DE1593647A1 - Verfahren zur Herstellung von Derivaten der Prostancarbonsaeure - Google Patents

Description

Ur. Walter Beil · Aug. iaoo

Dr, Hans Joachim Wolff Dr. Hans Chr. Beil Rechtsanwälte

Frankfurt a. M. - Höchst Adeionstraße 58 - TeL 3126 49

Unsere No. 12 996

The Upjohn Company Kalamazoo, Mich., USA

Verfahren zur Herstellung von Derivaten der Prostancarbonsäure

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Herstellung von neuen Derivaten der Prostancarbonsäure, die der Formel

H H C₇H₂-GH₂-CH₂-Ch₂-CH₂-CH₂-COOH 20 ><l 18 l> Ib /5 /V 13% / \ A fe JT V d a.

filT /ΊΤΤ IT TT Γ

WIl₀-OiIr₁ Xl Xl L

entsprechen. In dieser Pormel befinden sich die Wasserstoffatome an den C-8- und C-12-Atomen in der trans-Konfiguration. Vergleiche hiersu ßergstrüm et al., J.Biol. Chem., 258, 3555-3564 (1963) und Horton, Jä>perientia, 21, 113 (1965).

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf Verbindungen der !Formel 009330/1990

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/^C=0\

in welcher IL Wasserstoff oder ein pharmazeutisch akzeptables Kation bedeutet. R ₁ in !Formel II kann beispielsweise ein Metall-, Ammonium-Amin- oder ein quaternäres Ammoniumion sein. Yorzeigsweise handelt es sich bei dem Metallkation um ein Alkalimetallion, z.B. ein Lithium· Natrium- oder Kaliumion, oder um ein Erdalkalimetallkation, z.B. ein Magnesium-, Kalzium-, Strontium- oder Bariumion, Darüber hinaus kann es sich auch um andere Metallkationen, z.B. um ein Aluminium-, Zink-, Eisen- oder Silberion handeln.

Die pharmazeutisch akzeptablen Aminkationen können.sich von primären, sekundären oder tertiären Aminen ableiten, folgende Amine kommen als Stammsubstanzen infrage: Methylamin, Dime thy lamin, Trimethylamin, Ä'thylamin, Dibutylamin, Triisopropylamin, N-Metkylhexylamin, Decylaiain Allylamin, Grotylamin, Cyclopentylamin, Dicyclohexylamin, Benzylamin, Dibenzylamin, a-Phenyläthylamin, ß-Phenyläthylamin, Äthylendiamin, Diäthylentriamin sowie ähnliche niedere aliphatische, cycloaliphatische und araliphatische Amine mit bis zu etwa 18 kohlenstoffatomen. Auch heterocyclische Amine können geeignet sein, und zwar folgende: Piperidin, Morpholin, Pyrrolidin, Piperazin, sowie deren niedere Alkylderivate wie 1-Methylpiperidin, 4-Äthylmorpholin, 1-Isopropyl- und 2-Methy!pyrrolidin, 1,4-Dimethylpiperazin, 2-Methylpiperidin u.a. Schließlich kann es sich auch um Amine handeln, die Wasserlöslichkeit vermittelnde oder hydrophile Gruppen enthalten, z.B. Mono-, Di-, und Triäthanolamine, Äthyldiäthanolamin, N-Buty!ethanolamin, 2-Amino-1-butanol, 2-Amino-2-äthyl-1,3-propandiol, 2-Amino-2-methyl-1-propanol, Tris(hydroxymethyl)-aminomethan, N-Phenyläthanolamin, N-(p-tert-Amylphenyl)diäthanolamin, Galactamin, N-MethyIgluoamin, N-Methylglucosamin, Ephedrin, Phenylep.hrin, Epinephrin, Procain u.a.

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Zu den pharmazeutisch akzeptablen quaternären Ammoniumkationen gehören beispielsweise Tetramethy!ammonium-, Tetraäthylammonium-, Benzyltrimethy!ammonium-, Phenyltriäthylammoniumionen u.a.

Die iDStancarbonsäurederivate der Formel II zeichten sich durch eine vasodepressorische Wirkung im normotonischen Zustand aus, wie durch Versuche an Hunden nach der Methode von Lee et al., Circulation Hes. 13, 3p9 (1963) festgestellt werden konnte. Den betäubten Hunden wurde der N.vagus entfernt; anschließend wurden die Hunde mit Pentolinium behandelt (AVPI-Hunde). Das zu untersuchende Material wurde in Äthylalkohol, der im Verhältnis 1 : 10 mit physiologischer Salzlösung oder 5$iger Dextroselösung verdünnt wurde, intravenös injiziert.

