DE1493367B2

DE1493367B2 - Verfahren zur herstellung von prostaglandinen

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Publication number: DE1493367B2
Application number: DE19651493367
Authority: DE
Priority date: 1964-05-08
Filing date: 1965-05-07
Publication date: 1973-05-03
Also published as: BE661873A; DE1493367A1; NO119906B; CH479521A; DE1493367C3; DK130148C; DE1793623B2; DK130148B; DE1793623A1; LU48547A1; NL159374B; US3579425A; NL6505799A

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Herstellung von Prostaglandinen und betrifft eine Verbesserung des Verfahrens der Hauptanmeldung P 17 93 623.

Die Hauptanmeldung P 17 93 623 betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Prostaglandinen, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß eine Gesamt-cis Fettsäure der allgemeinen Formel

CH₃ — (CH₂)„ — (CH = CH - CH₂)j, — (CH₂)_g — COOH

in welcher η eine Zahl zwischen O und 7, ρ eine Zahl zwischen 2 und 6 und q eine Zahl zwischen O und 12 darstellen, wobei die Gesamtzahl der Kohlenstoffatome in dem Molekül 18 bis 22, vorzugsweise 20, beträgt, mit tierrischem Gewebe aus sekundären Geschlechtsdrüsen, Thymusdrüsen, Iris, Lungen, Eingeweiden, Pankreas, Nebennieren oder Gehirn, oder aus solchem Gewebe hergestellten Zubereitungen in Anwesenheit von Sauerstoff bei einem pH-Wert des Umsetzungsmediums von 7 bis 9 und bei einer Temperatur von 10 bis 60° C behandelt wird.

Die Umwandlung wird mit den in diesen Geweben vorhandenen Enzymsystemen bewirkt, wobei Homogenisate oder Stücke der Gewebe verwendet werden können, insbesondere von Samendrüsen von Schafen.

Gemäß vorliegender Erfindung wird das Verfahren des Hauptpatentes dadurch verbessert, daß dem Umsetzungsmedium Glutathion (y-L-Glutamyl-L-cysteinylglycin) zugesetzt wird. Das Glutathion wirkt bei der Biosynthese als Cofaktor. ' . ;.

Wichtige Säuren und ihre Derivate, die für die Biosynthese in der oben beschriebenen Weise verwendet werden können, sind die folgenden essentiellen Fettsäuren: Homo-y-Linolensäure (Gesamt Cis-Eicosan-8,11,14-triensäure), Arachidonsäure (Gesamt cis-Eicosan-5,8,ll,14-tetraensäure) und die weiteren Gesamtcis-Säuren: Eicosa-5,8,ll,14,17-pentaensäure; Octadeca-3,6,9,12-tetraensäure; Nonadeca-7,10-13-triensäure; Nonadeca-4,7,10,13-tetraensäure, Heneicosa-9, 12,15-triensäure; Heneicosa-6,9,12,15-tetraensäure; Docosa-7,10,13,16-tetraensäure; Eicosa-7,10,13-triensäure.

Es zeigt sich ferner, daß die Ausbeute noch weiter gesteigert werden kann durch Zusatz von Antioxidantien, wie Propylgallat.

Im Vergleich zu den Prostaglandinmengen, die aus Drüsengewebe von Säugetieren ohne Zusatz von Vorläufern isoliert werden, liegen die Ausbeuten bei Verwendung der gleichen Gewebemenge bei dem erfindungsgemäßen Verfahren bis zu 20mal höher.

Die Biosynthese gemäß vorliegender Erfindung wird nun durch die nachstehenden Beispiele beschrieben.

