DE1793623A1

DE1793623A1 - Verfahren zur Herstellung therapeutisch wirksamer Hydroxycarbonsaeuren

Info

Publication number: DE1793623A1
Application number: DE19651793623
Authority: DE
Inventors: Nugteren Diederik Hendrik; Beerthuis Roelof Karel; Dorp David Adriaan Van; Hendik Vonkeman
Original assignee: Unilever NV
Current assignee: Unilever NV
Priority date: 1964-05-08
Filing date: 1965-05-07
Publication date: 1971-09-16
Also published as: CH479521A; BE661873A; DE1493367B2; NL6505799A; DE1793623B2; DK130148C; LU48547A1; DK130148B; NL159374B; DE1493367C3; DE1493367A1; US3579425A; NO119906B

Description

Die vorliegende .Erfindung ^eaish-t .sich auf thex^apeutiseh wirksame '%droxycarDonaäuren und liefert ein neues Ver~ au " J-hr'er Hej^atelliräg.

sind Hv-droitycarboiaaiiai.:^^ £vJ.t. pha

?..B. hypertenaiyer oder hyp οι «naiver Aktivität und die glatte Muskulatur stimulierender Aktivität festgestellt wordenο Die aktive Substanz» Prostaglandin genannt j wurde in verschiedenen aekundären GeschlechtBorganen, insbesondere in den ProatatadriiDsn (glandulae -resiealis und ampullae ductus) festgestellt_? jedooh auch in anderen Organen5 wie a.B. der Thymusdrüse, der IriB ittid den Lungen. Die Samendrüaen (vesicular glände) von Schafen erwissen sich als besonders reich an Px'ostaglandin, jedoch enthalten auch die Drüsen anderer Säugetiere wesentliche Mengen von Prostaglandin.. ■

Eb wurde gefunden, daß das wirksame Prinzip* das Prosta-· glandin, eine Reihe ungesättigte^ nicht-aromatischer Hydroxycarbonsäuren enthält, die alle verwandt sind mit dar nachstehenden Stamiaaäure,., der 7-(2~0ctyi~öyclopentyl)-heptansäure» die Prostansäure genannt wird?

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BAD ORiQINAL

20 19-13 H H 7-2

CH, -(GH«)-——6 —— C—- (CH₉),-~

ld i Oj ^N. QJf

11 \ -2 9/ ^

10*
Die folgenden Prostaglanäine sind iden'iifislert worden s

Proataglanain JS₁ (PGE₁ )

HH
OH.-CGH-.J.-CHOH-.Cfl^GH- ώ —— C -(CH₀) ,--COOH

HO

Proabaglandin Iu₂ (PGE₂)

CH-*(CH₂)₄-CH0H»CH«CHr O -—C »

PH G=O

HO

Prostaglandin

? -CH=CH- (J -C -CH₂-CH=CH-CCH₂

HO CH₂

110C f 15-Dibydroxy-9-keto-pro3 fca-5,13,17,trien-Säure.

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ORIGINAL

Prostaglandin F

OH—(OH₂ ) _A :UHOH-CE^CH C ■■--

PH
HO C

-(CH₀),- - GOOH

9c£ί 11 oC < ■ 15**5!rj.hydroxy-»proöt~'^!3»cn-Säure

Prostaglandin F₀

0H,-( CH₉/, «0H0H-.0H«Ca

O
j

CH

HO

C i

CK

-(CH₀)--COOH

9cC< 11 oc, 15~2)rihydroxy-prosi;a-5,'3-di6n--Säure

₂, P&£- und PG?.. 2s ei gen eine kontreictierende Wirkung auf glatte Muskeln und eine hypotensive Aktivität, Jedoch im allgemeinen ist PGEg bislang die aktivste Verbindung,

Die Prostaglandine 'sind isoliert worden durch Extraktion -son Drüsengewebe von Säugetieren, insbesondere von Gesohlöchtsdrüsengewebe, wie z.B. von Samendrüsen. Bs wurde festgestellt, daß die Ausbeute an Prostaglandin aue diesen Quellen gesteigert werden konnte durch Zusatz kleinei* Mengen an Detergentien oder spezifischen Enzymen, insbesondere solchen mit Esteraseaktivität· Die gesteigerten Ausbeuten wurden zurückgeführt auf eine Desintegration der Zellmembranen oder auf »ine Freisetzung der Prostaglandine, die in gebundener Form in dem Gewebe vorliegen.

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Dieser Zusatz von Detergentien oder spezifischen Enzymen_t der eine verbesserte iSxtraktionsausbeuto liefert_P stellt jedoch nur eine Verbesserung bei der Freilegung des aktiven Prinzips dar, welches als solches vorliegen muß.