Wegen der vorstehend beschriebenen Wirkung sind Prostancarbonsäurederivate der Formel II wertvolle therapeutische Mittel zur Behandlung von Bluthochdruck, zur Normalisierung des Lipidgehaltes des Serums und damit zur Verminderung der Gefahren bei ischaemischen Herzkrankheiten. Weiterhin können die Verbindungen zur Behandlung von Störunger des Zentralnervensystems bei Säugetieren und Menschen dienen. Die Verbindungen können durch intravenöse Infusion in Form steriler physiologischer Salzlösungen mit einer Geschwindigkeit von etwa 0,01 bis etwa 10, vorzugsweise etwa 0,1 bis 0,2 Mikrogramm pro kg Körpergewicht pro Minute zugeführt werden.

Es ist bekannt, daß andere Prostancarbonsäurederivate bei intravenöser Injektion den arteriellen Blutdruck senken; dies gilt insbesondere für die als Prostaglandine bekannten Substanzen, z.B. PGE₁, PGE₂ und PGE₇. Vgl. hierzu Horton, ibid. Die letztgenannten Substanzen haben jedoch auch eine starke stimulierende·Wirkung auf die glatte Muskulatur, z.B. auf die glatte Muskulatur des Magendarmtraktes bei Säugetieren, und sind Antagonisten der epinephrininduzierten Mobilisierung der freien Fettsäuren. Überraschender- und unerwarteterweise haben die neuen Verbindungen der Formel II ein weitaus geringere stimulierende Wirkung auf die glatte Muskulatur als beispielsweise PGE.., wie beispielsweise an Muskelstreifen aus dem Magendarmtrakt von Meerschweinchen und Kaninchen gezeigt werden konnte. Auch ihre antagonistische Wirkung auf die epinephrininduzierte Mobilisierung der freien Fettsäuren ist geringer als die von PGE^. Die erfindungogemäßen Ver-

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bindungen sind daher wertvolle Therapeutika, die sich durch geringere Nebenwirkungen auszeichnen als die bisher für denselben Zweck bekannten Verbindungen, z.B.

Die neuen Verbindungen der Formel II sind weiterhin dadurch wertvoll, daß sie Laboratoriumstieren, vorzugsweise Ratten, verabreicht werden können, so daß man Tiere züchteniann, die die Verbindungen in großen Mengen enthalten. Derartige Tiere.können dann als Versuchstiere bei der Suche nach und der Prüfung von Verbindungen dienen, die Antagonisten der verabreichten Verbindungen sind. Die letztgenannten antagonistischer Verbindungen können zur Umkehrung der Wirkungen von versehentlichen Überdosen der extrem wirksamen Verbindungen der Formel II und zur Behandlung von allergischen Zuständen dienen. Zu diesem Zweck verabreicht man die zu prüfende Verbindung der !Formel II dem Versuchstier vorzugsweise durch kontinuierliche intravenöse Infusion, wobei die Verbindung in steriler Salzlösung vorliegt. Die Zuführung erfolgt mit einer Geschwindigkeit von etwa 0,01 bis 10, vorzugsweise 0,05 bis 0,2 Mikrogramm pro kg Tiergewicht pro Minute, bis die gewünschte Konzentration der Verbindung erreicht oder die gewünschte Reaktion in dem Tier beobachtet worden ist. Die Infusion kann dann weitergeführt oder beendet werden, je nach dem Versuch, der mit dem Tier durchgeführt werden soll.

Für die vorstehend genannten Zwecke können die Verbindungen der Formel II entweder in Form der freien Säuren oder in Form der pharmakologi'sch akzeptablen Salze verwendet werden.

Ueben den vorstehend genannten Verwendungszwecken können die im wesentlichen reinen Verbindungen der Formel II, in welchen R. Wasserstoff bedeutet, auch als Standard-Reagenzien bei der Untersuchung von Tiergeweben oder Pflanzengeweben oder als biochemisches Reaktionsgemisch auf die mögliche Anwesenheit und den Gehalt der neuen Verbindungen verwendet werden.

Es ist bekannt, daß Prostancarbonsäurederivate, insbesondere die Prostaglandine, in vielen Arten von Tiergeweben vorhanden sind. Vgl. Hormon, ibid., und Samuelsson, Angew. Chem. Intern. Ed. Eng. 4, 410 (1965) Es ist weiterhin bekannt, daß verschiedene ungesättigte alicyclische Garbonsäuren durch Einwirkung von Enzymsystemen, die in bestimmten

