfiltration an Sephadex Ch»75

Sine Lösung (5 ml) der nach der Gradientenelution gemäß Methode (a) erhaltenen Celloblaee wird duroh sine Säule (43 x 2,5 cm) aus Sepnadex G-75 elulert. Der elidierende Puffer 1st 0,01 molar an KaOl und 0,005 molar an NaH₅₀ IMLe Cellobiose wird gut von einer kleineren, optisch dlohten Komponente getrennt (wie in gig« 4 der Zeichnung geseigt ist)_r die aioh aufgrund ihrer Pahigkeit, Cellulose au selubilisieran, wenn sie eynergietisch mit der _feemieohten Celloblaee und Oarboiymethyloellulaae wirkt, ale C₁ erweist«

Die Eigenschaften des Gellulasekomplexes insgesamt sind ebenfalls untersucht worden, wobei die Ergebnisse nachfolgend angegeben ftittf.

(a) Optimale Bedingungen für die EngymaJctivität

Bs wird der Einfluß von pH und Temperatur auf die Aktivität der neuen Cellulase gegenüber einer in hohem MaS geordneten Celluloseform (Baumwolle) und gegenüber einem typisoheü landwirtschaftlichen Celluloseabfallmaterial (Bagasse, Alkalibehandelt) gemessen.

Aliquote Teile (1 ml) einer 1 #igen Löaun« der neuen Cellulaae werden bei einer Vielzahl von pH-Werten und Temperaturen 3 Tage lang mit Proben (5 mg) des Cellulosematerials inkubiert. Bei beiden Materialien liegen die optimalen Bedingungen für die Solubilisierung nahe bei 40⁰O und pH 4,5.

(b) Der Einfluß von ungünstigem pH auf die anschließende Aktivität der Cellulase

Eine Lösung (0,2 #ig) der neuen Cellulase wird dialysiert und bei einer Vielzahl von pH-Werten 3 Stunden lang bei 4O⁰C

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gehalten» Dez? pH wird wieder auf 4₅5 gestellt und es wird die Restaktivität gegenüber BaiuEwolle und gegenüber mit .Alkali extrahierter Bagasse gemessen. Zwischen pH ;3,ö und 6,5 gehen weniger als 20 # der Aktivität gegenüber Baumwolle verloren und zwischen pH 3,5 und 6₀4 gehen weniger als 20 fi der Aktivität gegenüber Bagasse verlorene

(c) Thermische Stabilität des neuen Callulaeepräparats

In einem vorbereitenden Versuch werden Lösungen (1 #Lg₈ pH 4»5) der neuen Cellulase für 10 bis 30 Minuten auf 5O⁰C₅ 6O⁰C, 7O⁰O und SO⁰C erhitzt. Die Restaktivitäten werden durch Klärung von Bagaeeeoellulose/^gar-Schalen gemessen. Die Aktivität wird bei 60°0 größtenteils beibehalten, geht jedoch verloren bei 7O⁰C,

Bine Lösung (1 #ig, pH 4,5) der neuen Cellulase wird deshalb für Zeitspannen bis s
Btet in Hinblick auf

für Zeitspannen bis zu 6 Stunden auf 6O⁰C erhitzt und gete-

(I) die Fähigkeit, Baumwollgarn zu solubilisieren,

(II) die Fähigkeit, mit Alkali-extrahierte Bagasse zu solubilisieren,

(III) die Fähigkeit, Klärungszonen bei Bagaaseeellulose/Agar-Schalen zu erzeugen,

(IY) Cellobiäeeaktivität und

(V) Carboxymethylcellulaseaktivitäto

Die Ergebnisse sind in gig,, 5 der Zeichnung geneigt«

Der neue Oellulaeekomplex kann äurcli die aerobe Kultur von bestimmten Stämmen von P. futiiculosum auf einem Nährmedium dafür, das Cellulose als die überwiegende Kohlehydratquelle enthält, und anschließende "Entfernung des Myzels und Iso-

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lierung des Enzymkomplexes aus der Lösung hergestellt wer* den ο Nicht alle Stämme von P. funiculosttcr. erzeugen den neuen Cellulaeekomplex unö die betreffend en Organismen können am besten als oellulolytische Stämme von P. funiculosuzn definiert werden_p die Oellulase erseugen₅ welche eine bei 6O⁰O und pH 4p5 thermisch Btab.il e C^-Koinponente enthält·. Besonders geeignete Stämme von ?„ funiculosum sind IMI 134 755 und Mutanten davon.wie HiI 134 756.

Der Stamm IMI 124 756 wurde aus MI 134 755 durch Bestrahlung einer wässerigen Suspension, die etwa 10 Sporen in 2 ml Flüssigkeit enthält, mit UV-Strahlung, um etwa 99 # der Sporen abzutreten,, erhaltene Die Überlebenden Sporen werden auf ein Wachetumsuähragar in Schalen gebracht und schließlich getrennt. Die einzelnen Myaelwachstümer werden auf Hafermehlagar übertragen und in Einblick auf cellulolytieclie Aktivität getestet» Wenngleich nicht bewiesen worden Xst₃ daß auf diese Weiss erzeugte Stämme tatsächlich mutiert, haben ₉ werden dia Produkte eines derartigen Verfahrens be.i der Beschreibung der vorliegendei) Erfindung der Bequemlichkeit halber als "Müta-ate^¹¹

Häarmedium für die Fs^üietitatio« enthält eine Stickstoff-.Ie, wslchs vorzugsweise eine komplexe organische Quelle ₉ ■jr.iö Haisquellfussigke.it oder Paptonj Ist,.