Beispiel 1

Samendrüsen von Schafen (250 g) wurden mit 600 ml 0,1 m Trikaliumphosphat (pH-Wert = 7,1) in einem auf O⁰C gekühlten Hochgeschwindigkeitshomogenisator während 30 Sekunden homogenisiert. Das Homogenisat wurde dann innerhalb von 10 Minuten bei 4000 g zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit wieder einer Zentrifugierung unter denselben Bedingungen unterworfen. Die so erhaltene trübe Lösung wurde dann in einer Ultraschallzentrifuge 60 Minuten bei etwa 100 000 g zentrifugiert.
Der Niederschlag wurde mit 200 ml einer Pufferlösung vom pH-Wert = 8,0, die 0,01 m Trikaliumphosphat, 0,001 m Dinatriumdihydrogenäthylendiamintetraacetat und 0,001 m Cystein enthielt, aufgerührt und nochmals 60 Minuten bei 100 000 g zentrifugiert. Die gewaschene, teilchenförmige Fraktion enthielt etwa 1,9 g Protein und nur 1,6 mg Prostaglandin E. Sie wurde in 100 ml 0,1 m Trikaliumphosphat, pH-Wert = 8,0, suspendiert und dann 5 Minuten bei 30° C mit einer 0,2 m Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-HCl-Pufferlösung (pH-Wert = 8,0), die 200 mg Homo-y-Linolensäure, 500 mg Glutathion und 75 mg Propylgallt enthielt, inkubiert. Die Inkubation wurde durch Zugabe von 0,2 m Zitronensäurelösung bis ein pH-Wert von 3,5 erreicht-wurde (etwa 150 ml) beendet. Die angesäuerte Mischung wurde zweimal mit einem gleichen Volumen von Diäthyläther extrahiert. In dem ätherischen Extrakt waren 158 mg (67%) PGE₁ enthalten.

Ohne Zusatz von Propylgallat zu der Inkubationsmischung wurden 54 mg (23 %) PGE erhalten, wäh- rend das Weglassen von Glutathion zu einer Ausbeute von nur 19 mg (8%) führte.

Beispiel 2

Ein Stück Zwölffingerdarm (65 g Feuchtgewicht) eines männlichen Schafes wurde in Stücke geschnitten und homogenisiert in einem Hochgeschwindigkeitshomogenisator mit 200 ml 0,01 m Phosphatpuffer (pH-Wert = 8,0).

Das Homogenisat wurde zentrifugiert während 10 Minuten bei 4000 g. Die trübe überstehende Flüssigkeit wurde zentrifugiert während 60 Minuten bei 100 000 g. Der Niederschlag, der bei der zweiten Zentrifugierung erhalten wurde, wurde suspendiert in 12 ml 0,1 m Phosphat (pH-Wert = 8,0). Diese Zubereitung wurde verwendet für die folgenden Inkubationen ; sie enthielt 30 mg Protein je Milliliter.

Ein Teil der Enzymlösung (1,5 ml) wurde 10 Minuten mit 95 Mikrogramm (l-¹⁴C)-Homo-y-Linolensäure (95 OOOcpm) in 1 ml 0,2 m Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan · HCl (pH-Wert = 8,0) bei 30° C inkubiert (a).

In einer zweiten Inkubation (b) wurde 1 Mikromol (0,3 mg) Glutathion zugesetzt, und die dritte Inkubation (c) wurde durchgeführt in Anwesenheit von 1 Mikromol Glutathion und 0,5 Mikromol (0,1 mg) Propylgallat.

Nach der Inkubation wurden die Mischungen angesäuert und mit Äther extrahiert. Nach Zusatz von 182 Mikrogramm PEG₁ und 100 Mikrogramm PGF_la wurden die ätherischen Extrakte zur Trockne eingedampft. Das Material wurde über einer dünnen Schicht von Kieselsäuregel mit dem Lösungsmittelsystem Chloroform - Methanol - Essigsäure - Wasser (90: 6 :1:1, Volumen) als Eluierungsmittel chromatographiert. Die Lage der Prostaglandine wurde bestimmt, indem das Chromatogramm Joddämpfen ausgesetzt wurde und die das Prostaglandin E bzw. F enthaltenden Zonen nach Verdampfung des Jods abgekratzt wurden. Das PGE₁ wurde aus dem Kieselsäuregel mit Methanol eluiert und mit 0,5 m methanolischer KOH 10 Minuten bei 20° C behandelt. Das so gebildete Entwässerungsprodukt wurde durch Dünnschichtchromatographie über Kieselsäuregel mit dem Lösungsmittel Äther—Essigsäure (100: 2) isoliert. Ein Teil wurde auf Radioaktivität getestet, in einem anderen Teil wurde die Extinktion bei 280 Millimikron gemessen. Es wurde berechnet, daß das durch die Biosynthese gebildete PGE₁ folgende Radioaktivität besaß:

mal innerhalb von 10 Minuten bei 4000 g zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit 1 Stunde bei 100000 g zentrifugiert. Der Niederschlag der letzten Zentrifugierung wurde dann gefriergetrocknet und ergab die nachstehend verwendete Enzymzubereitung. Sämtliche vorstehenden Verfahrensschritte wurden bei einer Temperatur von 0 bis 4° C durchgeführt.

