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CH

bzw. deren pharmakologisch verträgliche Alkali-, Erdalkali-, Ammonium-, Tetramethylammonium- bzw.. Benzyltrimethylammoniumsalze.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Herstellung von neuen Derivaten der Prostancarbonsäure, die der Formel .

CH₃-

CH-, CH-> CH-? CHt H

19

18

17

15

14

13

CH₂-CH₂-Ch₂-CH₂-CH₂-CH₂-COOH

/. 7 6 5 4 3 2 1

12

H₂Cn

\ ¹⁰ / "

- . ■ rCHi .

- . ■ ■ ι

entspricht. In dieser Formel befinden sich die Wasserstoffatome an den C-8- und C-12-Atomen in der transKonfiguration (vgl. hierzu B e r g s t r ö m u. a., J. Biol. Chem., Bd. 238, S. 3555 bis 3564 [1963] und Ho r t ο n, Experientia, Bd. 21, S. 113 [1965]). .

Sie bezieht sich auf 15-Hydroxy-9-oxoprosta-10,13-trans-diencarbonsäure der Formel

OH

CH₃(CH₂)₄CH

15 \

C = C H

/ 13 \ i

CH

II

H (CH₂)₆COOH

9C=O

CH'

bzw. deren pharmakologisch verträgliche Alkali-, Erdalkali-, Ammonium-, Tetramethylammonium- bzw. Benzyltrimethylammoniumsalze. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Alkalisalz um ein Lithium-, Natrium- oder Kaliumsalz und bei dem Erdalkalisalz um ein Magnesium-, Calcium-, Strontium- oder Bariumsalz.

Die Prostancarbonsäure der Formel II sowie deren vorstehend genannte Salze zeichnen sich durch eine blutdrucksenkende Wirkung im normotonischen Zustand aus, wie durch Versuche an Hunden nach der Methode von L e e u. a., Circulation Res., Bd. 13, S. 359 (1963), festgestellt werden konnte. Den betäubten Hunden wurde der Nervus vagus entfernt; anschließend wurden die Hunde mit Ι,Γ-Pentamethylenbis-[l-methylpyrrolidin] behandelt (AVPT-Hunde). Das zu untersuchende Material wurde in in Äthylalkohol, der im Verhältnis 1 :10 mit physiologischer Kochsalzlösung oder 5%iger Dextroselösung verdünnt wurde, intravenös injiziert. Es wurden folgende Versuchsergebnisse im Vergleich zu PGE₁ und PGE-, erhalten:

1. Blutdrucksenkende Wirkung beim Hund

PGE₁	PGE₂	HOPDC
1,0	0,71 (CJ 0,46 bis 1,13)*)	2,7 (CJ 1,5 bis 4,1)*)

2. Stimulierende Wirkung auf die glatte Muskulatur

beim Kaninchen

PGE₁	PGE₂	PGE₃	HOPDC
1,0	1,5 (±0,5)	0,99 (±0,9)	0,01 (CJO₅OOObIsO₁OIo)*)

*) CJ = 95% der Ergebnisse liegen innerhalb des angegebenen Bereichs.

Wegen der vorstehend beschriebenen Wirkung sind das vorstehend beschriebene Prostancarbonsäurederivat der Formel II sowie dessen Salze wertvolle therapeutische Mittel zur Behandlung von Blut-■ hochdruck, zur Normalisierung des Lipidgehaltes des Serums und damit zur Verminderung der Gefahren bei ischaemischen Herzkrankheiten. Weiterhin können die Verbindungen zur Behandlung von Störungen des Zentralnervensystems bei Säugetieren und Menschen dienen. Die Verbindungen können durch intravenöse Infusion in Form steriler physiologischer Salzlösungen mit einer Geschwindigkeit von etwa 0,01 bis etwa 10, vorzugsweise etwa 0,1 bis 0,2 Mikrogramm pro Kilogramm Körpergewicht pro Minute zugeführt werden.

