DE2410853A1 - Reinigung und trennung von steroidlactonen - Google Patents

Description

RECHTSANWÄLTE
ϊ DR. JUR. DirUCHEM. WALTER BEIL

dr^F j^.¹ cip^ciJ!! tu ι. wOLW 25. Feb. 1974

«23 FRANKFURT AM MAlH-HOCHSl

St 58

Unsere Nr. 19 155 Wo/AG

G. D. SearIe & Co.
Chicago, Illinois 60680, VStA

Reinigung und Trennung von Steroid-Lactonen

Das ϊ-Lacton der 17-Hydroxy-3-oxo-l7oC-pregna-4,6-dien-21-carboxylsäure kann mit einer Reihe von Substanzen umgesetzt werden, um einen kondensierten Cyclopropanring an der Stelle der Doppelbindung in 6,7-Stellung einzuführen. Jedoch ist diese Reaktion nicht stereoselektiv, sondern es wird eine Mischung zweier isomerer Verbindungen erhalten. Diese unterscheiden sich je nachdem, ob die Methylgruppe sich · auf der °t~ oder ß-Seite des Steroidmoleküls befindet. Wenn Dimethylsulfoxoniummethylid als Reagens zur Einführung des kondensierten Cyclopropanrings verwendet wird, enthält das so erhaltene Rohprodukt ungefähr 70 % der Verbindung mit der Methylengruppe auf der ß-Seite des Steroidmoleküls, während die restlichen 30 % das entsprechende oC-lsomere sind. Wegen der grossen Ähnlichkeit dieser beiden Verbindungen gestaltet sich die Trennung der Mischung in die individuellen Isomeren mittels der üblichen Techniken als schwierig, wenn man die Isomeren in wesentlich reinem Zustand erhalten will; ausserdem ist damit ein erheblicher Verlust an Substanz verbunden. Es wurde nun gefunden, dass eine solche Isomerenmischung getrennt werden kann, wenn man Hydrochinonkomplexe

409838/1039

bildet ι dadurch werden die individuellen Verbindungen in im wesentlichen reinen Zustand erhalten. Die vorliegende Erfindung bezieht sich demgemäss auf solche Hydrochinon-Korr.plexe und auf ein Verfahren zur Trennung der beiden isomeren Verbindungen mittels ihrer Komplexbildung mit Hydrochinon. Das vorliegende Reinigungs- und Trennverfahren ist jedoch nicht beschränkt durch die Art und Weise des Hersteilens der isomeren Mischung.

Die zu trennenden Verbindungen haben die folgenden Formeln

(I)

(II)

Die systematische Bezeichnung für Verbindung I ist 6_α37α" Dihydro-17~hydroxy-3-oxo-3'H-cyclopropa^ 6 ₃ 7j-17a~pregna-

die 4,6-dien-21-carboxylsäure-y-lacton undvder Verbindung II ist 6ß_i7ß-Dihydro-17-hydroxy-3-oxo-3^tH-cyclopropa[,6₃7J-17apregna-4,ö-dien-^l-carboxylsäure-Y-lacton. Zur Vereinfachung wird Verbindung I im folgenden auch als 6a.i7a.-Dihydroverbindung oder als ß-Methylenverbindung benannt werden, Verbindung II als 6ß,7ß-Dihydrovex'bindung oder als a-Methyleneverbindung.

409838/1039

Beide vorgenannten Verbindungen sind pharmakologisch wertvoll als Anti-DCA-Mittel. Insbesondere sind sie wertvoll als Diuretika und als Mittel gegen erhöhten Blutdruck. Jedoch ist die Aktivität der beiden Verbindungen nicht identisch, und das eine Isomere ist aktiver als das andere. Demgemäss ist es wünschenswert, die beiden Isomeren zu trennen und die beiden individuellen Verbindungen in einem im wesentlichen reinen Zustand zu erhalten, um so irgendwelche Probleme bezüglich der tatsächlichen Menge an aktiven Bestandteilen in dem Produkt zu vermeiden. "Im wesentlichen rein" bedeutet, dass die letztlich isolierte Substanz das gewünschte Isomere in einer Konzentration von 95 % oder mehr enthält.