Es wurden sodann im Doppelversuch Inkubationsmischungen hergestellt, die 150 μg (0,5 μΐηοΐ) Gesamt- cis-Eicosa-8, 11,14-triensäure in 3 ml 0,2molarem Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-Puffer (pH-Wert 8,0), ferner 4 mg der Enzymzubereitung und eine geeignete Menge an Glutathion oder, zum Vergleich, an einem anderen möglichen Kofaktor, wie in der nachstehenden Tabelle angegeben, enthielten. Diese Inkubationsmischungen wurden 10 Minuten bei 30° C inkubiert und sodann mit 0,2molarer Zitronensäurelösung auf einen pH-Wert von 3 bis 4 eingestellt. Jedes Produkt wurde dann durch zweifache Extraktion mit dem gleichen Volumen Äther isoliert, der Extrakt wurde zur Trockne eingedampft und der Rückstand in 1 ml Methanol gelöst. Ein aliquoter Teil dieser Lösung wurde mit Methanol auf 2,5 ml verdünnt, 0,5 ml 3molare methanolische Kaliumhydroxydlösung wurde zugesetzt, und die Zunahme der Lichtabsorption bei 278 nm des Musters bei 20° C verfolgt, bis die Absorption konstant blieb (etwa 8 Minuten). Die Menge an vorhandenem PGE₁ wurde dann aus der beobachteten Absorption berechnet.

Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle zusammengefaßt:

Tabelle

Inkubation	Zusatz	Entladungen pro Minute
a b C	Gluthation Glutathion + Propylgallat	167 2620 2975

Dünnschichtchromatographie auf mit Silbernitrat imprägniertem Kieselsäuregel verursachte keine weitere Abnahme der spezifischen Radioaktivität des dehydratisierten PGE₁. Bei der Inkubation mit Glutathion wurden also 2,8% der Homo-y-Linolensäure in PGE₁ umgewandelt.

Beispiel 3

Dieses Beispiel zeigt die Bedeutung von Glutathion hinsichtlich der Begünstigung der Biosynthese von PGE₁ im Vergleich zu einer Reihe anderer möglicher Kofaktoren.

Schaf-Samendrüsen wurden von anhaftendem Fett und Bindegewebe befreit und im gleichen Volumen eines 0,05molaren Kaliumphosphatpuffers, pH-Wert = 7,5, bei 0 bis 4° C homogenisiert. Der entstandene Brei wurde weiter mit zwei Volumen der gleichen Pufferlösung verdünnt, die erhaltene Suspension zwei-

	Menge	μηιοί	Ausbeute	12
35 Zugesetzter Stoff	mg		an P Il	11
		4,1		13
ohne Zusatzstoff	0,5	0,15	Doppelversuch
Nikotinsäureamid ....	2,0		10	11
⁴⁰ Cyptochrom C		6,4	10
ATP (Natriumadeno-	4,0		11
sintriphosphat)				11
NAD⁺ (Coenzym I,		2,3	11
Diphosphopyridin-	1,5			12
⁴^ nucleotid)		0,95
FAD (Flavinadenin-	0,75		10	12
dinucleotid)		0,11		60
ACTH (Adrenocortico-	0,5	2,4	10
trophisches Hormon)	0,75
⁵⁰ Glutathion	12
	57

Die Ergebnisse zeigen, daß Glutathion etwa die fünffache Ausbeutesteigerung gegenüber nur geringfügigen Steigerungen durch die anderen Zusatzstoffe bewirkt.

Beispiel 4

Dieses Beispiel zeigt die Bedeutung von Glutathion hinsichtlich der Begünstigung der Biosynthese von PGE₂ im Vergleich zu einer Reihe anderer möglicher Kofaktoien.

100 μg Arachidonsäure wurden in 2 ml 0,2molarem Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-Puffer (pH-Wert 8,0) gelöst und 5 Minuten bei 30° C mit 1 mg der im Beispiel 3 beschriebenen Enzymzubereitung inkubiert, wobei geeignete Mengen an ATP, Glutathion und anderen Substanzen, wie aus der nachstehenden Tabelle ersichtlich, beigefügt wurden.

Die gebildete PGE₂-Menge wurde, wie vorstehend beschrieben, bestimmt.