Erfindungsgemäß werden Prostaglandine und verwandte Hydroxycarbonsäuren nach biosynthetischen Verfahren hergestellt, die darauf beruhen, daß Vorlätifer (precursors) tierischem Gewebe oder daraus hergestellten Präparaten, die in der Lage sind, Hydroxycarbonsäuren des angegebenen Typs aus diesen Vorläufern zu synthetisieren, zugesetzt werden.

iürfindungsgemäß werden also Prostaglandine und verwandte Hydroxycarbonsäuren erhalten aus Vorläufern durch Zugabe von tierischen Organen, wie a.B« sekundären Geschlechtsdrüsen, Thymusdrüsen» Iris und Lungen, Gedärmen, Pankreas« Nebennieren und Gehirn oder daraus hergestellten Zubereitungen, wie z.B_e der überstehenden. Flüssigkeit oder den Zellfraktionen. Die Umsetzung wird bewirkt mit Hilfe der Ton dieaen Organen zur Verfügung gestellten Enzymaystame...

iSin wichtiges Merkmal der vorliegenden Erfindung ist die Umwandlung gewisser Fettsäuren oder ihrer Derivate in Prostaglandine durch Behandlung dieser Fettsäuren oder ihrer Derivate mit Homogenaten oder Stücken der oben erwähnten Organe, wie z.B. der sekundären Geschlechtsorgane, insbesondere der Samendrüsen von Schafen_s unter physiologischen oder subphysiologisohen Bedingungen.

Die Fettsäuren und deren Derivate, die erfindungsgemäß benutzt werden können, können durch die allgemeine Formel

- (CH«CH-CH₂)_p - (OH₃)^ - COOM

dargestellt werden. Io welcher M Wasserstoff oder Alkali-Metall t a eine Sahl atrisehen O und 7;

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_f: . ÖÄD ORIGINAL·

ρ eine Zahl zwischen 2 und δ und ^ eine Zahl zwischen O und 12 darstellen, wobei die Gesamtzahl der Kohlenstoffatome in dem Molekül» mitAusnahme derjenigen von M, 18 - 22, vorzugsweise 20 beträgt.

Die obenerwähnt en fettsäuren und deren Derivate umfassen eine Gruppe,, die als essentielle !fettsäuren bekannt sind, da sie für den Menschen und verschiedene Tiere in deren Nahrung notwendig sind, weil 3ie von dem Organismus nicht synthetisiert werden und Mangelerscheinungen bei ihrer Abwesenheit auftreten ., Was die chemische Struktur dieser Fettsäuren anbelangt, ist festgestellt worden, daß sie ein sog. "System Übersprungener Doppelbindungen" besitzen, in welchem zumindest zwei cis-Athylendoppölbindungen anwesend sind_r und in den Vorläufern, mit denen die besten Ergebnisse erhielt wurden, besitzen alle äthylenischen Doppelbindungen cis-Konfiguration. Unter einem "System übersprungener Doppelbindungen" wird ein System äthylenischer Doppelbindungen verstanden, die voneinander durch eine Methylengruppe isoliert sind.

Wichtige Säuren und ihre Derivate, die für die Biosynthese in der oben beschriebenen Weise verwendet werden können, umfassen essentielle Fettsäuren, wie z,B_s:

Homo-y-Linolensäure (Gesamt cia-ßicoBan-8,11,H-triensäure) Arachidonsäure (Gesamt cie-üieo san-5,8,11,14-tetraensäure)

wie auch Gesamt-cis-Säuren ähnlicher Konstitution wie s„B.t

Gesamt-ois-ßicosan-5,8,11,14,17-pentaensäure Gesamt-cia-Nonadecan-?,10,13-triensäure Geeamt-cis-Honadeoan-4-,7,10,13-tetraensäure.

Obgleich verschiedene essentielle fettsäuren festgestellt worden sind und die Mangeleracheinungen, die durch ihre Abwesenheit verursacht werden, ausführlich beschrieben worden sind, ist ihre genaue Wirkungsweise nicht bekannt. Mit Hin»

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blick auf die nachstehend beschriebenen Versuche kann nunmehr angenommen werden, daß eine funktion dieser essentiellen fettsäuren in ihrer Wirkung als Vorläufer der hormonartigen Substanz PGE liegt.

So wirkt Homo-#-Linolensäure als Vorläufer von PGJE₁ und PGF₁J₅₆ j und Arachidoksäure wirkt als Vorläufer von PGEp und KPg.^, während l3ieQsan-5,8,11,14-t17~pentaensäure (eine nicht-essentielle Fettsäure) als ein Vorläufer von PGE, und

wirktο Die Tatsache, daß PGE₂ weitaus biologisch aktiver ist als PGE,, läßt vermuten, daß in dem Organismus die essentiellen Fettsäuren als Vorläuferquelle von größerer Bedeutung für die-Prostaglandine wirken.