Während, wie oben ausgeführt', die individuellen Isomeren als solche wertvoll sind, können sie auch in andere wertvolle Verbindungen übergeführt werden, wie zum Beispiel durch die öffnung des Lactonrings. Wenn zum Beispiel eine alkoholische Lösung der ß-Methylenverbindung mit Kaliumhydroxid erhitzt wird, wird ein Salz der folgenden Formel

CH₂CH₂C-OK

JL

erhalten.

Diese Verbindung ist ein wertvolles Diuretikum. Das ergibt sich aus einer Untersuchung über die Wirksamkeit der Verbindung, den Natrium-zurückhaltenden Effekt des d-Aldosteron zu reduzieren, wodurch das Elektrolytverhältnis in den Nieren von Hunden umgekehrt wird. In dieser Untersuchung

409 83 8/1039

wird eine Gruppe von sechs weiblichen Hunden (mongrels) mit einem Gewicht zwischen 15 und 22 kg verwendet. Die Verbindun-' gen werden in jedem Tier bei zwei verschiedenen Dosierungen getestet, wie auch bei der Standard-Vergleichsverbindung Spironolacton. Kontrollversuche werden durchgeführt, indem man jedes Versuchstier zweimal dem Testverfahren unterwirft, ohne jedoch entweder die erfindungsgemäss Verbindung noch die Standard-Verbindung zu geben. Weitere Kontrollversuche werden durchgeführt, indem das Verfahren wiederholt wird, ohne jedoch die erfindungsgemässe Verbindung, die Standard-Verbindung oder Aldosteron zu geben. Die Reihenfolge, in der die Testversuche an den 6 Versuchstieren durchgeführt werden, ist willkürlich. Die Testversuche folgen in Abständen von mindestens einer Woche, um den Versuchstieren Gelegenheit zu geben, sich von den Wirkungen des vorher verabreichten Aldosteron zu erholen. Die Spironolactondosierungen betragen 2 und 8 mg/kg (mpk). Die Dosierungen der erfindungsgemässen Verbindungen werden so gewählt, dass auf der Grundlage einer vorangehenden Untersuchung an Ratten (wie zum Beispiel beschrieben in US-Patent 3₅422,O96) erwartet werden kann, dass diese Dosierungen Reaktionen hervorrufen, die den mit der Standard-Verbindung erzeugten Reaktionen ungefähr äquivalent sind. Wenn eine Dosis nicht ausreicht, um die Wirkung des Aldosteron zu reduzieren, wird die Untersuchung bei entsprechend höheren Dosierungen wiederholt. Die Hunde werden am Tag vor jedem Test um 4 Uhr nachmittags mit einer regulären Diät gefüttert und danach erhalten sie lediglich Leitungswasser (ad libitum), bis der Test beendet ist. Der Test beginnt mit der intramuskulären Injektion in den Hinterlauf des Tieres von 0,2 ml Sesamöl , in dem lOug d-Aldosteron gelöst sind, falls solches verabreicht werden soll. 30 Minuten später wird die Blase katheterisiert und dann mit 40 ml destilliertem Wasser gespült, worauf die erfindungsgemässe Verbindung oder die Standard-Verbindung, je nach Versuch, in einer Gelatinekapsel oral verabreicht wird; 10 ml/kg Leitungswasser wird dann