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Tiergeweben, z.B. den Geweben der Vesiculärdrüsen von Schafen und-der' Lungen von Meerschweinchen vorhanden sind, in Prostaglandine, umgewandelt werden können. Vergleiche hierzu: Samuelsson, ibid. und Kienberg et al., Acta öhem. Scand. 19, 534 (1965); Samuelsson, J. Am. Ohem. Soc. 87, 3011 (19 5); Byhage et al., Biochem. Biophys. Res. Commün. 19, 279 (1965); Fugteren et al., Biochim. Biophys. Acta, 98, 654 (1965) und Wallach, Life Sciences 4, 361 (1965). So kann beispielsweise Gesamt-cis-8,11, 14-Eicosatriencarbonsäure in PG-E.., Gesamt-cis-Eicosa-5,8,11,14-tetraencarbonsäure in PGE₂ und Gesamt-cis-Eicosa-5»8,11,14,17-Pentaencarbonsäure in PGE^ umgewandelt werden. Bei diesen enzymatischen Umwandlungen spielen Oxygenase- und Oxidaseenzyme eine entscheidende Rolle. Vergleiche hierzu: Samuelsson, J. Am. Ohem. Soc. 87» 3011 (1965). Gesamt gewebebreie, zentrifugierte Gewebebreie und Acetonpulver sind als Aus- Λ gangsmaterialien für die notwendigen Enzymsysteme verwendet worden.

Überraschenderweise wurde jetzt gefunden, daß reine 15-Hydroxy-9-oxoprosta-1Ü,traris-13-äiencarbonsäure oder ein Salz derselben aus der Mischung abgetrennt werden kann, die durch ärobe Inkubation von Gesamtcis-8,11,T4-Eieosatriencarbonsäure (Homo-7£-linolensäure) oder einem Salz derselben mit einem wäßrigen Medium, welches die Oxygenase- und Oxidaseenzyme aus Tiergeweben, in denen ,auch endogene PGE₁ vorhanden ist, enthält, erhalten wird,

PGE. ist die Abkürzung für Prostaglandin E., welches auch als 11a,15-I)ihydroxy-9-oxoprosta-trans-13-en-carbonsäure bekannt ist. Vergleiche ^ • hierzu Horton,^: ibid. Tiergewebe, welches endogene PGE. enthält, ist ein solches, in welchem die PGE.. gebildet worden ist, während das Gewebe Teil eines intakten Lebewesens ist. Gewebe, in welches PGE₁ nachträglich eingebracht worden ist, fällt nicht unter diesen Begriff, es sei denn, daß letztgenannte Gewebe produziert ebenfalls PGE₁ (oder ist au dieser Produktion fähig), wenn es Teil eines intakten Tieres ist. x^raKtisch reine 1b-Hydroxy-9-oxoprosta-10,trans-^-dlencarbonsäuie ist ίία eine Säure definiert, die frei von Antigenen, Pyrogenen, Geweberück· 3.,unden,Wasser und anderen üblichen Veraiinnungsmittein sowie praktisch frei vonPGE^ sowie anderen Substanzen, die die glatte Muskulatur des l^igendarmtraktes von Säugetieren stimulieren und als Antagonisten der epinephrininduzierten Mobilisierung der-freien Fettsäuren in vitro und in Versuchstieren wirken, ist... Vgl. hierzu Horton, ibid.,

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Wie weiter oben bereits angedeutet, ist es bekannt, daß PGE₁ durch ärobe Inkubation von Gesamt-cis-8, 1 i-HjEicosatriencarbonsäure oder deren Salzeamit einem im wesentlichen wäßrigen Medium, welches Oxygenase- und Oxidaseenzyme enthält, die in Tiergeweben vorhanden sind, in welchen sich auch endogene PGE₁ befindet, hergestellt werden kann. Es ist nicht sicher, ob HOPDG ' direkt aus der Gesamt-cis-8,11,14-Eicosatriencarbonsäure gebildet wird, ob die Diencarbonsäure durch enzymatische oder nidi enzymatisch^ Dehydratisierung von PGE^ (entweder während der Inkubation oder während einer oder mehrerer/Isolierungsstufen) entsteht oder ob ihre Bildung auf noch einem anderen Weg erfolgt. Es ist für das Wesen der vorliegenden Erfindung jedoch ohne Bedeutung, in welcher Weise die HOPDG gebildet wird. Vielmehr ist es als neu und überraschend anzusehen, daß die wertvolle Diencarbonsäure in praktisch reiner Form aus der ' durch ärobe Inkubation gewonnene Mischung isoliert werden kann. Beliebige, bekannte Methoden zur enzymatischen Herstellung und Isolierung von PGE^ aus Gesamt-cis8,11,14-Eicosatriericarbonsäure oder deren Salzeft, z.B. die in den vorstehend aufgeführten Literaturstellen beschriebenen, können zur Herstellung der Gemische verwendet werden, aus denen die im wesentlichen reine HOPDG abgetrennt wird.