JSs wurde als vorteilhaft gefunden, die Umwandlung der Fettsäuren oder ihrer Derivate bei einer Temperatur vorzugsweise zwischen 10 und 6O⁰C in einer gepufferten Lösung mit einem pH-tfert zwischen 4 und 10 und vorzugsweise zwischen 7 und 9, durchzuführen, und es zeigte sich auch, daß die Ausbeute weiter gesteigert werden kann durch Zusatz verschiedener Salze, Zucker (z.B. Glucose), Proteine (2.B. Albumin), Aminosäuren, Vitamine und Antioxidantien, wie z.B. Propylgallat. Im allgemeinen werden der Vorläufer und die frischen Organe oder die daraus hergestellten Zubexeitungen während Zeiten von mehreren Minuten bis mehreren Stunden umsetzen gelassen, vorzugsweise 15 bis 180 Minuten. Obgleich unter anaerobeuBedingungen eine gewisse Umsetzung erzielt wird, liefert die Anwesenheit von Sauerstoff verbesserte Ergebnisse und die Reaktionsmischung k&nn während der Umsetzung belüftet werden. Bei der Umsetzung von größeren Mengen an Substrat, wie z.B. den genannten essentiellen Fettsäuren, wird der nachstehend in Beispiel 1 beschriebene Versuch verwendet ssur Ermittlung der optimalen Menge des Vorläufersubstrates, welches je Masaeneinheit der frischen

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Organe zugesetzt werden muß. Zu diesem Zweck werden verschiedene Konzentrationen des Substrates zu einer gegebenen Menge der frischen Organe oder der daraus hergestellten Zubereitungen zugesetzt, und Muster v/erden zu verschiedenen Zeiten abgezogen. Vorzugsweise werden die ganzen homogenisierten Organe verwendet, obgleich aueh aktive Fraktionen erhalten werden können durch differentielle Zentrifugierung. JEine Trennung der homogenisierten Organe durch Zentrifugierung in Überstehende Flüssigkeit und Niederschlag liefert nicht immer in erwünschter Weise aktive Fraktionen. Aus den so erhaltenen Ausbeuteergebnissen können die optimalen Reaktionsbedingungen ermittelt werden_s welche dann verwendet A werden bei der Herstellung der Präparate mit nicht-radioak-Mv«e Material. Xn diesen Versuchen können die bekannten Verfahren verwendet werden zur Bestimmung der Mengen der gebildeten Prostaglandine (z.B. Bestimmung des ültraviolett-Abeorptionsspektrums bei 278 oder 280 Millimicron vor und nach Zusatz von Hatriumhydroxyd).

JSs wurde weiterbin gefunden, daß sehr gute Ergebnisse erzielt werden, wenn ein Gewichtsverhältnis von ungesättigten Fettsäuren zu frischen Organen zwischen 1:1.000 bis 1t4.000 und vorzugsweise zwischen 1:2.000 bis 1:3*000 verwendet wird.

Im Vergleich mit den Ausbeuten, die erhalten werden von dem _ Drüeengewebe von Säugetieren ohne vorherige Zugabe der Vor- ™ läufer, liegen die Ausbeuten bei dem erfindungegemäßen Verfahren bis zu 20 aal höher. Das erfindungegemäfie Verfahren eröffnet somit die Möglichkeit der Herstellung der Prostaglandine in einem Maßstab, der für ihre Hutsanwendung ale Therapeutika notwendig ist.

Die Biosynthese gemäfi vorliegender Erfindung wird nun durch die nachstehenden Beispiele beschrieben.

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BAß -

Beispiel 1

Der Methyleeter von (resamt-cis-IÜcosan-S,^ 11, H-tetrayn« säure wurde reduziert mit tritiumhaltigem Wasserstoffgae über Lindlar-Katalyeatoro Hach Reinigung durch Dünnschicht.·- Chromatographie und Verseifung auf übliche Weise wurde tri·- tiummarkierte Arachidonsäure erhalten mit einer spezifischen Radioaktivität von 0,91 x 10"² milliCurie (mC) per mg. Die Probe wurde einer gaechromatographischen Analyse unterworfen und es wurde gefunden_fl daß sie zu 95 ₉ 6% rein war. Das Infrarotabsorptionsspektrum zeigte, daß nicht mehr als 3 # der Trane-Konfiguration anwesend war, und durch das Ultraviolettabsorptionaspektrum konnte keine Konjugation festgestellt werden.

1 mg der tritium-markierten Araehidonsäui-e mit einer Aktivität von 4s1 χ 10 gezählten Entladungen je Minute (cpm) (Wirksamkeit des Zählgerätes 2O₁₁TyS) in 20 ml 0,15 molarer Kaliumphosphatpufferlöeung mit einem pH-Wert von 7,5 wurde während verschiedener Zeitspannen bei 37⁰C inkubiert mit 20 g Samendrüsen von Schafen, die unmittelbar nach dem Schlachten geBammelt, während einer Woche auf Trockeneis gelagert und in gefrorenem Zustand zermalilen wurden.