A09838/1039

unmittelbar mittels eines Magenschlauches verabreicht. Während der nächsten 2 1/2 Stunden werden alle mit dem Urin ausgeschiedenen Ablagerungen gesammelt und mit dem Urin zusammengegeben, welcher am Ende dieser Zeit und nach weiterer Verabreichung von 5 ml/kg Wasser aus der Blase mittels Katheter entfernt wird. Ausgeschiedener Urin, falls vorhanden, wird wiederum 2 1/2 Stunden lang gesammelt und mit dem Urin vermischt, der aus der Blase mittels Katheter abgezogen wurde. Die zwei Urinproben jedes einzelnen Tieres werden auf Natrium und Kalium analysiert -₃ deren Summe wird ausgedrückt als Mikro-Äquivalente pro kg. Der Vergleich des mittleren Logarithmus (Na χ ΙΟ/Κ)-Verhältnisses - 95 $Confidence-Grenzen, bestimmt aus diesen Summen, dient als Index für die Anti-Aldosteron-Wirksamkeit, Bei der Untersuchung von Kalium-6a,7a-dihydro-17-hydroxy-3-oxo-3^!H-cyclopropa[6,7]-17ft~ppegna-4,6-dien-21-carboxylat ergaben sich die Werte der folgenden Tabelle I.

	.1	0	do	0	mpk	Mittlerer Log (Na χ 10/K)
Tabelle		10 ug	0	mpk	I.272 - O.IO5
Dosis Verbindung Aldosteron Verbindung	do	2	mpk	O.528 - Ο.Ο65
keine (Kontrollversuch)	do	8	mpk	0.900 * 0.160
keine (Kontrollversuch)	Kalium-6a,7a-di- hydro-17-hydroxy- 3-0x0-3'H-cyclopropa- i6,7J-17a-pregna- 4,6-dien-21-carb- oxylat 10 ug	1		I.I27 - 0.210
Spironolacton	do	4	1.012 - Ο.2Ο5
do		1.248 - O.I7O

409838/1039

Aus den Werten der obigen Tabelle ergibt sich,dass 'die Anti-Aldosteron-Reaktion auf die Verbindung des Beispiels 304 % der von Spironolacton ausmacht, bei Confidence-Grenzen (fiducial limits) von 233 - 434 %· Die Umkehrung der Aldosteron-Wirkung war statistisch bemerkenswert bezüglich der Testverbindung und der Standardverbindung (P < 0.05 mit paarweisem t-Test, wobei jeder Hund für seine eigene Kontrolle verwendet wurde).

Die betreffende Verbindung kann in jeder zweckmässigen Art und Weise verabreicht werden, einschliesslich parenteral, obgleich orale Administration in der Form von Tabletten, Kapseln, Lösungen oder Suspensionen bevorzugt wird. Enterisch überzogene Tabletten oder Kapseln haben den weiteren Vorteil, dass sie die Verbindung an den Darmtrakt mit optimaler Absorption im Duodenum und Jejenum abgeben. Typische Trägerstoffe für die Herstellung der Dosierungen sind Wasser, Äthanol, Propylenglykol, Maisöl, Sesamöl, Lactose, Zellulose, Kalziumphosphat, Dikalziumphosphat, Trikalziumphosphatj Natriumsulfat, Kalziumsulfat, Maisstärke, Polyvinylpyrrolidon, Akazin, Methylzellulose, Alkalistearate, wie z.B. Magnesiumstearat, und hydriertes Rizinusöl.

Biologisch wirksame Mengen der VerbindungeRvstimmen sich nach dem Zweck, für den sie verabreicht werden, der betref-. fenden Spasies und der individuellen Empfindlichkeit. Im allgemeinen werden tägliche Dosierungen von 0,2 bis 4,0 mg/kg bei oraler Verabreichung empfohlen.

Bezüglich der Trennung der Lactone wurde gefunden, dass diese Verbindungen Komplexe bilden mit einer Reihe von polyhydroxylierten Verbindungen des Phenoltyps, wie z.B. Hydrochinon, Resorcin, Pyrocatechol, Phlorogluzin und Pyrogallol. Es wurde jedoch gefunden, dass die mit Hydrochinon gebildeten Komplexe physikalische Charakteristiken aufweisen,

409838/1039

die sie besonders geeignet machen für die Trennung der beiden Isomeren. Die erhaltenen Komplexe bestehen im wesentlichen aus 1 Mol Steroid pro 1 Mol Hydrochinon.