Es ist bekannt, daß andere Prostancarbonsäurederivate bei intravenöser Injektion den arteriellen Blutdruck senken; dies gilt insbesondere für die als Prostaglandine bekannten Substanzen, z. B. PGE₁, PGE₂ und PGE₃, vgl. hierzu H or ton, loc. cit. Die zuletzt genannten Substanzen haben jedoch auch eine starke stimulierende Wirkung auf die glatte Muskulatur, z. B. auf die glatte Muskulatur des Magen-Darm-Traktes bei Säugetieren, und sind Antagonisten der epinephrininduzierten Mobilisierung der freien Fettsäuren. Überraschender- und unerwarteterweise haben die neue Verbindung der Formel II sowie deren Salze eine weitaus geringere stimulierende Wirkung auf die glatte Muskulatur als beispielsweise PGE₁, wie beispielsweise an Muskelstreifen aus dem Magen-Darm-Trakt von Meerschweinchen und Kaninchen gezeigt werden konnte. Auch ihre antagonistische Wirkung auf die epinephrininduzierte Mobilisierung der freien Fettsäuren ist geringer als die von PGE₁. Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind daher wertvolle Therapeutika, die sich durch geringere Nebenwirkungen auszeichnen als die bisher Tür denselben Zweck bekannten Verbindungen, z. B. PGE₁.

Die neuen Verbindungen der Formel II sind weiterhin dadurch wertvoll, daß sie Laboratoriumstieren, vorzugsweise Ratten, verabreicht werden können, so daß man Tiere züchten kann, die die Verbindungen in großen Mengen enthalten. Derartige Tiere können dann als Versuchstiere bei der Suche nach und der Prüfung von Verbindungen dienen, die Antagonisten der verabreichten Verbindungen sind. Die zuletzt genannten antagonistischen Verbindungen können zur Umkehrung der Wirkungen von versehentlichen Uberdosen der extrem wirksamen Verbindung der Formel II bzw. deren genannten Salzen und zur Behandlung von allergischen Zuständen dienen. Zu diesem Zweck verabreicht man die zu prüfende Verbindung der Formel II oder ein entsprechendes Salz dem Versuchstier vorzugsweise durch kontinuierliche intravenöse Infusion, wobei die Verbindung in steriler Salzlösung vorliegt. Die Zuführung erfolgt mit einer Geschwindigkeit von etwa 0,01 bis 10, vorzugsweise 0,05 bis 0,2 Mikrogramm pro Kilogramm Tiergewicht pro Minute, bis die gewünschte Konzentration der Verbindung erreicht oder die gewünschte Reaktion in dem Tier beobachtet worden ist. Die Infusion kann dann weitergeführt oder beendet werden, je nach dem Versuch, der mit dem Tier durchgeführt werden soll.

Neben den vorstehend genannten Verwendungszwecken kann die im wesentlichen reine Verbindung der Formel II auch als Standard-Reagenz bei der Untersuchung von Tiergeweben oder Pflanzengeweben auf die mögliche Anwesenheit an den neuen Verbindungen verwendet werden.

Es ist bekannt, daß Prostancarbonsäurederivate, insbesondere die Prostaglandine, in vielen Arten von Tiergeweben vorhanden sind. (vgl. H ort on, loc. cit., und Samuelsson, Angew. Chem. Intern. Ed. Eng, Bd. 4, S. 410 [1965]). Es ist weiterhin bekannt, daß verschiedene ungesättigte alicyclische Carbonsäuren durch Einwirkung von Enzymsystemen, die in bestimmten Tiergeweben, z. B. den Geweben der Vesiculärdrüsen von Schafen und der Lungen von Meerschweinchen vorhanden sind, in Prostaglandine umgewandelt werden können (vgl. hierzu Samuelsson loc. cit. und K 1 e η b e r g u. a., Acta Chem. Scand, Bd. 19, S. 534 [1965]; S a m u e 1 ss on, J. Am. Chem. Soc, Bd. 87, S. 3011 [1965]; R y h a g e u. a., Biochem. Biophys. Res. Commun., Bd. 19, S. 279 [1965]; Nugteren u.a., Biochim. Biophys. Acta, Bd. 98, S. 654 [1965], und Wa 11 a c h, Life Sciences, Bd. 4, S. 361 [1965]). So kann beispielsweise Gesamt -eis-8,11,14- Eicosatriencarbonsäure in PGE₁, Gesamt-cis-Eicosa-S&lljM-tetraencarbonsäure in PGE₂ und Gesamt-cis-Eicosa-5,8,11, 14,17-Pentaencarbonsäure in PGE₃ umgewandelt werden. Bei diesen enzymatischen Umwandlungen spielen Oxygenase- und Oxidaseenzyme eine entscheidende Rolle (vgl. hierzu Samuelsson, J. Am. Chem. Soc, Bd. 87, S. 3011 [1965]). Gesamtgewebebreie, zentrifugierte Gewebebreie und Acetonpulver sind als Ausgangsmaterialien für die notwendigen Enzymsysteme verwendet worden.