Die anfängliche Waohetumsstufe srseugt Säure und es ist notwendig, daß ein Mittel sur pH-Regulierung in dem Medium yorgeseheri wird₉ um ein unzuträgliches Fallen des pH-Wertes su verhindern. Wenn beispielsweise Kreide (etwa 1 jt>) ale Mittel zur pH-Begulierung verwendet wird, so beginnt der pH typisoherweise bei etwa 6,0, fällt auf 4,0 bis 5,0 und steigt auf den Anfangs-pH oder höher. Die Oellulase wird in der Hauptsache während der Phase dea ansteigenden pH-Wertes erzeugt und soll gewonnen werden, bevor der pH 7,0 erreicht· Piir maximale Ausbeute kann die op-

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t im al θ Ausgagliehenheit zwischen Stiokstoffquelle und Puffer leicht experimentell bestimmt werden ρ Wenn Kreide als Puffer verwendet wird_p so liegt aie vorzugsweise in einer Konzentration νου 0,5 bis 1,5 # Gewicht/Volumen vor« wobei höhere Konzentrationen gewöhnlich nicht schädlich aind_t jedoch auch die Ausbeute nicht erhöhen«

Die Konsentration der Stickstoff quelle soll vorzugsweise 0,04 biß 0,15 1° ST Gewicht/Volumen, vorteilhafterweise etwa 0,09 $> N Gewicht/Volumen betragen«

Die Quelle für Sohlenstoff und Energie besteht überwiegend aus Oellulosematerial, um die Herstellung von Cellulase mit einer hohen C^-Konzeutration zu unterstützen. Ss wurde gefundene daß bei der Verwendung von Kohlehydratquellen, die reioh an Xylan sind, Cellulasekomplexe erzeugt werden, die verminderten C-.-behalt besitsen, wenngleich sie einen stark erhöhten Gehalt an einer starken Xylanaee aufweisen, wie nachfolgend beschrieben wird.

Das Cellulosematerial ist vorzugsweise Holssellulose, Baumwolle oder Alkali-behandelte Bagasse. Die Alkalibehandlung der Bagasse dient in der Hauptsache dazu, die Komponenten-Gellulosestruktur zu erweichen und kann beispielsweise un» ter Verwendung eines illkalimetallhydroxydß oder wirtschaftlicher unter Verwendung von Kalk erfolgen.

Die Kohlehydratkonaentration liegt vorsugsweise im Bereich von 0,5 bis 7,5 $> Gev/ioht/Volumen und beträgt vorteilhafterweise etwa 1 bis 2₉5 % Gewicht/Volumen.

Die Kultur erfolgt vorzugsweise durch aerobe Submersfermentation unter Verwendung von begrenzter Belüftung. In 5-Mter-Permentern ist ein optimaler Luftstrom etwa 1 Ltr. pro Hinute.

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Das Alter der als Inokulum verwendeten Kultur echeint die Ausbeute an Cellulase zu beeinflussen und dae optimale Alter scheint in der Größenordnung von-4 Wochen zu liegen.

Die Fermentationstemperatur liegt optima] in dem Bereich von 25 bis 5O⁰C, beispielsweise bei etwa 27⁰C

Die Fermentation erzeugt gewöhnlich optimale Cellulaseaktivitat nach etwa 5 Tagen und wird, wie oben bereits erwähnt, von einem pH-Anstieg begleitet. Die Cellulase wird bei optimaler Aktivität durch Entfernung von unlöslichen Stoffen, beispielsweise durch Filtrieren oder? bevorzugter durch Zentrifugieren, beispielsweise unter Verwendung einer Zentrifuge mit kontinuierlichem Strom, gewonnen. Die Abtrennung erfolgt vorteilhafterweise in 2'Stufen, wobei der pH vor der zweiten Klärung auf etwa 4,0 eingestellt wird. Die Cellulase kann dann aus der Lösung isoliert, warden, beispielsweise durch Ausfällung r**· einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, wie einem Alkohol, beispielsweise Äthanol, oder bevorzugter einem Keton, wie Aceton. Diese Behandlung erfolgt vorzugsweise in der Kälte, beispielsweise bei etwa 5⁰C.

Die Isolierung der einzelnen Komponenten kann durch die herkömmlichen Fraktionierungeverfahren erfolgen, die gewöhnlich bei Enzymen und anderen Proteinen angewendet werden. Zu derartigen Arbeitsweisen gehört die Gelfiltration, beispielsweise unter Verwendung von vernetzten Dextranmaterialien, wie Sephadex und seinen Derivaten, wobei Sephadex G-75 vorteilhaft ist. Zur Vermeidung dee Abbaues von derartigen Dextranen durch die starke Dextrarasekomponente, die in dem Komplex vorliegt, soll letztere zuerst entfernt werden, beispielsweise unter Verwendung eires schwach basischen lonenaustauechmediums, wie DÄAÄ-Sephadex, bei einem pH, der für die Dextranaeeaktivltät nicht optimal ist. Zu

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anderen Geliaaterialien gehören Polyacrylamide und poröse Glasgele, Chromatographie au Ionenaustauschinedieii, insbesondere an denen auf der Basis von vernetzten Dextranraaterialien, beispielsweise DlAÄ-Sephadent, kann ebenfalls verwendet werdet» j wo"bei vorteilhafterweise mit einem PuffergradienteB eluiert wird» Bei der Verwendung von 3DÄAÄ«Sephadex liegt der Puffergradient vorteilhafterweise zwischen 5»35 und 3 j> 5 <> Saure Ionenaustausohinedien können ebenfalls verwendet werden« beispielsweise Sulfoäthyl-CSÄJ-Sephadex und Carboxymethyl- ( GM) -Sephadex _o

Eine weitere Sraktionierungemethode ist die Elektrophorese und insbesondere die isoelektrisch© Fokussierung, bei« spielsweise unter Verwendung einer Polyaminocarbonsäuresäule, die unter einer elektrischen Spannung steht, wobei die Komponenten entsprechend ihren ie©elektrischen pH-Werten in stabile Banden getrennt werden.

Eine Kombination von FraktionierungsmethodeB kann vorteilhaft sein, wenngleich die Eomponentenenzyme aus P₀ funicu~ losum sich lsichter zu trennen scheinen eis die aus To vi** ride.