Allgemein ausgedrückt, wird bei der Trennung einer Lösung die Mischung der Steroide mit einer Lösung des Hydrochinons behandelt. V/eil der Hydrochinonkomplex der α-Methylenverbindung unlöslicher ist als der der ß-Methylenverbindung, fällt der erstgenannte Komplex aus der Lösung aus. Der Komplex der a-Methylenverbindung fällt nicht vollständig aus, und der Niederschlag enthält gewöhnlich auch etwas an Komplex der ß-Methylenverbindung. Jedoch ergibt ein solches Verfahren einen Niederschlag, der erheblich an <x-Me,thylenverbindung angereichert ist, und es bleibt eine Mutterlauge, die erheblich angereichert ist an ß-Methylenverbindung, im Vergleich zu der ursprünglichen Mischung. Das heisst, die Fällung enthält einen höheren Prozentsatz ' an α-Methylenverbindung als die ursprüngliche Mischung, während die verbleibende Mutterlauge einen höheren Prozentsatz an ß-Methylenverbindung enthält, als in der ursprünglichen Mischung zugegen war. Das Verfahren kann dann, gegebenenfalls mit entsprechenden Anwandlungen, mit jeder der angereicherten Mischungen wiederholt werden und ergibt so Mischungen, die weiter angereichert sind und schliesslich das eine oder andere der beiden Isomeren in im wesentlichen reinen Zustand. Im einzelnen: Wie bereits weiter oben angegeben, enthält der Komplex der a-Methylenverbindung aus der ersten Abtrennung«immer noch beachtliche Teile an ß-Methylenverbindung. Dieser Komplex kann in das freie Steroid zurückgebildet werden durch Behandlung mit einer Mischung aus Natriumhydroxid und Natriumsulfit in wässriger Lösung. Das freie Steroid kann dann, wie vorstehend angegeben, mit Hydrochinon umgesetzt vrerden, bei entsprechender Einstellung auf den anwesenden Anteil an t-Methylenverbindung. Die folgenden Niederschläge können dann wiederum wie oben angegeben

409838/1039

behandelt werden, falls noch nicht im wesentlichen reine a-Methylenverbindung vorliegt. Die Mutterlaugen können entsprechend behandelt werden, falls sie noch nicht im wesentlichen reine ß-Methylenverbindung enthalten.

Die ursprünglichen, der Trennung mittels Hydrochinon unterworfenen Mischungen können Verunreinigungen enthalten, so dass es im allgemeinen wünschenswert ist, jede der Reaktion unterworfene Mischung einer vorangehenden Reinigung zu unterziehen. Das kann auf verschiedene Weise geschehen. So kann zum Beispiel die ursprüngliche der Reaktion zu unterwerfende Mischung mit Benzol oder einer Mischung aus Benzol und Hexan behandelt werden, um Verunreinigungen zu entfernen. Es kann auch die gesamte Reaktionsmischung einer schnellen Chromatographie unterzogen werden. Eine dritte Möglichkeit ist, das ursprüngliche Rohprodukt-öentisch nach einer vorangehenden Reinigung mit Hydrochinon umzusetzen, um so die Komplexe beider Isomerer auszufällen. Der erhaltene feste Komplex wird dann mit einem geeigneten Lösungsmittel behandelt, wie zum Beispiel mit einer Mischung von Diisopropyläther und Isopropylacetat oder Diisopropyläther und Äthylacetat, um so die Verunreinigungen zu lösen; die zurückbleibende Peststoffmischung v/ird dann in das freie Steroid zurückgebildet und dann dem üblichen Trennungsverfahren unterworfen.