In diesem und den folgenden Beispielen wurde die Inkubieruttg bewirkt durch die herkömmliche Methode« nach der die Htaktionemlechung in einem luftoffenen (Jefaß in einem Ofen, der thermo et at lach bei der gewünschten Inkubationstemperatur gehalten wurde, langsam geschüttelt wurde.

Nach der Inkubierung wurden 160 ml von 9βΜgern wässrigem Äthanol, welcher 15 ml normale Salzsäure je Liter enthielt, augesetzt und die Prostaglandine wurden nach folgender Verfahrensweise isoliert.

Nach Zusatz des angesäuerten Äthanols wurde die Lösung über lacht stehengelassen. Danach wurde die Lösung filtriert,

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wodurch ein iiltrat und ein Rückstand erhalten wurden. Der Filtrationsrückstand vrarde zwei Mal mit dem angesäuerten Äthanol gewaschen. Das Filtrat und die Waschflüssigkeit wurden vereinigt und im Vakuum unterhalb 4O⁰C auf etwa t/5 des ursprünglichen Volumens konzentriert, Das rohe Konzentrat» welches so erhalten wurde, wurde mit 6n Salzsäure auf einen pH-Wert von 3 angesäuert und danach 3 Mal mit reinem Äther extrahiert. Die Ätherextrakte wurden vereinigt und mit Wasser gewaschen bis zur neutralen Reaktion. Die so be~ handelten Extrakte wurden mit Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum zur !Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde einer φ dreistufigen Gegenstromverteilung zwischen gleichen Volumina von 66^ Methanol und Petroläther unterworfen»

t/20 des Materials (A), welches in der wässrigen Phase nach der dreiatufigen Verteilung zwischen 66$ Methanol und Petrolätber erhalten wurde, wurde einer DünnschichtChromatographie auf Kieselsäuregel (G-; ex Merck) mit dem Löaungsmittelsystem BenzolsDioxan:£ssigsäure (20s20j1) unterworfen. Die flecken wurden durch Anfärben mit Jod sichtbar gemacht, nach Verdampfung des Jode getrennt von der Platte abgekratzt und mit Methanol eluiert. Das Methanol wurde verdampft und die Radioaktivität wurde mit einem Packard-Iricarb-Spektrometer gemessen. Tabelle 1 zeigt die Verteilung der Radioak- (J tivitat über den Chromatogrammen nach 5, 15 und 30 Minuten Inkubationszeit. Aus dieser Tabelle ist ersichtlich, daß die Radioaktivität nach 30 Minuten fast vollständig innerhalb des Rf-Wertbereiches von 0,50 bis 0_?62, in welchem Bereich eine Vergleicheprobe von reinem PoB₁ lag, entwikkeltwar.

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Tabelle 1

Rf ⁺⁾	Counts	ι pro Minute	+·*■)
0,74 - 1,0	a	P	C
0,62 - 0,74	21447	23869	7180
0,59 - 0,62	2445	3404	7731
0,50 - 0,59 '	766	10362	25307
0,41 - 0,50	189	380	20565
0,29 - 0,41	218	513	1146
364	59?	548

+) Rf 0,59 - Op62 entspricht PGE, Rf 0,29 - 0,41 " Pi¹G. Nicht umgesetzte Aracbidonsäure zeigt einen Rf-Wert von 0,74 - 1,0

++) a * 5 Minuten Inkubation, b e 15 Minuten Inkubation, c * 30 Minuten Inkubation.

Eine andere Probe in einer Menge von 1/20 des Materials (A) wurde einer IXlnnaohichtChromatographie» wie oben beschrieben, unterworfen. Nach Verdampfung des Methanols wurden 2 ml Wasser zugesetzt, die Lösung wurde mit normaler Salzsäure angesäuert und zwei Mal extrahiert mit je 2 ml Äther. Der Äther wurde entfernt und der Rückstand gelöst in 5 ml einer wässrigen Lösung, die 0,9 g je 100 ml Natriumchlorid, 0,02 g je 100 ml Kaliumchlorid, 0,02 g je 100.ml Calciumchlorid, 0,01 g.je 100 ml Magnesiumchlorid, O₅1 g je 100 ml Glukose, 0,1 g je 100 ml Natriumhydrogenoarbonat und 0,005 g je 100 ml Natriumdihydrogenphosphat enthielt« Die biologische Aktivität wurde geteetet an Meer-BChweinchen-Iloue und der fleck mit einem Rf-Wert von 0,60, entsprechend PGB, zeigte starke Aktivität.