Ausgangsmaterialien für die Oxygenase- und Oxidaseenzyme, die zur Herstellung der Gemische für das erfindungsgemäße Verfahren notwendig sind, sind beispielsweise zerkleinerte Gewebe, Gesamtgewebebreie, zentrifugierte Gewebebreie sowie die in hochtourigen Zentrifugen gewonnenen Rückstände. Alle genannten Arbeitsweisen sind aus der älteren Literatur bekannt. Weiterhin ist es möglich, die Enzyme in unterschiedlicher Reinheit aus Geweben zu isolieren, z.B. als Aceton-pulver; auch diese Arbeitsweise ist aus der Liüeratur bekannt. Vergleiche hierzu:. Neilanda et al., "Outlines of Enzyme Chemistry",2.Aufl. Wiley & Sons, Inc., New York, S. 42-6!? (1958); Schwimmer et al. in Nord, "Advances in Enzymology", Bd. 14, IntersciencQ Publishers, Inc., New ifork, S. 375-409 (1953); Umbreit et al., "Manometric Techniques", 4. Aufl., Burgess Publishing Co., S. 114-176 (19b4). Die isolierten Enzyme können in im wesentlichen wäßrigen Medium anstelle von Gewebebreien verwendet werden, z.B. in der von Wallach, ibid. beschriebenen Weise. ;

Wie aus der älteren Literatur bekannt, wird die Umsetzung der und Oxidaseenzyme iniü der Geaamt-cls-B., I i, H-Eicosatriencurbonsäure oder deren Salzervvorzugsweise in einem wäßrigen, gepufferten Medium

*) wird hier und im weiteren Textverlauf anstelle von ^{BAD QRiG}'^NAL 1 b-üydroxy-y-oxoprosta-iü, trans-1 3-dieiiGarbQnsäure verweil- - 7 .-

f\ ft ft rs i-i ι-ν / «r j». r>, r\ c\ ο Ι:

durchgeführt; der pH-Wert soll schwach basisch sein, z.B. zwischen 7 und etwa ;8,5 liegen. Da für die gewünschte Umwandlung molekularer Sauerstoff notwendig ist, muß die Reaktion unter äroben Bedingungen.durchgeführt werden, wobei die Zuführung von Sauerstoff zum Reaktionsgemisch in beliebiger Weise erfolgen kann. · ·

Gesamt-cis-8,11,^-Eicosatriencarbonsäure ist beispielsweise bei Korn, J.Bicjl. Chem.· 238, 3584 (1963) beschrieben. Man kann die freie Säure oder!bestimmte Salze derselben, z.B. die Natrium-, Kalium-, Calcium-

Ammoniumsalze verwenden. Die zu verwendende Säuremenge hängt von

der verwendeten Oxygenase- und Oxidaseenzymmenge ab. Auch hier kann man sich!bezüglich der Mengenverhältnisse an die Angaben der älteren Literatur halten.

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Die Umsetzungstemperatur entspricht vorzugsweise der normalen Säugetierkorper temp era tür, d. h. sie kann etwa im Bereich von 55 bis 40⁰O liegen; ggfs. ist es möglich, bei mäßig höheren oder tieferen Temperaturen zu arbeiten. Die Reaktionsdauer hängt von der Art und/oder der Reinheit der Enzyme,, den Mengenverhältnissen von Enzymen zu Säure, der Reaktionstemperatur und der Menge des vorhandenen Sauerstoffes ab. Im allgemeinen reichen Umsetzungszeiten von etwa 30 Minuten bis zu etwa 24 Stunden aus. Der Ablauf der Reaktion kann verfolgt werden, indem man kleine Proben aus 'dem Reaktionagemisch entnimmt und die Mengen an PGE.. und HOPDO bestimmt. Die letztgenannte· Verbindung ist weniger polar als PGE. und kann von der ebenfalls im Reaktionsgemisch vorhandenen Säure z.B. durch Dünnschichtchromatographie auf Silikagel unter Verwendung eines Gemisches von Ghloroform-Methanol-Essigsäure im Volumenverhältnis von 9Ο:5ϊ5 getrennt werden. Die PGE₁ und HOPDG können auf dem Dünnschichtchromatogramm leicht nach Trocknen der Platte, Besprühen mit einer Vanillin-Phosphorsäure-Mischung und 10 minütiges Erhitzen auf 110⁰O festgestellt werden. An den Stellen, an denen sich die Verbindungen befinden, erscheinen dunkle Flecken.

Für die vorstehende Prüfmethode sowie für die schließliche Isolierung können PGE₁ und HOPDO von den Enzymen und dem wäßrigen Inkubationsmedium in.derselben Weise abgetrennt werden, wie dies für die Isolierung von PGE₁ in der weiter oben angeführten älteren Literatur beschrieben ist.' Da die Inkubationsmischung durch Zugabe eines Puffers, Vorzugs- ^ι

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weise schwach "basisch gehalten wird, liegen erhebliche Anteile der PGE^ und der HOPDO in der Reaktionsmischung als Unionen vor. Das Reaktionsgemisch wird zur Umwandlung der Anionen in die freien Carbonsäuren vor der Isolierung angesäuert. Die gewünschte HOPDG wird wahrscheinlich während des Ansäuerns durch Dehydratisierung aus PGrE₁ gebildet.