In dem allgemeinen Trennungsverfahren werden die Steröidmischung und das Hydrochinon in einem geeigneten Lösungsmittel oder einer Mischung von Lösungsmitteln zusammengebracht. Geeignete Reaktionsmedien sind im allgemeinen solche, die mit Bezug auf die Reaktionspartner inert sind und sie hinreichend lösen, um den Kontakt zwischen ihnen zu erleichtern. Insbesondere sollte das Hydrochinon in einem polaren Lösungsmittel gelöst werden, wie zum Beispiel Isopropylacetat oder Äthylacetat; diese Lösung wird einer Lösung der Steroidmischung in einem polaren oder nicht-polaren Lösungsmittel zugegeben. Wenn ein polares Lösungsmittel zur Lösung des

409838/1039

Steroids verwendet wird, kann es dasselbe sein, das zur Lösung des Hydrochinon verwendet wurde. Wenn ein nichtpolares Lösungsmittel zur Lösung des Steroids verwendet wird, werden Benzol oder eine Mischung aus Benzol und Hexan bevorzugt. Das Reaktionsgemisch wird in der Regel erhitzt ₃ um so den Kontakt zwischen den Reaktionspartnern zu fördernj dann wird es abgekühlt, damit der unlösliche Komplex ausfällt. Geeignete polare Lösungsmittel für das erfindungsgemässe Verfahren sind zum Beispiel Alkylalkanoate der oben beschriebenen Art und auch Alkanole, wie Methanol, Äthanol und 2-Propanol, Alkanone, wie 2-Propanon und 2-Butanoni Alkannitrile, wie Acetonitril, Wasser. Diese polaren Lösungsmittel können alleine oder in Mischung miteinander verwendet werden. Benzol und Hexan wurden als brauchbare nicht-polare Lösungsmittel angegeben. Die nicht-polaren Lösungsmittel können aromatische Kohlenwasserstoffe sein, gegebenenfalls alkylierte, wie zum Beispiel Benzol, Toluol und Xylol, . aliphatische Kohlenwasserstoffe, wie zum Beispiel Hexan, Heptan und Cyclohexane Äther, wie zum Beispiel Dioxan; polyhalogenierte Kohlenwasserstoffe, wie zum Beispiel Methylenchlorid, Dichlormethan, Chloroform und Tetrachlorkohlenstoff. Es können auch Mischungen dieser polaren Lösungsmittel verwendet werden. Die Anwesenheit nichtpolarer Lösungsmittel vermindert die Löslichkeit des gewünschten Komplexes im Reaktionsmedium.

Wie bereits an früherer Stelle angegeben, erlaubt das vorliegende Verfahren eine erfolgreiche Trennung, weil der Kydrochinonkomplex der a-Methylenverbindung unlöslicher ist als der Hydrochinonkomplex der ß-Methylenverbindung unter den hier gewählten Bedingungen. Wie bereits gesagt, wird die Mischung der Isomeren mit Hydrochinon behandelt. Die Menge Hydrochinon kann erheblich variieren. Es wird im allgemeinen bevorzugt, die Menge -(.-Methylenverbindung in der Mischung zu bestimmen und dann eine äquivalente Menge Hydrochinon zuzugeben. Das führt zu der bevorzugten Bildung und Aus-

409838/1039

fällung des Kydrochinonkomplexes der ^-Methylenverbindung. Es kann jedoch selbstverständlich auch eine grössere Menge Hydrochinon verwendet werden, ohne dass dadurch irgend welche besonderen Nachteile in Kauf genommen werden müssen. Die Verwendung eines Überschusses an Hydrochinon würde eine vollständige Komplexbildung sicherstellen, obgleich der Einsatz von mehr Hydrochinon als zur Komplexbildung aller Steroide (beide Isomere) nötig ist, nicht besonders zweckmässig ist. Andererseits würde die Verwendung von weniger Hydrochinon als zur Komplexbildung der gesaraten Menge an a-Methylenverbindung erforderlich ist, immer noch die Fällung und Trennung des Komplexes der ct~Methylenverbindung herbeiführen. Es ist natürlich wünschenswert ₃ nicht einen wesentlichen Unterschuss an Hydrochinon einzusetzen, jedoch wäre das nur insoweit nachteilig, als die Effizienz des Trennungsverfahrens vermindert wird.