überraschenderweise wurde jetzt gefunden, daß die neue, reine lS-Hydroxy-^-oxoprosta-lO.trans-13-diencarbonsäure (HOPDC) aus der Mischung abgetrennt werden kann, die durch aerobe Inkubation von Gesamt-cis-SJl.M-Eicosatriencarbonsäure (Homo-y-linolensäure) oder einem geeigneten Salz derselben in einem wäßrigen Medium, welches die Oxygenase- und Oxidaseenzyme aus Tiergeweben, in denen auch endogene PGE₁ vorhanden ist, enthält, erhalten worden ist.

PGE₁ ist die Abkürzung für Prostaglandin E,, welches auch als 11a, lS-Dihydroxy^-oxoprostatrans-13-en-carbonsäure bekannt ist (vgl. hierzu Hort on, loc. cit. Tiergewebe, welches endogene PGE₁ enthält, ist ein solches, in welchem die PGE₁ gebildet worden ist, während das Gewebe Teil eines intakten Lebewesens ist. Gewebe, in welches PGE₁

nachträglich eingebracht worden ist, fällt nicht unter diesen Begriff, es sei denn, das zuletzt genannte Gewebe produziert ebenfalls PGE₁ (oder ist zu dieser Produktion fähig), wenn es Teil eines intakten Tieres ist. Praktisch reine 15-Hydroxy-9-oxoprosta-10,trans-13-diencarbonsäure ist als eine Säure definiert, die frei von Antigenen, Pyrogenen, Geweberückständen, Wasser und anderen üblichen Verdünnungsmitteln sowie praktisch frei von PGE₁ sowie anderen Substanzen, die die glatte Muskulatur des Magen-Darm-Traktes von Säugetieren stimulieren und als Antagonisten der epinephrininduzierten Mobilisierung der freien Fettsäuren in vitro und in Versuchstieren wirken, ist (vgl. hierzu H ο r t ο n, loc. cit.

Wie weiter oben bereits angedeutet, ist es bekannt, daß PGE₁ durch aerobe Inkubation von Gesamtcis-8,1 lrl4,Eicosatriencarbonsäure oder deren geeigneten Salzen in einem wäßrigen Medium, welches Oxygenase-. und Oxidaseenzyme enthält, die in Tiergeweben vorhanden sind, in welchen sich auch endogene PGE₁ ■ befindet, hergestellt werden kann. Es ist nicht sicher, ob HOPDC direkt aus der Gesamtcis-SjlljM-Eicosatriencarbonsäure gebildet wird, ob die Diencarbonsäure durch enzymatische oder nicht enzymatische Dehydratisierung von PGE₁ (entweder während der Inkubation oder während einer oder mehrerer der Isolierungsstufen) entsteht oder ob ihre Bildung auf noch einem anderen Weg erfolgt. Es ist für das Wesen der vorliegenden Erfindung jedoch ohne Bedeutung, in welcher Weise die HOPDC gebildet wird. Vielmehr ist es als neu und überraschend anzusehen, daß die wertvolle Diencarbonsäure in praktisch reiner Form aus der durch aerobe Inkubation gewonnene Mischung isoliert werden kann. Beliebige bekannte Methoden zur enzymatischen Herstellung und Isolierung von PGE^ aus Gesamtcis-SJljH-Eicosatriencarbonsäure oder deren Salzen, z. B. die in den vorstehend aufgeführten Literaturstellen beschriebenen, können zur Herstellung der Gemische verwendet werden, aus denen die reine HOPDC abgetrennt wird.