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SAD OFUGtNAL

Von einem anderen 1/20 Anteil des Materials (A) wurde PGE isoliert und wieder einer Dünnschichtchromatographie unterworfen unter Verwendung eines Silicagels (Gj ex Merck), welches wit 10/i Silbernitrat imprägniert war, während ein Lösungamittelsystem aua ÄthylacetatiiässigsäuresMethanol i 2,2*4-Trimethylpentan*Wasser (itO;3O:35s !Os 100) angewandt wurde., Nach jäntwicklung wurde die Platte in verschiedene Zonen i,eschnitten_r die abgekratzt wurden, mit Methanol eluiert wurden und von denen"die Badioaktivität gemessen wurde. Die iirgebnxsse dieses Versuches sind in Tabelle 2 zusammengefaßt .

Tabelle 2	Rf	Counts pro Minute
0,34 - 0,35	182
0,47 - 0,59	1110
0,59 -■ 0,67	2484
0,67 - 0,75	645
0,73 - 0,79	552
0,79-0,85	619
0,85 - 0,94	666

Die höchste Akt!Titat wurde bei einem Bi-Wert von 0,63 gefunden, der dem von PGE^ entspricht.

Die Ergebnisse zeigen klar, daß Arachidoneäure in umgewandelt wird, entsprechend nachstehender Formeln»

CH^-(CH₅).-CH-CH-CH₉-CH HC-CHp-CHeCH-(GH«),-COOH 7 d * * ff \ ^{c y}

ff \

CH 9 HC

CH
CH

i ψ I

₃-(CH₂)₄-CHOH-CH«CH-C C-CH₂-CH=CH-(CH₂)--COOH

>9β4 _109838/1767

HO'

OHiGlNAV

Bine grobe Berechnung, basierend lediglich auf der in festgestellten Radioaktivität, zeigt, daß die Arachidonsäure in einem Ausmaß von zumindest 16$ in PGJSp umgewandelt wird·

Unter Berücksichtigung der Satsache, daß Material während der Isolierung verloren geht, und daß sicherlich Sritium, welches an dem Kohlenstoffatom 9 der Arachidonsäure haftet, Ton dem Molekül abgespalten wird, kann man sagen, daß die tatsächliche Umwandlung noch wesentlich höher liegt.

0,5 g Kaliumarachidonatp welcbee in 2 1 0,1 molarer Kaiiumphoephatpufferlösung (pH « 7,5), welche 5. g Rinderserumal~ bumin enthielt, gelöst war, wurde während 2 Stunden bei 37⁰O mit der überstehenden Lösung eines Homogenates inkubiert, welches aus 1.250 g frischen Samendrüsen von Schafen erhalten worden war. Diane überstehende Flüssigkeit wurde auf folgende Welse erhaltens Die frischen Drüsen wurden ver~ mahlen alt 2,5 1 0,1 molarer Kaliumphosphatpufferlösung (pH β 7,5) und die so erhaltene Aufschlämmung wurde in einer Ultrazentrifuge während 10 Minuten bei 4.000 χ g bei 2⁰C behandelt* Die überstehende Flüssigkeit wurde abgehebert, und der Rückstand wurde In 300 ml der gleichen Pufferlösung suspendiert und nochmals zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde wieder abgehebert und mit der ersteren vereinigt. Die gesamte opalisierende Lösung enthielt etwa 50 g Proteinmaterial, in welchem das aktive finzymsystem vorlag· M.& Gesamtmenge von Prostaglandinen JS, welche hierin anwesend war, betrug weniger als 50 mg.

Äaeh Inkubierung wurden 15 1 96^iges, wässriges Äthanol zugesetsst, mit normaler Salzsäure wurde auf einen pH-Wert von 4 angesäuert und der Niederschlag wurde abgefiltert. Die Lösung wurde konzentriert auf etwa 1 1 durch Vakuumdestillation bei einer Temperatur unterhalb 3O⁰O.

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8AD

Der Rückstand wurde 3 x extrahiert mit ^s 500 ml reinem Äther» !fach trocknen über Uatriimiaulfat -.vurde der ätherische Extrakt zur Trockne singedaanpft unö. der Rückstand von etwa 15 g vw-rde verteilt uwisehwxi 750 m? 66#igem wässrigen Methanol ursä 7 50 ml Petroläther»

Die wässrige Phase wurde unter Vakuum siur Trockne verdampft und etwa 3g Material vrarden -erhalten. Diesea Material enthielt, etwa 34O mg Prostaglandin Ü2«.