Vorzugsweise wird das im voranstehenden Absatz beschriebene Trennungsverfahren nur angewendet, wenn eine Mischung wenigstens 20 % an ^-Methylenverbindung enthält. Wenn das Verfahren auch bei Anwesenheit von weniger ^-Methylenverbindung angewendet v/erden kann, so wird doch sein Trennungs effekt vermindert. In einem solchen Fall wäre es zweckmässiger, ein-Reinigungs- und Trennverfahren zu wählen, mittels dessen die ß-Methylenverbindung oder ihr Komplex ausfällt. Wenn auch die obigen Ausführungen primär auf die anfängliche Trennung der rohen Reaktionsmischung gerichtet sind, so sind sie im Prinzip auch anwendbar auf jede Mutterlauge oder jeden Niederschlag, der während des Trennverfahrens erhalten wird.

Wenn die Konzentration an ß-Methylenverbindung in einer Mischung grosser als 80 % ist, zieht'man es gewöhnlich vor, das Verfahren in der Weise zu modifizieren, dass die Ausfällung des ß-Methylenkomplexes begünstigt wird, so dass sich die I-Iischung daran dann ständig anreichert. In diesem Fall erfolgt eine Ausfällung des ß-Methylenkomplexes, weil

409838/1039

er in wesentlich grösseren Anteilen vorhanden ist und die Verfahrensbedingungen entsprechend modifiziert werden können. Im allgemeinen können die Bedingungen zur Begünstigung der Ausfällung des einen oder des anderen Isomers wie folgt angepasst werden: Der Komplex der ^-Methylenverbindung ist unlöslicher, so dass seine Fällung begünstigt ist, obgleich sie noch weiter begünstigt werden kann dadurch, dass man nur so viel Hydrochinon einsetzt, wie zur Bildung des Komplexes der a-Methylenverbindung erforderlich ist, und durch Impfen der Mischung mit einem Kristall des Komplexes der a-Methylenverbindung. Andererseits kann die Fällung der ß-Methylenverbindung begünstigt werden, indem man genügend Hydrochinon verwendet, um alles anwesende Steroid in den Komplex überzuführen, und indem man die Mischung mit einem Kristall des Komplexes der ß-Methylen-Verbindung impft. Die Fällung des Komplexes der ß-Methylenverbindung wird weiter begünstigt durch die Anwesenheit einer Spur Wasser in der Lösung. Es muss jedoch beachtet werden, dass es in der Regel nötig ist, dass die Mischung wesentlich mit ß-Methylenverbindung angereichert ist (ca. 80 % oder mehr), wenn diese Verfahrensweise für die Fällung des Komplexes der ß-Methylenverbindung zufriedenstellend arbeiten soll.

Wenn die Trennung der Isomeren durch Komplexbildung im wesentlichen bewerkstelligt ist, können die einzelnen angereicherten Materialien mit wässrigem Natriumsulfit und mit Base behandelt werden, um das freie Steroid zu erhalten, das dann umkristalisiert oder anderen Verfahren unterworfen werden kann, um eine gewünschte weitere Reinigung zu erzielen.

Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung der Erfindung, ohne dass die Erfindung auf diese Beispiele beschränkt ist.

409838/10 3 9

Beispiel 1

Das folgende Verfahren wird unter Abschirmung gegen Feuchtigkeit durchgeführt. Eine Mischung aus 42,4 g einer 50 pigen Dispersion von Uatriumhydrid in Petroleum und 506 ml wasserfreiem Dimethylsulfoxid wird erhitzt und bei 40 bis 50 C gerührt, bis kein Wasserstoff mehr entweicht. Die erhaltene dunkle Lösung wird auf 17 C abgekühlt, und es wird dann so viel Tripheny!methan zugegeben, bis sich eine intensive rötliche Färbung einstellt.Dann werden 121 g Trimethylsulfoxoniumchlorid vrährend einer Stunde zugegeben, wobei die Temperatur auf l6 - 20 C gehalten wird. Wenn die exotherme Reaktion beendet ist und die rötliche Färbung verschwindet, wird das Kühlbad entfernt, und man lässt die Mischung während 20 Minuten auf Zimmertemperatur erwärmen. Die erhaltene Mischung wird in inerter Atmosphäre gefiltert und die getrennten' Feststoffe werden viermal mit trockenem Dimethylsulfoxid gewaschen.