Zugesetzter Stoff Ausbeute an PGE₂ ^g)

Ohne Zusatzstoff 10, 15

ΑΤΡ(ΙΟμηιοΙ) 13

Ferrosulfat (1 μπιοί) 11

Albumin (3 mg) 14

NADPH (Triphospho-pyridinnucleotid)

(Ιμίηοΐ) 15

Glutathion (10 μπιοί) 26, 29

Die Ergebnisse zeigen auch hier, daß weder ATP noch andere mögliche Cofaktoren eine nennenswerte Ausbeutesteigerung an PGE₂ bewirkten, während durch Glutathion die Ausbeute um mehr als das Doppelte gesteigert wurde.

Beispiel5

Dieses Beispiel erläutert die Umwandlung weiterer Carbonsäure in Prostaglandine.

Schaf-Samendrüsen (350 g) wurde in einer 0,lmolaren Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 8 zerkleinert. Die Mischung wurde zentrifugiert (4000 g), nitriert und nochmals zentrifugiert (55 000 g). Der Niederschlag wurde nach dem Waschen und Trocknen lyophilisiert; Ausbeute 7 g. Die teilchenförmige Enzymfraktion, die so erhalten wurde und die praktisch rein von endogenen Prostaglandinen war, wurde für die nachstehenden Versuche verwendet.

100 μg Fettsäure, 0,65 μπιοί Glutathion und 0,55 μΐηοΐ Hydrochinon wurden in einem Proberöhrchen gelöst welches 1 ml 0,2molaren Tris-(hydroxymethyl)-amino methan-HCl-Puffer, pH-Wert 8, enthielt. Das Röhr chen wurde in ein Wasserbad von 37° C gebracht, um es wurden 6 mg der teilchenförmigen Enzymfraktioi zugesetzt. (2 mg Protein suspendiert in 1 ml 0,2mo larem Tris - (hydroxymethyl) - aminomethan - HCl - Puf fer). Nach einer Inkubationszeit" von 30 Minuter wurde die Reaktionsmischung arfgesäuert, mit Äthe:

ίο extrahiert und zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in Methanol (1 ml) gelöst, und in 0,2 m dieser Lösung wurde der Prostaglandingehalt au: Grund der Absorptionszunahme bei 278 nm nach Zugabe von Alkali bestimmt. Unter den beschriebener Bedingungen war bei allen Reaktionen eine optimale Umwandlung nach einer Inkibationszeit von 30 Minuten erreicht.

Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle zusammengefaßt:

Gebildetes Prostaglandin

Fettsäure (Gesamt-cis-Isomere) (E-Typ) %

Octadeca-3,6,9,12-tetraensäure 11

Nonadeca-7,10,13-triensäure 60

Nonadeca-4,7,10,13-tetraensäure .... 41

Eicosa-7,10,13-triensäure 18

Eicosa-8,ll,14-triensäure 68

Eicosa-5,8,ll,14-tetraensäure 71

Heneicosa-9,12,15-triensäure 36

Heneicosa-6,9,12,15-tetraensäure .... 25

Docosa-7,10,13,16-tetraensäure 24

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von Prostaglandinen, wobei eine Gesamt-sis-Fettsäure der allgemeinen Formel

CH₃ — (CH₂)_K — (CH = CH — CHa)₃, — (CH₂)_a — COOH

in welcher η eine Zahl zwischen O und 7, ρ eine Zahl zwischen 2 und 6 und q eine Zahl zwischen O und 12 darstellen, und die Gesamtzahl der Kohlenstoffatome in dem Molekül 18 bis 22, vorzugsweise 20, beträgt, mit tierischem Gewebe aus sekundären Geschlechtsdrüsen, Thymusdrüsen, Iris, Lungen, Eingeweiden, Pankreas, Nebennieren oder Gehirn, oder aus solchem Gewebe hergestellten Zubereitungen in Anwesenheit von Sauerstoff bei einem pH-Wert des Umsetzungsmediums von 7 bis 9 und bei einer Temperatur von 10 bis 6O⁰C behandelt wird, gemäß Hauptpätent P 17 93 623, dadurch gekennzeichnet, daß dem Umsetzungsmedium Glutathion (γ- L - Glutamyl - l - cysteinylglycin) zugesetzt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Ausgangsfettsäure Gesamt-cis-Eicosan-8,ll,14-triensäure oder Gesamt-cis-Eicosan-5,8,ll,14-tetraensäure verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Gewebe Samendrüsen von Schafen verwendet werden.