Das Material wurde gereinigt durch Koloiinenchromatographie über Kieselsäure ₉ die vor Verwendung "bei 115⁰G aktiviert worden war« Die Subatarss -wurde golöat iu ÄthylacetatJBenzol (30:70) uncl auf die Kiesel säurekoJLonne (30 :x 2 cm) aufgebrachte Die. Kolonne wurde mit ilthylacotat:B&ns!ol (30:70) durchgewaachen und das Prostaglandin E wurde dann eluiert mit Äthylacetat5Bensol (60i40)„ Das PGE wurde bestimmt durch Behandlung von aliquoten Teilen der Fraktionen mit 0_s5 normaler Natriumhydroxydlösung in 50'^igem wäsBrigen Äthanol, wonach die Absorption bei 278 Millimicron gemessen wurde_β Nach 30 Minuten wurden die das PGiS enthaltenden Fraktionen vereinigt und im Vakuum eingedampft. De:? Rückstand wurde in Portionen von 1 g durch Chromatographie gereinigt auf einer Kolonne mit umgekehrter Phase (Trägersmit Sllan behandeltes Hyflo supereel; stationäre Phaseslaooet&noliChloroform (lsi); Verhältnis der stationären Phase zur beweglichen Phase 1s10). Die Packung der Kolonne bestand aus 22_r5 g Trägerstoff mit 20 ml stationärer Phase. Die Ausbeute aa praktisch reinem Prostaglandin E2_pdie so erhalten wurde, betrug 250 mg.

Beispiel 2 wurde wiederholt_g es wurde jedoch nun als Vorläufermaterial 0,5 g des Kaliumsalzee von Homo-#-Linolensäure (Gesamt-cis iSicoBan~8_s 11,14~triensäure) verwendet, die in Prostaglandin ß1 umgewandelt wurde« Die so erzielte Gesamtausbeute an Prostaglandin B1 betrug !90 mg.

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PRIGtNAL

Beisp-ielA

36 kg Samendrüsen von Schafan wurden in Meinen Anteilen homogenisiert mit einem Gesamtvolumen το? 36 1 0,1 M Phosphatpuffer (pH as 7„5) in einem Hoehgesehwindigkeitshomogenisator, der auf O⁰G gekühlt wurde. 12 g Homo·»'£ ■-Linolensäure wurden in 12 1 O₉15 M G-lycr;apuffer (pH=9,0) gelöst.

3 1 Portionen des Honiogenates wurden au 25 1 Gl.yoinpuffer zugesetzt, der in einem (Jefäß aus nicht-ro at enden* Stahl auf 75°ü gebracht worden war, und 0,5 1 eier Hom»v~ ^;-Linolensaurelösung wurden angesetzt« Die Mischung wurde während 2 1/2 Stunden bei 37⁰G unter Rühren und ständigem Durchleiten eines Sauerstoffstromes inkuMert, Die Reaktion wurde aufgehalten durch Zugabe von 8 η HpSQ,, t>is der pH-Wert unterhalb 3 lag. Auf dieae Weise wurden 24 Anaätze inkubiert.

Zu der Reaktionsmischung wurden 240 1 S^iges wässriges Äthanol zugesetzt, und die Mischung wurdo über üachi stehengelassen» Die Überstehende flüssigkeit wurde soweit wie möglich abdekantiert, und der Rückstand wurde wieder 2 Mal mit 120 1 96/&igem Äthanol extrahiert.

Die vereinigten Alkoholextrakte wurden filtriert und konzentriert durch Mndampfung unter Vakuum bei 35⁰G- Zu dem Rückstand wurde eine gleiche Volumenmengs Wasser zugesetzt und diese Lösung wurde danach 3 Mal mit Diäthyläther extrahiert.

Die ätherischen .Extrakte wurden vereinigt, mit destilliertem Wasser gewaschen, bis der pH-Wert dea Waschwassers etwa neutral war, und mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Die Hauptmenge des Äthers wurde unter Vakuum abgedampft. Der Rückstand, der etwa 7 g rohes PG-E₁ in etwa 800g Lipidmaterial enthielt, wurde chromatographiert in Mengen

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von ie 15 - 20 g auf Lnlonneri (Durchmesser 5 cm), die mit 150 g Kieselsäure (toaXlinckrodt 100-niesh. /nalysenreagens) gepackt waren.

Die .Fraktionen, welche ö.as Prostaglandin !!enthielten und mit Chloroform, welchen 2 ~ 5/* Methanol enthielt, eluiert wurden, wurden vereinigt und nochmals ohromatographiert In derselben Waise. -'Danach wurde das so erhaltene, noch unreine Prostaglandin Ja gereinigt durch ■ Uhromatographie unter .Verwendung deβ umgekehrten Phasersysteme_} welches in Beispiel 2 beschrieben wurde» Die; das PGJE.. enthaltenden iiraiktionen wurden vereinigt und das Lösungsmittel wurde unter Vakuum bei einer Temperatur unterhalb 35⁰C abgedampft. J5«# zurückbleibende Material «vurde aua wässrigem Methanol unikristallisiert und ergab 4 g reines PGE.,» Schmelzpunkt 114⁰C.