Die obigen Methoden ermöglichen, wie bereits erwähnt, die Irennung der Cellobiose-, Carboxymethyloellulase- und G^- Komponenten und gewtinschtenfallB deren Mischung mit ande*- ren aktiver?. Substanzen.

Wenn das für die Fermentation verwendete Uährmedlum eine bedeutende Menge eines Xylane enthält, beispielsweise, wenn Bagassexylan verwendet wird, so wurde gefunden» daß der sich ergebende Ensymkomples: besonders reich ah einer Xylanase-Komponente ist. Es \-mrde gefunden, daS durch eine derartige Verwendung von Xylan in dem Nährmedium die XyIanase-Aktivität 28-fach erhöht werden kann.

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Die nachfolgendan Beispiele sollen die Erfindung weiter veranschaulichen_e jedoch nicht beschränken, Beispiel 1

Isolierung des aktiven Stammes von P_{O |} xliPiculoaum (a)

Eine Suspension von Sporen in sterilem Wasser und 10-, 100« und 1000-fache Verdünnungen davon werden in einem Hämocytometer untersucht· Proben der Suspension, die etwa 10 Sperren in 2 ml .flüssigkeit enthalten, werden 5 bis 7 Minuten lang in sterilen Petrischalen in einem sterilen Behälter bei einem Abstand von etwa 25,4 om (10 inch) von einer Philips !2UV/15 W Lampe bestrahlte Diese Bedingungen werden ausgewählt₉ um etwa 99 # der Sporen abzutöten. Jede Schale wird mit sterilem Wasser (8 ml) Übergossott und eine PlÜesigteeitsprobe (1 ml) wird entnonanen und au eterilem Wasser (9 nü.) gegeben. Bei dieser Stufe soll diese Suspension (10 jiil) etwa IQ-⁵ lebende Sporen enthaltene Aliquote 3?eile (0,1 ml) werden über die Oberfläche einer sterilen Agarschale ausgebreitet, die Nährstoffe enthält, die ausgewählt worden ain&_? weil sie kompakte Wachs-öusa unteretütsen (die Zusammensetzung ist uftchfolgeod angegeben)Ό Die Schale wird bei 25° inkubiert und täglich Überprüft. Sobald die einzelnen lebenden Sporen ausreichend gewachsen sind, so daß sie unterscheidbar sind, werden sie nerausge^dmmcm und auf getrennten schrägen Medien aus Hafermehlagar vermehrt (die ütisammensetaung ist unten

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Zusammensetzung dee Kähragar

KH₂K)₄ (5,0 g)

MgS0₄«7H₂0 (0,5 g)

Sohlempe (Sietillers solubles) (IO g)

Kreide (5,0 g)

MaiBquellflüssigkeit (3,85 g* S ι _gN)

(ΜΗ_φ)₂80₄ (4,7 g, « 1 gN)

in 1 Ltr. 2 tigern Agar, wobei die folgenden Spurenelemente enthalten sind:

^e⁺* (5 ppm), Zn⁺"¹" (5 ppm), !&*+ (5 ppm), Co⁺⁴" (2 .ppm).

(b) Prüfung auf οelIuIölytische Aktivität

Jeder der isolierten Stämme wird In Sohüttelkultüren auf einem Bagasse/Maisquellflüssigkeit-Medium vermehrt, das ausgewählt wird, um die Cellulaseereeugung au unterstützen. Vielversprechende Stämme werden (1) duroh ihre Annahme dieses Wachstumsmediums und (2) durch ihre Urzeugung von Cellulose enthaltenden Flüssigkeiten, wenn sie darauf wachsen, ausgewählt. Die Cellulase wird auf Cellulose/Mineralagar-Sohalen untersucht (Savory, Mather, Maitland & Sei by, Chern. & Ind« (1967), 153), worin die einsige Kohlenstoff quelle entweder, wie beschrieben, in der Kugelmühle behandelte toliatman-Cellulose oder in der Kugelmühle behandelte delignifieierte Alkali-extrahierte Bagasse ist.

Staxam-Aufreohterhaltung

Hafermehlagar-Schrägmedlen werden mit einer Sporensuepension Inokuliert, die aus eiser vorhergehenden Sohrägkultur erhalten worden ist, und 2 Wochen bei 27⁰C und dann, wenn

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vollständige Sporenbildung Torliegt (wee sich gewöhnlich durch eine roea Färbung des Agar zeigt), 2 bie 4 Wochen bei 5° inkubiert,

nachfolgend wird die Herstellung der Agar-Schrägmedien beschrieben:

Zusammensetzung der Haj^rme_hlagar~Sohräffl^gdiep

Trockener Zitterhafer (Quaker O&te) (30 g) wird zu einem feinen Pulver pulverisiert und in destilliertem Waeser (2 Ltr.) suspendiert. Die Suspension wird 1 Stunde lang ge« kocht und dann durch 3 oder 4 Lagen Musselin filtriert. Das Volumen wird wiederum auf 1 Ltr. gebracht und es wird Agar (20 g) sugeeeben. Das Ganze wird dann 30 Minuten lang "dampf~ behandelt" (im Sterilisator ohne Überdruck), um den Agar zu lösene Hach dem Gießen werden die schrägen Medien 20 Minuten lang bei 1,05 kg/cm² ["5 Ib) sterilisiert.