Ausgangsmaterialien für. die Oxygenase- und Oxidaseenzyme, die zur Herstellung der Gemische für das erfindungsgemäße Verfahren notwendig sind, sind beispielsweise zerkleinerte Gewebe, Gesamtgewebebreie, zentrifugierte Gewebebreie sowie die in hochtourigen Zentrifugen gewonnenen Rückstände. Alls genannten Arbeitsweisen sind aus der Literatur bekannt. Weiterhin ist es möglich, die Enzyme in unterschiedlicher Reinheit aus Geweben zu isolieren, z. B. als Acetonpulver; auch diese Arbeitsweise ist aus der Literatur bekannt (vgl. hierzu N e i 1 a η d s u. a., Outlines of Enzyme Chemistry, 2. Auflage, Wiley&Sons, Ine, New York, S. 42 bis 65 [1958]; S c h w i m m e r u. a. in Nord, Advances in Enzymology, Bd. 14, Interscience Publishers, Inc, New York, S. 375 bis 409 [1953]; Um breit u.a., Manometric Techniques, 4. Auflage, Burgess Publishing Co, S. 114 bis 176 [1964]). Die isolierten Enzyme können in wäßrigem Medium an Stelle von Gewebebreien verwendet werden, z. B. in der von Wallach, loc. cit. beschriebenen Weise.

Wie aus der Literatur bekannt, wird die Umsetzung der Oxygenase und Oxidaseenzyme mit der Gesamt-cis-8,11,14-Eicosatriencarbonsäure oder deren geeigneten Salzen vorzugsweise in einem wäßrigen, gepufferten Medium durchgeführt; der pH-Wert soll schwach basisch sein, z. B. zwischen 7 und etwa 8,5 liegen. Da für die gewünschte Umwandlung molekularer Sauerstoff notwendig ist, muß die Reaktion unter aeroben Bedingungen durchgeführt werden, wobei die Zuführung von Sauerstoff zum Reaktionsgemisch in beliebiger Weise erfolgen kann.

Gesamt-cis-8,11,14-Eicosatriencarbonsäure ist beispielsweise bei Korn, J. Biol. Chem, Bd. 238, S. 3584 (1963), beschrieben. Man kann die freie Säure oder bestimmte Salze derselben, z. B. die Natrium-, Kalium-, Calcium- oder Ammoniumsalze verwenden. Die zu verwendende Säuremenge hängt von der verwendeten Oxygenase- und Oxidaseenzymmenge ab. Auch hier kann man sich bezüglich der Mengenverhältnisse an die Angaben der Literatur halten.

Die Umsetzungstemperatur entspricht vorzugsweise der normalen Säugetierkörpertemperatur, d. h, sie kann etwa im Bereich von 35 bis 40°C liegen; Gegebenenfalls ist es möglich, bei mäßig erhöhten oder tieferen Temperaturen zu arbeiten. Die Reaktionsdauer hängt von der Art und/oder der Reinheit der Enzyme, den Mengenverhältnissen von Enzymen zu Säure, der Reaktionstemperatur und der Menge f des vorhandenen Sauerstoffes ab. Im allgemeinen ~ reichen Umsetzungszeiten von etwa 30 Minuten bis zu etwa 24 Stunden aus. Der Ablauf der Reaktion kann verfolgt werden, indem man kleine Proben aus dem Reaktionsgemisch entnimmt und die Mengen an PGE₁ und HOPDC bestimmt. Die zuletzt genannte Verbindung ist weniger polar als PGE₁ und kann von der ebenfalls im Reaktionsgemisch vorhandenen Säure z. B. durch Dünnschichtchromatographie auf Kieselsäure unter Verwendung eines Gemisches von Chloroform-Methanol-Essigsäure im Volumverhältnis von 90: 5 : 5 getrennt werden. Die PGE₁ und HOPDC können auf dem Dünnschichtchromatogramm leicht nach Trocknen der Platte, Besprühen mit einer Vanillin-Phosphorsäure-Mischung und lOminütiges Erhitzen auf 110°C festgestellt werden. An den Stellen, an denen sich die Verbindungen befinden, erscheinen dunkle Flecken.