Beispiel 5

Samendrüsen von Schafen (250 g) wurden mit 600 ml 0,1 M Phoi.phatpuffer (pH .-= 7,1) in einem auf 0° gekühlten Hochgesohwindigkeitshomogenisator während 50 Selninden homogenisiert. Das Homogen!sa-^:; v.-urde dann während 10 Minuten bei 4ο000 χ g sentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit v/urde wieder einer Zeiitrifugiei-ung unterworfen unter denselben Bedingungen. Die so erhaltene, truae Lösung wurde dann in einer Ultrazentrifuge während 60 Minuten bei etwa 100.000 χ g zentrifugiert.

Der Niederechlag wurde mit 200 ml einer Pufferlösung von pH ts 8,0, die 0,01 M Phosphatpuffer, 0,01 M Dinatriumdihydrogenäthylendiamintetraacetat und 0,001 M Cystein enthielt, aufgerührt und nochmals während 60 Minuten bei 100.000 g zentrifugiert. Die gewaschene, teilchenförmige Fraktion enthielt etwa 1,9 S Protein und nur 1,6 mg Prostaglandin ß. öle würde- suspendiert in 100 ml 0,1 M Trikaliumphosphat, pH * 8,0, und dann inkubiert während 5 Minuten

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bei 3O⁰C mit einer 0*2 M tria-ChydroxymetbylJaminomethan-'HCl· Pufferlösung (pH =1 8₆O). die 200 mg Homo-,Jf-Linolensäure

und 75 mg Propylgallat enthielt. Die Inkubation wurde "beendet durch Zugabe \·ο:α 0,2 M Zitronensäurelösungi bis ein pH-Wert von ;5,5 erreicht wurde (etwa ISO ml). Die angesäuorte Mischung wurde 2 Mal extrahiert mit einem gleichen Volumen von Diäihyläther. In dem &Uier£e®h«m Extrakt waren 19 EBg ( 8 #) Proetagland In El enthalten-,

4.ÖO g Samendrüaen von Schafen wurden mit 400 ml Wasser rc einem gekühlten HochgeBchwindigkeitshoHiot^iiieator horao/je.u'· siert und weiter verdünnt mit SOO nl destilliertem Wasser Alle Arbeitegänge wurden bei 0° ausgeführt·. In kleinen Anteilen wurden 200 ml (Feuchtvolunien) Dowüx Anionaußtauechfaarz AG 1 χ 2,50 -. 100 ,mesh (ein handelsübliches Produkt, welches mit Kohlenstoffdioxyd behandelt ist), in der OH"-Form_e gesättigt mit GO₂, unter Rühren zugesetzt, während gleichzeitig ein schneller O0₂-Strom duroogeleitet wurde. Die Miechung wurde filtriert durch ein Käsetuch zur Entfernung voa Bindegewebe und Ionenaustauschern. Die so erhaltene, trübe Lösung (1,2 1» pH«8_f2) enthielt nur wenige mg von endogenen Prostaglandinen. Sie wurde aerob während 30 Minuten bei 30° inkubiert mit 175 mg Arachidonsäure, die in 400 ml einer 0,05 M Phosphatpuffer (pH = 7,5)'und O₉2 M tris(hydro-· xymethyl)aminomethan* HGl Puffer enthaltenden Lösung gelöst wax; pH a 9,0 (in einem Volumenverliältnis von 1:1).

Ha,ch'der Reaktion wurde die Mischung angesäuert mit 4· ja. Schwefelsäure, bis ein pH-Wert unter 3»5 erreicht war, unä 25Ο ml Alkohol wurden zugesetzt und danach wurde 2 Mal mit

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>2 einem Liter Äther extrahiert. Der ätheriauhe Jlvtraict nthielt 65 rag Prostaglandin &2 und 14 mg Prostaglandin

Bei am', el 7

Ausgehend von 400 g Drüsen und 200 mg ßeoasrb-cis·-?»tO,i3~ ^oiiadGcantriensäure unter Verwendung derselben Verfahrensweise wie in Beispiel 6 beschrieben.;, wurden in dsm ätherischen i^trakt 27 mg Nor-PGrE. und etwa 5 mg NOr-PCrF_1n, erhalten (unter Hor~ProBtagiandinen werden Prostaglandine verstandenj in welchen 5 Methjlengruppen zwischen der Carbo xylgruppe und der CyclopentylgruppQ stehen)..

Mach Chromatographiacher Reinigung und Kristallisation des Ilor-PGIJL aus wässrigem Methanol wurden 9,ö lag nadeiförmige Kristalle erhalten* ..Dieses 'Material wurde duroh Masaenspektroskopie ala Nor-Prostaglandin Ki identifiziert (Molekular gewicht 540). Durch Gaachromatograph'ie konnte keine Verunreinigung mit PGiS₁ oder PG-Bp ißs'cgö-ütellt werden. J3er Schmelzpunkt betrug Q9°.