Zur Trennung der PGE₁ und der HOPDG und zur weiteren Reinigung der letzteren kann man in üblicherweise vorgehen. Beispielsweise kann man die Methode der Dünnschicht Chromatographie an Silikagel anwenden, die von Green et al., J. Lipid Research 5, 117 (1964) für die verschiedene] Prostaglandine beschrieben worden ist; man arbeitet mit einem Lösungsmittelgemisch der weiter oben bereits beschriebenen Art. Weiterhin kann die Trennung durch VerteilungsChromatographie oder Verteilungs ehr oma to· graphie mit umgekehrten Phasen durchgeführt werden, z.B. in der ebenfalls für die verschiedenen Prostaglandine von Samuelsson, J. Biol. Ghem. 238, 3229 (1963) beschriebenen Weise. Hinsichtlich des chromatographischen Verhaltens entspricht die erfindungsgemäß hergestellte freie Säure weitgehend wenn auch nicht völlig den bekannten Prostaglan· dinen, insbesondere PGE₁, PGE₂ und PGE^. Zur Isolierung, Reinigung und Bestimmung der erfindungsgemäß hergestellten freien Säure können die auch für Prostaglandine üblichen Methoden angewendet werden.

Besonders günstig ist es, die erfindungsgemäße HOPDG von PGE₁ durch fraktionierte Kristallisation aus einem geeigneten Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch zu trennen. Die Abtrennung der PGE₁ in kristalliner Form, aus Mischungen mit der neuen Verbindung der Formel II gemäß vorliegender Erfindung ist verhältnismäßig einfach. Die letztgenannte Substanz liegt bei Raumtemperatur als Öl vor, sie· ist infolgedessen in den zur Kristallisation verwendeten Lösungsmitteln stärker löslich und sammelt sich im Verlauf der Umkristallisation in den Mutterlaugen an. Die ölige HOPDC, die man auf diese Weise erhält, ist praktisch frei von PGE... Zur Gewinnung völlig reiner HOPDC kombiniert man die vorstehend genannten Methoden der fraktionierten Kristallisation, der Chromatographie und der Lösungsmittelextraktion, wie nachstehend noch näher erläutert werden wird.

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-Die erfindungsgemäß hergestellte, reine HOPDO, d.h. die Verbindung der Formel II, in welcher 1L· Wasserstoff ist, kann in Salze umgewandelt werden, d.h. in Verbindungen, in welchen R.. ein pharmakologisch akzeptables Kation darstellt. Die Neutralisation wird mit den entsprechenden Mengen einer anorganischen oder organischen Base (vgl. die weiter oben genannten Kationen) durchgeführt. Die Arbeitsweise ist dabei die übliche zur Herstellung von Metall- oder Ammoniumsalzen, Amin-Säure-Anlagerungssalzen und quaternären Ammoniumsalzen. Bei der Herstellung der betreffenden Salze müssen selbstverständlich deren Losliehkeitseigenschaften in Rechnung gesetzt werden. Im Falle anorganischer Salze ist es günstig, das Prostancarbonsäurederivat in Wasser zu lösen, welches in stöchiometrischer Menge das gewünschte Kation in Form des Hydroxides, Carbonates oder Bicarbonates enthält. Verwendet man Natriumhydroxid, Natriumcarbonat oder Natriumbicarbonat, so erhält man das Natriumsalz des Prostancarbonsäurederivates der Formel II. Durch Verdampfen des Wassers oder Zugabe eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels von mäßiger Polarität, z.B. eines niederen Alkanoles oder niederen Alkanones, erhält man das anorganische Salz in fester Form. .

Zur Herstellung des Aminsalzes wird das Prostancarbonsäurederivat in einem geeigneten Losungsmittel mäßiger oder niedriger Polarität gelöst. Lösungsmittel mäßiger Polarität sind beispielsweise Äthanol, Aceton und Äthylacetat; Lösungsmittel niedriger Polarität sind beispielsweise Diäthyläther und Benzol. Das Amin muß in der Lösung we- g nigstens in stöchiometrischer Menge vorhanden sein. Falls das entstehende Salz nicht ausfällt, kann es in fester Form gewonnen werden, wenn man ein mischbares Lösungsmittel niedriger Polarität zusetzt oder wenn man die Lösung eindampft. Ist das Amin verhältnismäßig flücl· tig, so kann ein Überschuß desselben durch Verdampfen entfernt werden. Die weniger flüchtigen Amine werden vorzugsweise in stöchiometrischen Mengen verwendet. .

Soll ein quaternäres Ammoniumsalz hergestellt werden, so vermischt mar das Prostancarbonsäurederivat mit der stüchiometrischen Menge des entsprechenden quaternären Ammonlumhyäroxides in wäßriger Lösung und dampft anschließend das Wasser -ab.