Für die vorstehende Prüfmethode sowie für die anschließende Isolierung können PGE₁ und HOPDC von den Enzymen und dem wäßrigen Inkubations- _{ medium 'in derselben Weise abgetrennt werden, wie ^v dies für die Isolierung von PGE₁ in der weiter oben angeführten Literatur beschrieben ist. Da die Inkubationsmischung durch Zugabe eines Puffers vorzugsweise schwach basisch gehalten wird, liegen erhebliche Anteile der PGE₁ und der HOPDC in der Reaktionsmischung als Anionen vor. Das Reaktionsgemisch wird zur Umwandlung der Anionen in die freien Carbonsäuren vor der Isolierung angesäuert. Die gewünschte HOPDC wird wahrscheinlich während des Ansäuerns durch Dehydratisierung aus PGE₁ gebildet.

Zur Trennung der PGE₁ und der HOPDC und zur weiteren Reinigung der letzteren kann man in üblicher Weise vorgehen. Beispielsweise kann man die Methode der Dünnschichtchromatographie an Kieselsäure anwenden, die von Green u. a, J. Lipid Research, Bd. 5, S. 117 (1964), für die verschiedenen Prostaglandine beschrieben worden ist; man arbeitet mit einem Lösungsmittelgemisch der weiter oben bereits beschriebenen Art. Weiterhin kann die Trennung durch Verteilungschromatographie oder Verteilungschromatographie mit umgekehrten Phasen durchgeführt werden, z. B. in der eben-

falls für die verschiedenen Prostaglandine von Samuelsson, J. Biol. Chem., Bd. 238, S. 3229 (1963), beschriebenen Weise. Hinsichtlich des chromatographischen Verhaltens entspricht die erfindungsgemäß hergestellte freie Säure weitgehend, wenn auch nicht völlig den bekannten Prostaglandinen, insbesondere PGE₁, PGE₂ und PGE₃. Zur Isolierung, Reinigung und Bestimmung der erfindungsgemäß hergestellten freien Säure können die auch für Prostaglandine üblichen Methoden angewandt werden.

Besonders günstig ist, es, die erfindungsgemäße HOPDC von PGE₁ durch fraktionierte Kristallisation aus einem geeigneten Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch zu trennen. Die Abtrennung der PGE₁ in kristalliner Form aus Mischungen mit der neuen Verbindung der Formel II gemäß vorliegender Erfindung ist verhältnismäßig einfach. Die zuletzt genannte Substanz liegt bei Raumtemperatur als öl vor; sie ist infolgedessen in den zur Kristallisation verwendeten Lösungsmitteln stärker löslich und sammelt sich im Verlauf der Umkristallisation in den Mutterlaugen an. Die ölige HOPDC, die man auf diese Weise erhält, ist praktisch frei von PGE₁. Zur Gewinnung völlig reiner HOPDC kombiniert man die vorstehend genannten Methoden der fraktionierten Kristallisation, der Chromatographie und der Lösungsmittelextraktion, wie nachstehend noch näher erläutert werden wird.

Die erfindungsgemäß hergestellte reine HOPDC kann anschließend in üblicher Weise mit den genannten pharmakologisch verträglichen Kationen in Salze umgewandelt werden. Die Neutralisation wird mit den entsprechenden Mengen der geeigneten anorganischen oder organischen Base (vgl. die weiter oben genannten Kationen) durchgeführt. Bei der Herstellung der Salze müssen selbstverständlich deren Löslichkeitseigenschaften in Rechnung gesetzt werden. Im Falle anorganischer Salze ist es günstig, das Prostancarbonsäurederivat in Wasser zu lösen, welches in stöchiometrischer Menge das gewünschte Kation in Form des Hydroxids, Carbonats oder Bicarbonats enthält. Verwendet man Natriumhydroxid, Natriumcarbonat oder Natriumbicarbonat, so erhält man das Natriumsalz des Prostancarbonsäurederivats der Formel II. Durch Verdampfen des Wassers oder Zugabe eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels von mäßiger Polarität, z. B. eines niederen Alkanols oder niederen Alkanons, erhält man das anorganische Salz in fester Form.

Soll ein quaternäres Ammoniumsalz hergestellt werden, so vermischt man das Prostancarbonsäurederivat mit der stöchiometrischen Menge des entsprechenden quaternären Ammoniumhydroxids in wäßriger Lösung und dampft anschließend das Wasser ab.