Stück Duodenum (65 g Feuehtgewicht) eines männlichen Schafes wurde in Stücke geschnitten und homogenisiert in einem Hochgeschwindigkeitshomogeniaator mit 200 ml 0,01 M Phosphatpuffer (pH = 8,0).

Das Homogeniaat wurde zentrifugiert während 10 Minuten bei 4o000 χ g. Die trübe überstehende Flüssigkeit wurde zentrifugiert während 60 Minuten bei 100.000 χ g. Der Niederschlag, der bei der zweiten Zentrifugierung erhalten wurde, wurde suspendiert in 12 ml 0,1 M Phosphat (pH = 8,0). Diese Zubereitung wurde verwendet für die folgende Inkubation j sie enthielt 30 mg Protein je ml.

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01* -^nzymlöaung (1,5 ml) wurde inkubiert mit 95 Ia'. erogramm · (·1- ^Cj-hoiau-gaijina-LLnolensärae (95-OGO cpm). in 1 ml O._f2 M tri8-(hydroxymethyl}arainome+.hfcn. HCl IpE - 8,0* während 10 Minuten bei 30⁰O (ah

Nach der Inkubation wurde die Mischunf angesäuert und φ mit Äther extrahiert» Nach Zusatz von 18?. Micrograram PGE. und 100 Microgramm -PGi¹.^ wurden die ätherischen Extrakte zur Trockne gebracht= Das Material wurde Chromatographiert auf einer dünnen Schicht von SilicageX (G; ex Merck) mit dem Lösungsmittelsystem Chloroforffl-Methanol-iSssigaäuretfasser (90*6:1:1, Volumen) als Jüluierungsmittel. Die lage der Prostaglandine wurde bestimmt, indem das Ohromatogramm Joddämpfen ausgesetzt wurde und die das .Prostaglandin K bzw« i¹ enthaltenden Zonen nach Verdampfung des Jods abge~ kratzt wurden· Das PGE 1 wurde aus dem Silicagel mit Methanol eluiert und mit 0,5 M metbanolischer KOH während 10 Minuten bei 20⁰C behandelt» Das so gebildete Entwässerungsprodukt wurde isoliert durch Dünnsehichtchromatographie auf P Silicagel (G; ex Merck) mit dem Lösungsmittel Ätber-i5ssig~ säure (100*2)· -^in Teil wurde getestet auf Radioaktivität, in einem anderen Teil wurde die Extinktion bei 280 Millimicron gemessen, iüs konnte berechnet werden, daß das ursprüngliche PGB₁ folgende Hadiοaktivität besaß: 167 C.p.i.

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- 13 *

KinnscbichtChromatographie auf ii.it Silbernitrat imprägniertem Silicagel (S; ex Merck) verursachte keine weitere Abnahme der spezifischen Radioaktivität des dehydratisierten

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OKlGMAL

Claims

179362 ng aus P lh 93 367 Pate n. tans ρ r ü a a e

1. Ί'.Verfahren zur biosynthetiscLßn Ha^stt·· llung von

glandinen, dadurch gekennzeichnet, ü.wß Peti^ilm'en oder deren Derivate der allgemeinen I-'ormei.

Gesamt-cis CH₃-(CH₂)_R-CCH*CH·-CH₂^- CCH₂ )_Q-COOM

in welcher M Wasserstoff oder MkaXinefcall darstellt _s η eine Zahl zwischen 0 und 7* P «ine Sahl awischen 2 und und q eine Zahl swiochen 0 und :',2 darstellen., wobei die Gesamtzahl der Kohlenstoffutome in dem Molekül 18-22, vorzugsweise 20, beträgt mit tior.isci.Mim Gewebe aaa aekun~ dären Geschlechtr;drüben, Thymui.drüse;:s_P Iris, Lungen,, Singeweiden, Pankreas. N«benni&rer. oder Gehirn, oder aus oolchem Gewebe hergestellten Zubereitungen in Anwsaonhsifc von Sauerstoff bei feinem pK-Werfc des üms^taungsräicdiumK von ^-10, vorzugsweine 7-9 und bei einer Temperatur von 10-60⁰C behandelt werden..

2.) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Sauerstoff enthaltenden Gas duret die Reaktionen!- schung geleitet wird.

3·} Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Ausgangsfettßävire Gesamt-cin-Eicoaan-S, 11,14-Tciensäure oder Geaamt~cis-Eicoßan~5_s8,15._i.li|-Tetraensäure oder Gesamt-cis-Eiöosan-fj^,!!,!¹!_Si7-Pent:.enßäure oder Gesamt-cis· Nonadecan-7,10,13-Triensäure oder Genamt-cis-Nonadecan- ^,7,10,i3-Tetraensäure oder deren Derivate verwendet werden.

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BAD ORIGINAL