Herstellung der Sporensuspens^qn

Yier Haferxnehlagar-Sohrägmedlen werden jeweils mit sterilem Wasser (5 al) bewässert» Die sioh ergebende Sporensuspeneion (20 ml) wird auf 400 ml verdUutit und enthält etwa 5 x 10⁹ Sporen»

Herstellung von Bagassecellulose für das Wachstuasatedium und für die SolubilisierungsprÜfung

Bagasse wird in einer Hammermühle gemahlen, bis sie ein Sieb mit einer Maschenweite von 1 nm passiert. Sie wird dann im Verhältnis von 1 g Bagasse zu 10 ml Flüssigkeit mit 4 £iger NaOH gemischt und bei Raumtemperatur über Dacht stehen gelassen· Das Produkt wird zuerst mit Wasser, dann mit verdünnter Essigsäure und schließlich wiederum mit Wasser gewaschen_t Sei

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dieser Behandlung wird die Hauptmenge des Xylanö in dsr Bagasee entfernt. Die Ausbeute beträgt etwa 60 #„

Wachetumsmediuia auf der Baeis von Bsgasse/Maisquellflttssigkeit

MaAsquellflüssigkeit (enthält 3,7 # H) 25 g

Kreide 10 g

Alkali-extrahierte Bagasse 25 g pro Liter

Daß Medium wird 120 Minuten !eng bei 0,35 leg/cm (5 lbs/sq_ei Obardruok Qterilisiert_e der pH nach der Sterilisation beträgt <

Die'Bagasse wird zuerst durch Chloritbehandlung delignifi« ziert, dohop von Lignin befreite, (rejnahlene Bagaese (100 g) wird in Waaaer (5 I»tr,) mit 7O⁰C diapergiert und es werden Eisessig (12 ml) und darm 32 #Lgp.s Matriumchlorit (100 ml) zugegeben 0 Nach 30 Minuten bei 70'"0 v/erden weitez'e Mengen an Säure (12 ml) und arj 52 tigern Katriumchlorit (100 ml.) zugegeben_p was nach weiteren 30 Minuten wiederum der !Fall istβ 30 Minuten nach der dritten Zugabe wird das Produkt gründlich mit Wasser gewaschen unä dann mit 4 $»iger iiatron«· lauge behandelt« Die Ausbeute beträgt etwa 50 #.

gegmen^tation

Alka3.i-behandelte Bagaase (750 g 'Jiraokengev/ioht) wird 12 Stunden lang jüit V/acser (40 Ltr„) gorühart und daün zu mshr Wasser (40 Ltr^ in eines* Fermentationsbehälter (189 Ltr«, 50 gallons) gegeben. Pis Suspension virä 30 Minuten bei 50°, 30 Minuten bei 90° und dann 120 Minuten bei 120° aterilieiert. Mach dem Abkühlen wird si«* 18 Stunden lang bei

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BADORlGiNAl.

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20 bis 25° gerührt. (Die verwendete Bagassamenge ergibt weniger als die bei Versuchen in kleinem Maßstab gefundene optimale Konzentration, wird jedoch aufgrund der Schwierigkeit gewählt, die beim Sterilisieren von Bagaseasuspensionen in diesem Maßstab auftritt») Haisquellflüssigkeit bzw. Maiseinweichwaseer (2,5 kg» 2,5 # H Gewicht/Volumen) wird mit Wasser (10 Ltr.) gemischt und zu der Bagasse gegeben. Der pH liegt bei dieser Stufe im Bereich von 4,3 bis 4₉5· Die Mischung wird sterilisiert;, indem si© 30 Minuten auf 50°, 30 Minuten auf 90° und dann 90 Minuten auf 120° erhitzt wird. In destilliertem Wasser (3»5 Ltr.) suspendierte Kreide (Sturoal P, 500 g) wird 6 Stunden laug bsi 120° sterilisiert, dann au der gekühlten Bßgasse/Maisquellflüssigkeit gegeben und durch l-stündi&es Kühren mit 350 üpm eingemischt. Die Hührgeschwindigkeit wird auf 250 üpm vermindert und d&s Medium wird mit 5 χ 10⁹ Sporen von P„ funiculosum Stamm IKI 134 756 inokuliert „ Die Fermentation wird bei 27° in&ubiert, mit 250 TJpra gerührt and mit 28,3 bis 56,6 Ltr* (1 bis 2 cubic ft.) pro Minute belüftet. Das Wachstum beginnt nach 2 Tagen und ist nach 3 Tagen gut entwickelt. Die GelliilaseaktiTität in dem Überstand iat unter dienen Wachstiosbedirsgungen nach etwa 5 T&gen maximal und tritt au der Zeit auf, wenn der pH, der gefallen is^j ictederuia au steigen beginnt.

Isolierung:

Die ffermentationsflussigkeit wird gewönne:! und duroh einen einzigen Durchlauf durch eine Zentrifuge irlt kontinuierlichem Strom g-.kl&?rfc₀ wobei stob, efcwp 2₅3 kg !Feststoff ergeben ,.Der pH der geklärten flüssigkeit wird durch Zugabe von Chlorwasserstoff säure auf 4,0 eingestellt, während raeeh gerührt und die Temperatur auf 5°0 vermindert wircU Die kalte Flüssigkeit wird durch einen weiteren Durchlauf durch die Zentrifuge mit kontinuierlichem Strom wieder geklärt und es werden drei Volumina Aceton mit -20⁰C augegeben. Die Lösung wird

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über Haoht bei 2 bis 5⁰O gehalten, der Überstand wird abdekantiert und der ausgefallene feststoff wird duroh Zentrifugieren gewonnen. Duroh Mahlen der Feststoffe in Aceton bei -20°0 wird ein bröckeliges Pulver erhalten. Das Bndprodukt wird durch Filtrieren duroh Glas (gesintert) oder duroh Filterpapier erhalten. Die Ausbeute beträgt etwa 280 g (0,3 #) an rohem trockenem Ensympräparat«,

Das rohe Präparat wird dann durch die oben beschriebenen Arbeitswelsen gereinigt und getrennt» um die gereinigte C^-Komponente au erzeugen.