Beispiel

Das Ausgangsmaterial wird wie folgt hergestellt: Samenblasen von jungen Schafböcken (5 kg) wurden in gefrorenem Zustand in einem Fleischwolf gemahlen. Die so entstandene Gewebemasse wurde in 500-g-Ansätzen in Waring-Mischern aus rostfreiem Stahl mit einem Fassungsvermögen von etwa 3,8 1 jeweils 3 Minuten homogenisiert, wobei insgesamt 5 1 0,1 normaler wäßriger Ammoniumchlorid-Pufferlösung verwendet wurden (pH-Wert = 8,5).

Eine Lösung von Gesamt-cis-SJ^H-Eicosatriencarbonsäure (5,0 g) in 50 ml Äthanol wurde langsam zu 5 1 derselben O.lnormalen wäßrigen Ammoniumchlorid-Pufferlösung unter lebhaftem Rühren gegeben. Die auf diese Weise erhaltene Emulsion wurde anschließend mit dem zuerst hergestellten Gesamtdrüsenhomogenat vermischt; das so gewonnene Gemisch wurde durch Zugabe von 6n-Ammoniumhydroxidlösung auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt und bei 37,5°C 1 Stunde unter kontinuierlichem Rühren belüftet.

Am Schluß der Inkubationsperiode wurde der pH-Wert der Mischung durch Zugabe von 6n-Chlorwasserstoffsäure auf 7,5 eingestellt. Man setzte weiterhin unter Rühren Aceton (45 1) zu und ließ die Mischung 1 Stunde bei etwa O⁰C stehen. Danach erfolgte auf einem Saugfilter eine Trennung in einen Filterkuchen und ein erstes Filtrat. Der Filterkuchen wurde in 4 1 einer Mischung aus Aceton und Wasser (Volumenverhältnis 3:1) suspendiert; die Suspension wurde wiederum filtriert. Das so gewonnene erste und zweite Filtrat wurden vereinigt und zweimal mit je 27,5 Hexan extrahiert.

Die extrahierten Acetonfiltrate wurden bei vermindertem Druck und einer Temperatur unter 40° C bis auf ein Volumen von 4100 ml eingedampft; das Konzentrat wurde mit Chlorwasserstoffsäure auf einen pH-Wert von 2,8 eingestellt. Die so gewonnene saure Lösung wurde nacheinander zweimal mit je 2 1 und dann zweimal mit je 1 1 Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten Dichlormethan-Extrakte wurden unter vermindertem Druck bis auf ein Volumen von 2,5 1 eingedampft; das Konzentrat wurde nacheinander einmal mit 2 1 und zweimal mit je 1 1 einer 0,2 n-Natriumphosphat-Pufferlösung (pH-Wert 8,0) extrahiert.

Die vereinigten Pufferextrakte wurden mit 400 ml Dichlormethan gewaschen, danach durch Zugabe von konzentrierter Chlorwasserstoffsäure auf einen pH-Wert von 2,9 eingestellt und schließlich nacheinander einmal mit 1 1 und dreimal mit je 500 ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten Dichlormethan-Extrakte wurden nacheinander mit 450, 300 und 500 ml Wasser gewaschen. Durch Eindampfen der so gewonnenen Dichlormethanlösung unter vermindertem Druck erhielt man 2,84 g eines Öls. Dieses öl wurde in 10 ml Dichlormethan gelöst. Die sich nach und nach abscheidende kristalline PGE₁ wurde abfiltriert. Das Filtrat wurde eingedampft, der verbleibende ölige Rückstand wurde in etwa 3 ml Dichlormethan gelöst. Hexan wurde zugesetzt, bis die Lösung schwach wolkig wurde. Die sich abscheidende weitere PGE₁ wurde abfiltriert.