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Beispiel 1

IS-Hydroxy-g-oxoprosta-IO^rans-^-diencarbonsäure (HOPDO) Samenblasen von jungen Schafböcken (5kg) wurden in gefrorenem Zustand in einem Fleischwolf gemahlen. Die so entstandene Gewebemasse wurde in 500 g Ansätzen in Waring-Misehern aus rostfreiem Stahl mit einem Passunge vermögen von etwa 3,8 1 jeweils 3 Minuten homogenisiert, wobei insgesamt

5 1 0,1 η wäßriger AmmoniumchLorid-Pufferlösung verwendet wurden (pH- . Wertj = 8,5).

I -

Eine Lösung von Gesamt-cis-8,11,14-Eicosatriencarbonsäure (5,0 g) in 50 ml Äthanol wurde langsam zu 5 1 derselben 0,1 η wäßrigen Ammoniumchlorid-Puff erlösung unter lebhaftem Rühren gegeben. Die auf diese Weise erhaltene Emulsion wurde anschließend mit dem zuerst hergestellten Gesamtdrüsenhomogenat vermischt; das so gewonnene Gemisch wurde durch Zugabe von

6 η Ammoniumhydroxidlösung auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt und bei 37,5⁰O eine Stunde unter kontinuierlichem Rühren belüftet.

Am Schluß der Inkubationsperiode wurde der pH-Wert der Mischung durch Zu·» gäbe von 6 η Ohlorwasserstoffsäure auf 7,5 eingestellt. Man setzte weiterhin unter Rühren Aceton (45 l)zu und ließ die Mischung eine Stunde bei etwa O⁰C stehen. Danach erfolgte auf einem Saugfilter eine Trennung in einen Filterkuchen und ein erstes Filtrat. Der Filterkuchen wurde in 4 1 einer Mischung aus Aceton und Wasser (Volumenverhältnis 3:1) suspendiert; die Suspension wurde wiederum filtriert. Das so gewonnene erste und zweite Filtrat wurden vereinigt und zweimal mit je 27,5 Hexan extrahiert.

Die extrahierten Acetonfiltrate wurden bei vermindertem Druck und einer Temperatur unter 40⁰G bis auf ein Volumen von 4100 ml eingedampft; das Konzentrat wurde mit Chlorwasserstoffsäure auf einen pH-Wert von 2,8 eingestellt. Die so gewonnene saure Lösung wurde nacheinander zweimal mit je 2 1 und dann zweimal mit je 1 1 Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten Dichlormethan-Extrakte wurden unter vermindertem Druck bis auf ein Volumen von 2,5 1 eingedampft; das Konzentrat wurde nacheinander einmal mit 2 1 und zweimal mit je 1 1 einer.0,2 η NatrLumphosphat-Pufferlösung (pH 8,0) extrahiert.

Die vereinigten Pufferextrakte wurden mit 400 ml Diohlormethan gewaschen,

danaoh durch Zugabe von konzentrierter Ohlorwasserstoffsäure auf einen i " RAD ORiG¹NAL

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pH-Wert von 2,9 eingestellt und schließlich nacheinander einmal mit 1 1 und dreimal mit je 5»mlDi.chlormeth.an extrahiert. Die vereinigten Dichlormethan-Extrakte wurden nacheinander mit 450 ml, 300 ml und !500 ml Wasser gewaschen. Durch Eindampfen der so gewonnenen D i chlorine than-Lös-ung unter vermindertem Druck erhielt man 2,84' g eines Öles. Dieses Ol wurde in 10 ml Dichlormethan gelöst. Die sich nach und nach abscheidende kristalline PGE., wurde abfiltriert. Das Piltrat wurde eingedampft der verbleibende ölige Rückstand wurde in etwa 3 ml Dichlormethan gelüst. Hexan wurde zugesetzt , bis die Lösung schwach wolkig wurde. Die sich abscheidende v/eitere PGE. wurde abfiltriert.

Die Dichlormethan-Hexan-Mutterlauge wurde mit weiterer Mutterlauge vereinigt, die in derselben Weise wie vorstehend beschrieben, aus 5 kg Schafsamenblasen und 5,0g Gesamt-cis-8,11,14— Eicosatriencarbonsäure erhalten worden war. Zu diesen beiden Mutterlaugen gab man eine Äthylacetat-Hexan-Mutterlauge, die wie folgt erhalten worden war: die vier in der vorstehend beschriebenen Weise erhaltenen Ernten an kristallinem PGE. wurden vereinigt und in 10 ml Dichlormethan gelöst. Die sich abscheidenden Kristalle wurden abfiltriert; das 3?iltrat wurde zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in Äthylacetat gelöst; die Lösung wurde bis zur Trübung mit Hexan versetzt. Die sich abscheidenden Kristalle wurden abfiltriert; die weiter oben erwähnte Äthylacetat-Hexan-Mutterlauge blieb zurück.