Synergismus zwischen der C,-Komponente und anderen Komponenten des neuen Oellulasesyaiems und anderer Oellulaeesysteme

Proben der gereinigten CL -Kompone'ßte aus der neuen Cellulose werden zu Proben von G^ aue dsr neuen Csllulase und aus Sriohöderma viride gegeben« Die Jjösuagen von C aus den beiden Organismen werden dabei jeweils so eingestellt₉ daß sie gleiche Cellobiase- und öarbozymethylcelXulaseakti'tritäten besitzen. Die durch ;jefl© Hiscliung und durch mehrere Ysrdtinnungen davon hervorgerufene SolubilisiexiAng von Baumwolle v/ird gemessen und as wird gefunden, daß die C,-Komponente der neuen Celluiase mit dsm C aus Φ, virias eynergistiseli v?.irken kann.

Verträglichkeit der Cellulaee mit anderen "GellulaBe"«Präparaten, denen C,-Aktivität abgeht

Das im Handel erhältliche japanische Oellulasepräparat Amano AP3 besitzt hohe Carbosymathylcellulaseaktivität und etwas Cellobiaseaktivität, jedoch relativ geringe oellulolytiBche Wirkung. Auf e:ir«e:." BagasBecellulose/Agar-SGhale werden undeutliche Kläruti^szonen erhalten, die Diffusion des BnBymsyeteme mit unvollständiger Solubilisierung

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des suspendierten Substrate vermuten lassen. Die Zugabe einer Lösung der neuen Cellulaae führt zur Bildung von klaren Zonen. DaB dieser Effekt auf die zusätzliche (^-Aktivität aurUokzuführen ist, die durch die neue Cellulase migefUhrt wird, wird durch einen zweiten Versuch gezeigt, bei dem eine gereinigte Probe der CL-Komponente aus der neuen Cellulaee verwendet wird. Die von AP3 allein erzeugten schleoht bestimmten Zonen werden durch gut bestimmte klare Zonen ersetzt, wenn C₁ zugegeben wird. Die C₁-Komponente allein ruft wenig sichtbare klärung hervor.

Beispiel 2

Kultur von F« funioulosum auf Bagaeeexylannährstoffen

MaiequellflUssigkeit (Glaxo Laboratories Ltd.) Sturcal-Kreide (John and E. Sturge Ltd.) Xylan, hergestellt durch EBaigsäurefällung des Xylans, das bei der Extraktion von Bagasse tnit 4· #iger Katronlauge erzeugt wird.

50 IDl Medium, worin 2 1/2 MaisquellflÜBßigkeit, 1,4 $> Bagassexylan und 0,5 $> Kreide enthalten sind_s werden mit Sporen von P. funiouloBum-Stamm IMI 134 756 inokuliert und in einer Sohttttelkultur 6 bis 7 lage lang bei 27⁰C kultiviert.

Prttfungsmethode

Aliquote Teile (0,10 ml) der zu untersuchenden lösung werden mit etwa 3 1/2 $ Xylan (3,0 ml) mit pH 5,5 gemischt und bei 4O⁰O 30 Minuten lang inkubiert. Es werden 0,2 ml 60 #ige (Gewicht/Gewicht) Katronlauge zugegeben und die Viskosität der sich ergebenden Lösung wird unter Verwendung eines Kapillarausflußviskosimeters gemessen. Die Methode wird unter Verwendung einer im Handel erhältlichen japanischen Cellulase Meicelase-P (Kei^i Saika Kaisha) in Eon-

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zentrationen im Bereich von 0*01 bis 1O₉O 96 geeicht« Ausbeute, an _t

Eine auf Bagasse/MaißquellflüSBigkeit-MediiUD gezogene Kultur von Po funioulosum enthält eine Xylanaeeaktivität, die etwa 0,3 $> Meioelaee-P äquivalent ist. Eiue auf dem oben beschriebenen Xylan/MaiequellflÜssigkeit-Mediiim gezogene Kultur enthält jedooh eine Xylanaseaktivitätp die 8,3 # Meicelase~P äquivalent ist_p womit eine 28-fache Erhöhung der Xylanaseaktivität vorliegt.

Morphologische Identifizierung der IMI-Stämme 134 755 und 134 756 .

₁1^4 _n 7,5^ Penicillium.funiculosum !Chom

Kolonien auf Caapek¹« Agar wachsen bei 25°0 mäßig gut, wobei sie in 7 fagen einen Durchmesser von 3 bis 4 cm erreiohen. Das Wachstum ist gemisoht und sseigt radial gekräuselte Sektoren sowie an der Oberfläche feine Funikulose, jedoch mit einigen schleimig«feuchten laderartigen Bereichen,. Der Rand ist diffus, im Farbton von weißlich über blaß gräulich-grün bis. in der Hauptkolonie _v rStlich und.gelb in dem feuchten Bereich im Zentrum= Zahlreiche kleine rötliche Iropfsn färben die Kolonie in dem subzentralen Bereich. Die Unterseite ist farblos bis weiß am Rand und wird unregelmäßig rot mit einem weißen bis weißlichen Bereioh unter dem lederartigen Myzel mit einem Ring aus weißlichem Pigment, das in den Agar diffundiert. Eb liegt kein Geruch vor.

Kolonien auf ttalzagar wachsen etwas rascher als auf Czapek¹ β Agar, wobei sie in 7 Tagen bei 25°C einen Durchmesser von 4j5 bis 5 cm erreichen und im Zentrum etwas radial ausgebuchtet alnd» Sie weisen an der Oberfläche Funikulose, einen feuchten lederartigen Rand und ein feuchtes lederarti-

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gee Zentrum auf. Der Rand let farblos und wird weiß, in einem Sektor grün und beim Zentrum rot, mit einigen kleinen roten Tropfen in dem grünen Sektor. Die Unterseite ist am Band farblos und beim Zentrum rot, wobei die Farbe in dem grünen Sektor intensiver ist. Die Farbe diffundiert nicht wahrnehmbar in den Agar. Es liegt kein Geruoh vor.