Die Dichlormethan-Hexan-Mutterlauge wurde mit weiterer Mutterlauge vereinigt, die in derselben Weise wie vorstehend beschrieben aus 5 kg Schafsamenblasen und 5,0 g Gesamt-cis-SjlLM-Eicosatriencarbonsäure erhalten worden war. Zu diesen beiden Mutterlaugen gab man eine Äthylacetat-Hexan-Mutterlauge, die wie folgt erhalten worden war: die vier in der vorstehend beschriebenen Weise erhaltenen Mengen an kristallinem PGE₁ wurden vereinigt und in 10 ml Dichlormethan gelöst. Die sich abscheidenden Kristalle wurden abfiltriert; das Filtrat wurde zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in Äthylacetat gelöst; die Lösung wurde bis zur Trübung mit Hexan versetzt. Die sich abscheidenden Kristalle wurden abfiltriert; die weiter oben erwähnte Äthylacetat-Hexan-Mutterlauge blieb zurück.

209 517/332

9 10

Die drei vereinigten Mutterlaugen wurden ein- Essigsäure (90:5:5) wie eine einzige Verbindung,

gedampft; der Rückstand wurde in Benzol^ welches Der Rückstand wurde durch Lösen in 30 ml Di-

1% Äthylacetat enthielt, gelöst. Diese Lösung gab chlormethan und dreimaliges Extrahieren der Lösung

man über eine Kolonne mit einer Größe von mit je 10 ml Wasser weitergereinigt. Die gelbgefärbten

27 x 350 mm, die mit mit Säure gewaschenem Silikagel 5 Wasserextrakte (pH-Wert 6,5) wurden vereinigt und

gefüllt war. Die Kolonne wurde nacheinander mit mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure auf einen pH-

500 ml Benzol, welches 1% Äthylacetat enthielt, Wert von 3,5 angesäuert. Die saure Lösung wurde

2 1 Benzol, welches 20% Äthylacetat enthielt, und dreimal mit Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten

2 1 Benzol, welches 40% Äthylacetat enthielt, eluiert. Dichlormetjianlösungen wurden getrocknet und an-

Das Eluat, welches bei der Behandlung mit der Benzol- io schließend zur Trockne eingedampft; der verbleibende lösung, die 40% Äthylacetat enthielt, erhalten .worden^ Rückstand 'wurde in 15 ml warmem absolutem Ätha-

war, wurde zur Trockne eingedampft; auj" diese nol gelöst. DieseLösung wurde dann etwa 16 Stunden Weise erhielt man einen Rückstand in einer Menge. ■ auf *—20⁰C abgekühlt. Eine kleine Menge Rück-

von 0,26 g. Dieser wurde nun wie folgt auf die erfin- stand wurde abfiltriert und auf dem Filter fünfmal

dungsgemäße HOPDC aufgearbeitet: 15 mit je 3 ml absolutem Äthanol gewaschen. Das Filtrat

Ein Teil dieses Rückstandes (0,22 g) wurde in und die Waschlösungen wurden vereinigt, einge-

Hexan gelöst und über eine Kolonne (14 χ 360 mm), dampft und getrocknet. Man erhielt auf diese Weise

die mit Säure gewaschenem Kieselsäuregel gefüllt 6,6 mg praktisch reiner HOPDC in Form eines Öls.

war, gegeben. Die Kolonne wurde nacheinander Der stimulierende Effekt bei dieser Substanz auf

mit 500 ml Hexan, 500 ml Hexan, welches 1% Äthyl- 20 die glatte Muskulatur betrug nur etwa das 0,01fache

acetat enthielt, 500 ml Hexan, welches 5% Äthyl- von PGE₁; der Antagonismus der epinephrininduzier-

acetat enthielt, 500 ml Hexan, welches 10% Äthyl- ten Mobilisierung der freien Fettsäuren betrug das

acetat enthielt, 6000 ml Hexan, welches 20% Äthyl- etwa 0,005fache, verglichen mit PGE₁.

acetat enthielt und 12000 ml Hexan, welches 30% IR (Hauptbanden in Dichlormethanlösung) 3400,

Äthylacetat enthielt, eluiert. Schließlich wurde die 25 2640, 1700, 1580, 1180, 970 cm"¹.

Kolonne noch mit weiteren 3000 ml Hexan, welches UV (Äthanollösung) Maximum bei 220 ηΐμ.