Die drei vereinigten Mutterlaugen wurden eingedampft; der Rückstand wurde in Benzol, welches \°/o Äthylacetat enthielt, gelöst. Diese Lösung gab man über eine Kolonne mit einer Größe von 27 x 350 mm, die mit mit Säure gewaschenem Silikagel gefüllt war. Die Kolonne wurde nacheinandei mit ^oanl Benzol, welches 1^ Äthylacetat enthielt, 2 Γ Benzol, welches 20>3 Allylacetat enthielt, und 2 1 Benzol, welches 40$ Äthylacetat: enthielt, eluiert. Das Eluat, welches bei der Behandlung mit der Benzollösung, die 40^ Äthylacetat enthielt, erhalten wordenmr, wurde zur Trockne eingedampft; auf diese Weise erhielt man einen Rückstand in einer Menge von 0,26 g. !.

Ein Tail dieses Rückstandes (0,22 g) wurde in Hexan gelöst und über eine Kolonne (14 x 360 mm), die mit säure=gewaschenem Silikagel gefüllt war, gegeben. Die Kolonne wurde nacheinander mit 500 ml Hexan,

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500 ml Hexan, welches 1$ Äthylacetat enthielt, 500 ml Hexan, welches. 5$ Äthylacetat enthielt, 500 ml Hexan, welches 10$ Äthylacetat enthielt, 6000 ml Hexan,welches 20$ Äthylacetat enthielt und 12.000 ml Hexan, welches 30$ Äthylacetat enthielt, eluiert. Schließlich wurde die Kolon-· ne noch mit weiteren 3000 ml Hexan, welches 30$ Äthylacetat enthielt, eluiert; danach wurde das Silikagel aus der Kolonne entfernt, mit Hexan, welches 60$ Äthylacetat enthielt, aufgeschlämmt und wieder in eine Kolonne derselben Größe eingefüllt. Die auf diese ¥eise gewonnene Kolonne wurde mit 2000 ml Hexan, welches 60$ Äthylacefet enthielt, eluiert.

Die letzten 3000 ml des 30$-Äthylacetat-in-Hexan-Eluates und die 2000 ml des 60$-Äthylacetat-in-Hexan-Eluies wurden vereinigt, filtriert und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft; man erhielt auf diese Weise einen Rückstand in einer Menge von 0,067 g· Der Rückstand wurde viermal mit je 5 ml Heptan ausgelaugt. Der Heptan-unlösliche Rückstand wurde in.absolutem Äthanol gelöst, die Lösung wurde filtriert und eingedampft; man erhielt auf diese Weise einen Rückstand, der nacheinander mit je 5 ml, 4- ml und 3ml Tetrachlorkohlenstoff ausgelaugt wurde. Die Tetrachlorkohlenstofflösungen wurden vereinigt und eingedampft; man erhielt so 0,031 g eines Rückstandes. Dieser Rückstand wurde in etwa 1 ml Dichlormethan gelöst und auf eine 20 χ 20 cm Silikagel-Dünnschicht-Chromatographierplatte aufgetropft. Die Platte wurde mit einem Lösungsmittelgemisch aus Äthylacetat, Methanol und Y/asser im Verhältnis 8:2:5 entwickelt. Die entwickelte Platte wurde an der Luft getrocknet; der mittlere Teil (5 bis.9.cm vom Anfangspunkt) wurde von der Platte abgekratzt und mit Dichlormethan extrahiert. Beim Eindampfen dieses Eluates verblieben 0,026 g eines Rückstandes.

Dieser letztgenannte Rückstand von 26 mg verhielt sich bei der Dünnschichtchromatographie an Silikagel unter Verwendung von Äthylacetat- Methanol-Wasser (8:2:5) oder CHCl-z-Methanol-Essigsäure (90:5:5) wie eine einzige Verbindung. Der Rückstand wurde durch Lösen in 30 ml Di- chlormethan und dreimaliges Extrahieren der Lösung mit je 10 ml Wasser weitergereinigt. Die gelb gefärbten Wasserextrakte (pH- 6,5)wurden vereinigt und mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure auf einen pH-Wert von 3f5 angesäuert. Die saure Lösung wurde dreimal mit Diohlormethan extrahiert. Die vereinigten Dichlormethanlösungen wurden getrocknet und anschließend zur Trockne eingedampft; der verbleibende Rückstand wurde in

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15 ml warmem absoluten Äthanol aufgelöst. Diese lösung wurde dann etwa

16 Stunden auf -20⁰O abgekühlt. Eine kleine Menge Rückstand wurde abfiltriert und auf dem Filter fünfmal mit je 3 ml absolutem Äthanol gewaschen. Das Filtrat und die Waschlösungen wurden vereinigt, eingedampft und getrocknet. Man erhielt auf diese Weise 6,6 mg praktisch rei ner HOPDC in Form eines Öles. Der stimulierende Effekt bei dieser Sub-

aas

stanz auf die glatte Muskulatur betrug nur etwa/0,01——fache von der Antagonismus der epinephrininduzierten Mobilisierung der freien Fettsäuren betrug das etwa 0,005fache verglichen mit PGE...