Das Wachstum 1st sehr funikulös mit konidialen Strukturen, die von der Oberfläche der Hyphenstränge oder -büsohel getragen werden, wenngleich manche auch aus dem Grundfilz hervorgehen. Bs liegen konidiale Ketten vor» die verflochtene Massen bilden.

gopldienkSpfe,

Diese sind typischerweise bi-quirlständig symmetrisch, wobei sie ein sehr symmetrisches Aussehen haben, sie tragen jedoch häufig Fhiallden und Metulae in verschiedenen Höhen. Ss sind auch einige fragmentarische Köpfe vorhanden _o Die Köpfe haben typischerweise Metulae und Phialiden, jedoch in manchen Fällen mit drei Niveaus, entweder mit dem zentralen, darauf wachsenden Konidienträger aur Erzeugung einer zweiten Schicht von Metulae oder mit einem gelegentlichem Zweig. Die Metulae sind oft fünf an der Zahl, jedoch gelegentlich mehr und bei einfacheren Köpfen weniger, wobei manchmal ein einzelner kurzer Zweig vorliegt, der nur Phialiden trägt.

Diese sind glatt und in der Länge sehr variabel, wobei sie mit 7 bis 20/U Länge sehr kurz sind, wenn sie von hängenden Hyphen oder klei.nen Strängen getragen werden, jedoch oft länger sind, wenn sie aus größeren Strängen oder aus dem Grundfilz hervorgehen, wobei sie eine Länge bis zu 150/U oder mehr haben können. In Hinblick auf den Durchmesser

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sind sie aiemlich gleiohmäßig, dieser beträgt gewöhnlioh 2,5 bis 3/U₀

Metulae

Diese betragea 7 bis 11/u χ 2 bis 2,5/U.

Diese sind nahezu parallel lansettlioh und verjüngen sioh allmählich bu der Spitze» sie haben meistens 9 bis 12 x.2/u*

Die Konidien sind fast kugelförmig bis sehr gering elliptisch, platt oder fein aufgerauht,- manchmal mit einer Andeutung eines Punktes an jedem Ende₉ sie betragen 2,6 bis 3p2 χ 2,2 bis 2,8/Up gelegentliche größere Konidien sind klar elliptisch und haben bis zu 6 χ 4 au

IMj 154 756 Benicillium ftualpulosum ghom

Kolonien auf Czapek*s Agar vachsen bei 25⁰C mäßig gut, wobei sie in 7 Sagen einen Durchmesser von 3 bis 4 cm erreichen» Das Waohstum ist gemischt und zeigt radial gekräuselte Sektoren mit fein funikulöser Oberflächen jedoch mit einigen schleimig-feuchten lederartigen Bereichen» Der Band ist diffus_t im Parbton von welB Über blaßblau, grau-grün bis tiefer grün oder rötlich im Zentrum» Die Unterseite ist weiß am Hand mit unregelmäßigen, rötlich bis braun-rot gefärbten Bereichen auf das Zentrum zu, wobei ein Bereich von weißlichem Pigment in den Agar diffundiert« Ss liegt kein Geruch vor.

Kolonien auf Malsagar wachsen kräftiger als auf Gssäpek'e Agar, wobei sie in 7 Tagen bei 25°0 einen Durchmesser von 4t5 bis 5 ei erreichen, sie sind im Zentrum etwas ausgebucht et, stark funikulös, mit feuchtem !©derartigem Band und einigen feuchten lederartigen Sektoren, weidlich bis

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weiß, wobei sie im Zentrum rötlich und grün werden, mit zahlreichen rötliohen Tropfen. Sie Unterseite let farblos an Band und rot im Zentrum, nicht wahrnehmbar diffundierend· 358 liegt kein Geruch vor.

Die Kolonien sind funikulös mit einigen samtartigeren Bereichen an den Bändern, die Konidienträger sind meistens von hängenden Hyphen oder Hyphensträngen getragen, wenngleich einige auah aus dem urundfilz hervorkommen.

Konidlenköpfe

Diese elnd gewöhnlich regelmäßig mit mehr oder weniger gleichen Schichten von Metulae und Fhialiden, oft mit 5 Me tulae, wobei jedoch einige kleinere und einige größere Köpfe vorliegen·

Konidienträger

Biese sind glatt und in der Länge variabel: kura, wenn sie aus hängenden Hyphen und Hypametrfegen hervorkommen, jedoch länger, bis zu 150 bie 200/u oder läc£ , wenn sie aus größeren Strängen oder aus dem Qrundfilz hervorkommen. Hinsichtlich des Durchmessers sind sie mehr oder weniger gleichmäßig, wobei dieser meistens 2,5 bis 3/U beträgt.

Metulae

Diese sind in der Länge manchmal etwas variabel, wobei die aentralen oft länger sind, sie messen 10 bis 15 χ 2 bis 2,5/U.

Phialiden

Diese sind 5 bis 8 an der Zahl, verjüngend, lansettllch,

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nahezu parallel» sie messen 10 bis 12 χ 1,8 Ue 2,2/U.

BIe Konidien sind kurz, oval, glatt öle sehr fein gerauht, sie messen 2,5 Die 3x2 bis 2,5/U< >

Aufschluß von mazeriertem Filterpapier

(a) Substratherstellung

In 12,7 mm (1/2 Inch) breite geschnittene Filterpapierstreifen werden in Proben von 50 mg abgewogen und in Reagenzgläser gebracht. Sann wird zu jeder Probe Natriumhydroxyd (4 H, 10 ml) gegeben und die Proben werden über Nacht belassen, im folgenden !Tag werden die Proben verkorkt und zur Disperglerung der Fasern geeohüttelt. Die Fasern werden auf einem Glaepolster abfiltriert, mit 0,ln Essigsäure, dann mit Wasser und schließlich mit einer Pufferlösung mit pH 4,5 gewaschen. Die Proben werden trockengepreßt, in Inkubationskolben gegeben und durch Zugabe der gleichen Pufferlösung auf jeweils 0,2 g gebracht» Alle verwendeten Pufferlösungen enthalten 0,03 $> Gewicht/Gewicht Natriumazid, um Sterilität aufrechtzuerhalten.