30% Äthylacetat enthielt, eluiert; danach wurde Erhitzt man 2,5 ml der Äthanollösung (39 μg Säure)

das Silikagel aus der Kolonne entfernt, mit Hexan, mit 2,5 ml 1 n-NaOH in Äthanol, so liegt das

welches 60% Äthylacetat enthielt, aufgeschlämmt Maximum des UV-Spektrums bei 280 πΐμ.

und wieder in eine Kolonne derselben Größe ein- 30 ' _.. , . , ,

gefüllt. Die auf diese Weise gewonnene Kolonne Dunnschichtchromatograpme

wurde mit 2000 ml Hexan, welches 60% Äthylacetat Ein einzelner Fleck mit R_F 0,7 bei Verwendung

enthielt, eluiert. von Essigsäure/Wasser im Verhältnis von 9:1.

Die letzten 3000 ml des 30%-Äthylacetat-Hexan- Ein einzelner Fleck mit R_F 0,75 bei Verwendung

Eluats und die 2000 ml des 60%-Äthylacetat-Hexan- 35 von Chloroform-Methanol-Essigsäure im Verhältnis

Eluats wurden vereinigt, filtriert und unter vermin- von 90 : 5 : 5.

dertem Druck zur Trockne eingedampft; man erhielt _T, .. , _π , .

auf diese Weise einen Rückstand in einer Menge Kernmagnetisches Resonanzspektrum

von 0,067 g. Der Rückstand wurde viermal mit je Das Spektrum weist zwei Dubletts mit Mittel-

5 ml Heptan extrahiert. Der heptanunlösliche Rück- 40 punkten bei 6,17 bzw. 7,52 δ auf; ein komplexes

stand wurde in absolutem Äthanol gelöst, die Lösung Multiplet hat seinen Mittelpunkt bei 5 bis 6<5; zwei

wurde filtriert und eingedampft; man erhielt auf weitere Multiplets liegen bei 4,1 bzw. 3,25 δ. Das

diese Weise einen Rückstand, der nacheinander mit Spektrum wurde in einem Varian A-60-Spektro-

je 5, 4 und 3 ml Tetrachlorkohlenstoff extrahiert photometer in Deuterochloroformlösung aufgenom-

wurde. Die Tetrachlorkohlenstofflösungen wurden 45 men, wobei Tetramethylsilan als Standardlösung

vereinigt und eingedampft; man erhielt so 0,031 g verwendet wurde.

eines Rückstandes. Dieser Rückstand wurde in etwa Reine HOPDC (2 mg) wurde in 3 ml eines Ge-1 ml Dichlormethan gelöst und auf eine 20 x 20 cm misches aus Wasser und Äthanol im Verhältnis Kieselsäuregel-Dünnschicht-Chromatographierplatte 1 :1 gelöst. Die Lösung wurde auf etwa 10⁰C abaufgetropft. Die Platte wurde mit einem Lösungs- 50 gekühlt und anschließend mit der äquivalenten Menge mittelgemisch aus Äthylacetat, Methanol und Wasser 0,lnormaler wäßriger Natriumhydroxidlösung neuim Verhältnis 8:2:5 entwickelt. Die entwickelte tralisiert. Beim Eindampfen zur Trockne erhielt Platte wurde an der Luft getrocknet; der mittlere man das praktisch reine Natriumsalz der HOPDC. Teil (5 bis 9 cm vom Anfangspunkt) wurde von der Arbeitet man wie vorstehend angegeben, verwen-Platte abgekratzt und mit Dichlormethan extrahiert. 55 det jedoch nacheinander Kaliumhydroxid, Calcium-Beim Eindampfen dieses Eluats verblieben 0,026 g hydroxid, Tetramethylammoniumhydroxid oder Beneines Rückstandes. zyltrimethylammoniumhydroxid an Stelle von Na-Dieser zuletzt genannte Rückstand von 26 mg triumhydroxid, so erhält man jeweils die entsprechenverhielt sich bei der Dünnschichtchromatographie den Salze der reinen HOPDC. Die Salze bewirken an Kieselsäure unter Verwendung von Äthylacetat- 60 keinen festen Schmelzpunkt, sondern zersetzen sich Methanol-Wasser (8:2:5) oder CHC1₃-Methanol- vorher.

Claims

Patentanspruch:

lS-Hydroxy^-oxoprosta-lOJS-trans-diencarbonsäure der Formel

OH

C = C H H (CH₂)₆COOH

H/-1 ; /~i

CH₃(CH₂)₄CH