IR (Hauptbanden in Dichlormethanlösung)
34-00, 2640, 1700, 1580, 1180,. 970 cm
UV (Äthanollösung) Maximum bei 220 mu

Erhitzt man 2,5 ml der Äthanollösung (39/4g Säure) mit 2,5 ml 1n ITaOH in Äthanol, so liegt das Maximum des UV-Spektrums bei 280 my*..

Dünns chichtChromatographie'

Ein einzelner Fleck mit R^ 0,7 bei Verwendung von Essigsäure/Wasser im Verhältnis von 9:1.

Ein einzelner Fleck mit Rj, 0,75 bei- Verwendung von Chloroform-Methahol-Bssigsäure im Verhältnis von 90:5*5.

"Kernmagne Eischea Resonanzspektrum

Das Spektrum weist zwei Dubletten mit Mittelpunkten bei 6,17 bzw. 7,52^aUf; ein komplexes Multiplet hat seinen Mittelpunkt bei 5-66 ; zwei weitere Multiplets liegen bei 4>1 bzw. 3,25i> . Das Spektrum

wurde in einem Varian A-60-Spektrophotometer in Deuterochloroformlösung aufgenommen, wobei letramethylsilan als Standardlösung verwendet wurde. '

Beispiel 2

Natriumsalz der 15-Hydroxy-9-oxoprosta-10 _f trans-13-dienoarbonsäure. Reine HOPDO (2 mg) wurde in 3 ml eines GemiBOhes aus Wasser und Äthanol· im Verhältnis 1st gelöst, Die Lösung wurde auf etwa 10⁰O abgekühlt und anschließend mit der äquivalenten Menge 0,1 η wäßriger Natriumhydroxidlösung neutralisiert. Beim Eindampfen zur Srackne erhielt man das praktisch reine Natrium&alis der HOPDO.

~" "30/1990

ΒΑΌ ORIGINAL „ ₁₄ „

Arbeitet man wie vorstehend angegeben, verwendet jedoch nacheinander Kaliumhydroxid, Calciumhydroxid, Tetramethylammoniumhydroxid oder Benzyltrimethylammoniumhydroxid anstelle von Natriumhydroxid, so erhält man jeweils die entsprechenden Salze der reinen HOPDG.

SAD ORfGlNAL

009830/1990

Claims (1)

1. Patentansprüche ■ ·

   1) Verfahren zur Herstellung im wesentlichen reiner 15-Hydroxy-9-oxoprosta-1O,tisma-13-cliencar'bonsäure, dadurch gekennzeichnet, daß man diese Säure oder ein Salz derselben direkt in reiner Form aus einer Mischung gewinnt, die ihrerseits «durch ärobe Inkubation von Gesamtcis-8,11 ,M-Eicosatriencarbonsäure oder einem Salz derselben mit einem im-wesentlichen wäßrigen Medium hergestellt -wird, welches die Oxygenase- wßä üxidaseenzyme enthält, die sich in Tiergeweben befinden, die endogene PGE.. enthalten.

   2) Verfahren nach. Anspracht, dadurch gekennzeichnet, daß man eine wäßrige Lösung ies in der Mischung vorhandenen Prostanearbonsäurederivates oder eines Salzes derselben ansäuert und daß man die 15-Hydro-4[ xy-9-oxoprossta—"!©,trans-^-diencarbonsäure aus der angesäuerten Lösung gewinnt und-so von den übrigen in der angesäuerten Lösung vorhandenen Prostancarbonsäuren abtrennt.

   5) Verfahren mach. Anspruch 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als .Tiergewebe- ein Yesikulärdrüsengewebe von Säugetieren verwendet.

   4) Verfahren mach. Jinspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Tiergev/ebe von Schafen ° stammt'·

   5) Verfahren nacli Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Tiergewebe von einem Bullen stammt.

   6) Verfahren mach. Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das bei der aeroben Inkubation der Gesamt-cis-8,11,H-Eicqsätriencarbonsäure oder deren Salz verwendete wäßrige Medium ein zerkleinertes Tierge-

   . webe enthalt, welches reich an endogener PGE.. ist.

   7) Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Tiergewebe aus zerkleinertem Vesikulärdrüsengewebe von Schafen besteht.

   " für The Upjohn Company

   Kalamazop, Mich., USA

   RechtBanwalt 00 9830/199 0

   BAD ORIGINAL