(b) Aufschluß

Zwei Proben, die 4,8 ml einer 1 #igen Lösung an erfindungsgefljäßem Penicillium funiculosum-CellulaBekomplex (hergestellt durch Acetonfällung), abgepuffert bei pH 4,5, enthalten, werden bei 55⁰C 6 1/2 Tage lang inkubiert und dann wird die restliche Cellulose auf einem Glaspolster abfiltriert. Der Rückstand wird mit 0,ln Ammoniak und dann mit Wasser gewaschen und anschließend in Kaliumdichromat in 50 7&iger (Volumen/Volumen) Schwefelsäure (O,36n) gelöst. Die Proben werden dann gegen 0,2n Eisen-II-ammoniumsulfat titriert und die Titerwerte werden mit einer Leerprobe, die keine Cellulose enthält und mit einer Vergleichsprobe, die Cellulose, jedoch kein Enzym enthält, verglichen*

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(β) Ergebnisse

Berechnungen:

Der Prozentsatz Solubilisierung entspricht 100 minus dem Prozentsatz an verbleibender Cellulose, woraus eich ergibt:

Leerprobe Probe # Solubilisierung « 100 - (

Leerprobe " Vergleiohaprobe

Der für die Leerprobe erhaltene mittlere Titer ist 45«8 mit während der für die Vergleichsprobe erhaltene mittlere Titer 15,0 wl beträgt. Die Proben ergeben literwerte von 29,0 und 29,2 ml, woraus sich eine durchschnittliche Solubilisierung vcjn 45»79 # ergibt.

Hit dem japanischen Gellulasepräparat Amano Ap3 und mit Meioellase bei der gleichen Konzentration durchgeführte ähnliche Versuche ergeben l'iterwerte von 18,9 unci 18,7 ml bzw. von 26,4 und 26,4 ml, woraus sich eine durchschnittliche Solubilisierung von 12,34 bzw. 37»02 ^ ergibt. Dex Aufschluß unter Verwendung einer 50 s 50-Miechung von Amano Ap3 und Meicellase bei der gleichen Gesamtenzyinkonzentration ergibt eine herabgesetzte Solubilisierung von 30,85 $. Der Aufsohluß unter Verwendung einer 50 : 50-Hischung von Amano Ap3 und der erfindungsgemäBen Gellulase bei der gleichen Gesamtenzymkonzentration ergibt demgegenüber eine erhöhte Solubilisierung von 47*74 $» was zeigt, dafl Synergismus vorliegt.

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Claims (13)

1. 52/10/zö _#/

   (2/2/1) <6 13. Jan. 1970

   Betrifft: Patentanmeldung P 19 45 147.9 - Enzymes Part 7 Ine Cotton, Silk and Man-Made Fibres Research Ass,

   Neuer Patentanspruch^ 1

   Ο..-Komponenten der Cellulasekomplexe, die von Stämmen von Penicillium funiculosum stammen, gekennzeichnet durch

   a) eine thermische Stabilität bei pH 4,5 von etwa 6 Stunden bei 60⁰O, wobei die Stärkesolubilisierungs-Aktivität eine Halbwertzeit von etwa 20 bis 40 Minuten bei 65⁰C besitzt;

   b) ein Molekulargewicht, gemessen nach der Methode von Selby und Maitland (Biochem. J. (1965) 94^, 578), von etwa 57 500;

   c) eine pH-Stabilität bei 40⁰C zwischen pH 2,75 und 7,0 und

   d) einen isoelektrischen pH von 4*05, gemessen nach der Methode von Vesterberg und Svensson (Acta Chem. Scand. (1966) 20,820).

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   Patentansprüche

   Stämmen von Pen ic ill ium funlculosurnhLexataBOienT^obei die -Komponenten die thejanij^ire^iabilität, dae Molekularge-

   und den isoelektrischen pH beeit-
2. 2. C^-Komponente nach Anepruoh 1, herstammend von dem F. funiculosum-Stamm INI 134 755 oder einer Mutante davon.
3. 3. ü,-Komponente nach Anepruoh 1, herstammend von dem P. funiculooum-Stamm IMI 134 756.
4. 4. C,-Komponente nach einem der vorhergehenden Ansprüche zusammen mit den restlichen Cellulaeekomponenten des Cellulasekomplexee, der von einem Stamm von Penicillium funiculosum herstammt.
5. 5· C,-Komponente nach Anspruch 1 bis.3 zusammen mit der C -Komponente eines Cellulasekomplexes, der Ton einem anderen Organismus herstammt.
6. 6. C, -Komponente nach Anspruch 4 in Mischung mit der C -Komponente des Cellula, ren Organismus herstammt.

   C -Komponente des Cellulasekomplexes, der von einem ande-
7. 7. C^-Kumponente nach Anspruch 5 oder 6 mit einem Gehalt an der 0, -Komponente des Cellulaeekoraplexee, der von dem anderen Organismus herstammt.
8. 8. Cellulasemischung nach Anspruch 4 bis 7, worin der Cellulasekomplex oder die Komponenten davon_t die von einem anderen Organismus herstaamen, von Trichoderma viride oder Trichoderma koningii herstammet.,

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9. 9. Verfahren zur Herstellung einer Cellulaeemischung gemäß Anspruch 4» gekennzeichnet durch die aerobe Kultivierung eines cellulolytischen Stammes von F« funiculosum, der Cellulaee erzeugt, die eine bei 60⁰C und pH 4,5 thermisoh stabile CU-Komponente enthält, auf einem Bährmedium dafür, das Cellulose als die überwiegende Kohlenstoffquelle enthält, und anschließende Entfernung dee Myzels und Isolierung des Enzymkomplexes aus dem Medium»
10. 10„ Verfahren nach Anspruch 9» dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm von F„ funioulosum der Stamm I.M.x. 154 755 oder eine Mutante davon ist.
11. 11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daS der Stamm von P. funiculosum der Stamm I₀M. I< 134 756 ist»
12. 12. Verfahren nach Anspruch 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet,, da3 das Nährmedium eine Stickstoff quelle enthält»
13. 13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Stickstoffquelle Maisquellflüssigkeit oder Pepton ist.

    14« Verfahren nach Anspruch 9 bie 13, dedurch gekenn· zeichnet, daß das Nährmedium ein Mittel zur pH-Regulierung enthält,

    15. Verfahren nach Anspruch 14« dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel zur pH-Regulierung Kreide ist,

    16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die StickBtoffquelle und die Kreide in einer optimalen Ausgewogenheit vorliegen.

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    17« Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, dad die Kreide in einer Konaentration von 0,5 bis 1,5 % Gewicht/Volumen vorliegtο

    13ν Verfahren nach Anspruch 9 hie 17, dadurch gekennzeichnet, daß die verwendete Cellulose Holacelluloee, Baum*· wolle oder Alkali-behaudelte Bagasse ist.

    19· Verfahren nach Anspruch 9 bis 18, daduroh gekennzeichnet, daß das Alter des Inokulums für die Kultur etwa 4 Wochen beträgt_o

    20, Verfahren nach Anspruch 9 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Kohlehydratkonzentration in dem Nährmedium im Bereich von 0,5 bis 7»5 % Gewicht/Volumen liegt»

    21. Verfahren nach Anspruch 20, daduroh gekennzeichnet, daß die iohlehydratkonzentration in dem Nährmedium im Bereich von 1 bis 2,5 i> Gewicht/Volumen liegt.

    22« Verfahren nach Anspruch 12 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Stickstoffquelle in dem Nährmedium O₀04 bis 0,15 °h N Gewicht/Volumen liefert«.

    23« Vorfahren nach Anspruch 9 bis 22, daduroh gekenneeicimat, daß man die unlöslichen Stoffe in zwei Klärungsstufen abtrennt, wobei der pH des Systems vor der zweiten Klärung auf etwa 4,0 eingestellt wird.

    24. Verfahren nach Anspruch 9 bie 23, dadurch gekennzeichnet* daß man die Cellulass durch Ausfällung mit einem mit Waa-üsr misohoaren organischen Losungsmittal aus der Lösung isoliert«

    25o Verfß-hren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß da« Ijösungomittal ein Alkohol oder Keton ist-.

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    ^BAD

    26» Verfahren nach Anspruoh 25» dadurch gekennzeichnet» daß das Lösungsmittel Äthanol oder* Aceton ist»

    27. Verfahren nach Anspruoh 24 bis 26 ₉ dadurch gekennzeichnet, daß man die Auefällung in der Kälte durohftihrt,

    28, Verfahren nach Anspruch 9 his 27* dadurch gekennzeichnet, daß man die Cellulasemischung zur Herβteilung einer C^- Komponente gemäß Anspruch 1 der Fraktionierung unterwirft»

    29« Verfahren nach Anspruch 28_s dadurch gekennzeichnet, daß man die Fraktionierung durch eine oder mehrere Nethoden bewirkt, die unter Gelfiltration, lonenaustauschchromatographie und Elektrophorese ausgewählt Bind»

    30 _a Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß die Gelfiltration unter Verwendung von vernetzten Dextrannaterlallen, Polyacrylamiden oder porösen Glaegelen durciigefuhrt wird.

    31ο Verfahren nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß man die Dextranasekompooente vor der Gelfiltration an Dextranmateriaüien aus der Mischung entfernt,

    32. Verfahren nach Anspruoh 31* dadurch gekennzeichnet_s daß man die Dextranasekomponente unter Verwendung eines schwach basischen IonenauBtauschmediums entfernte

    33ο Verfahren nach Anspruch 29_} dadurch gekennzeichnet, daß die Xonenaustauschchromatographie an lonenaustauachmedien auf der Baeis von vernetzten Dextranmaterialien durchgeführt wird.

    34- Verfahren nann AOBpi.-m:a 29_f dadurch gekennzeichnet, daß die Elektrophorese eine isoelektrische Fokussierung umfaßt.

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    35, 7erfahren nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß die isoelektrische Fokussierung unter Verwendung einer PolyaminocarDonsäureeäule durchgeführt wird,

    36- Verfahren nach Anspruch 9 biß 35» dadurch gekennzeichnet, daß man zur Herstollung einer Cellulasemißchung
    gemäß Anspruoh 5 bis 9 die C^ Komponente oder die Oellulaeemiechung, die die C^-Kompouente enthält, mit der C^-Komponente oder.dem Oellulasekomplex, die von einem anderen Organismus herstammen, mischt,

    37. Abwandlung dee Verfahrens gemäß Anspruch 9» dadurch gekennzeichnet, daß das für die Fermentation verwendete
    Nährmediüa eine bedeutende Menge eines ZyIans enthalt, wodurch eine Cellul&semieohung erzeugt wird, die reich an
    einer Xylanaaekomponente ist,

    3Θ» Ceululaeemischung, hergecte'O.t nach einem Verfahren Anspruch 9 bio 27, 36 und 37

    39- C,-Komponente, hergestellt nach einem Verfahren
    gemäB Anspruch 28 bis 35·

    -4^ΐ Trriinni fτιτ fnniil nim 'τηττ T rT

    tan ten davon..

    um funiouloBum-Stamm I-H.I. 134 756 und Mu-

    Verfahren but Proliferation bi2W, Sproseung von Penicilliun funiculosum-Stanm 134 755 oder 134 756, dadurch
    gekennzeichnet, daß man den Organismus auf einem Nährmedium dafür kultiviert.

    - TO -

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    Verfahren zum Abbau von in hohem Maß geordneten Celluloseformen, gekennzeichnet durch die Behandlung mit einer Cellulasemiechung gemäß Anspruch 4 bis 9 und 38·

    Verfahren nach Anspruch 4?« dadurch gekennzeichnet, daß die Behandlung mit der Cellulasemischung bei einer Temperatur von etwa 55⁰G durchgeführt wird·

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