Das gemäss vorstehendem Absatz erhaltene Filtrat wird in inerter Atmosphäre gehalten und auf 17 °C abgekühlt. 200 g 17-Hydroxy-3-oxo-17a-pregna-4,6-dien-21-carboxylsäure-Y-lacton werden während 2 Minuten zugegeben. Die entstehende Aufschlämmung wird bei I3 - 15 ⁰C eine Stunde lang gerührt und dann auf 25 - 27 °C erwärmt und bei dieser Temperatur v/eitere 37 Stunden gerührt. Die erhaltene rotbraune Lösung wird in 8 Liter Eiswasser unter Rühren gegossen. Der sich bildende weisse Niederschlag wird durch Filtrieren entfernt und bis zur Alkalifreiheit gründlich mit Wasser gewaschen.

Das alkalische wässrige Filtrat wird mit Essigsäure angesäuert und der sich bildende weisse niederschlag wird durch Filtrieren abgetrennt und mit Wasser gewaschen. Die Feststoffe werden dann in 250 ml Äthanol, das eine Spur Salzsäure enthält, gelöst. Die Lösung wird bei Zimmertemperatur

SjO/ "039

eine Stunde lang gerührt, und es werden dann 5 nil einer 10 #igen wässrigen Kaliumbicarbonatlösung zugegeben. The Flüssigkeit wird dann unter vermindertem Druck abgedampft und der Rückstand xvird in Benzol gelöst und zweimal mit wässriger 10 #iger Kaliumbicarbonatlösung gewaschen, gefolgt von 4 Waschvorgängen mit Wasser und Trocknen über Natriumsulfat. Nach Abdampfen des Benzols bleibt ein weisser Feststoff, der mit dem zuerst erhaltenen Niederschlag vereinigt wird. Die so erhaltenen Feststoffe sind eine Mischung von 6a,7a- und 6ß,7ß-Dihydro-17-hydroxy-3~oxo-3 'H-cyclopropat 6 ₃7]-17a-pr"egna-4,6-dien-21-carboxylsäure-γ-lacton mit geringen Anteilen an nicht umgesetztem Ausgangsmaterial und einigen anderen Verunreinigungen.

Beispiel 2A

Die nach Beispiel 1 erhaltenen Feststoffe werden mit einmal 1000 ml und viermal 500 ml siedendem Benzol extrahiert. Unlöslicher brauner Teer und eine wässrige Schicht werden abgetrennt und verworfen. Die vereinigten Benzollösungen werden dann mit weiteren 400 ml Benzol vermischt und unter Rückfluss gerührt. Zu dieser Lösung werden schnell 3400 ml heisses Hexan zugegeben. Es schlägt sich ein gelber Teer nieder. Die Mischung wird 30 Minuten lang heiss gerührt und man lässt sie dann allmählich abkühlen, schliesslich in einem Kühlschrank. Die farblose obenschwimmende Flüssigkeit xvird dekantiert und der unlösliche braune Rückstand wird mit 70 ml einer Benzol/Hexan-Mischung (Verhältnis 1:1) gespült. Der verbleibende Teer wird mehrmals mit einer Mischung aus heissem Benzol und heissem Hexan extrahiert und der so erhaltene Extrakt wird der ursprünglichen Mischung zugefügt, nachdem man zuvor abgekühlt und von etwa weiter angefallenem Teer getrennt hat. Die Analyse eines aliquoten Teils dieser Lösung mittels Gas-Flüssig-Chrorriatographie ergab, dass sie 70,1 % 6_a,7'x-Dihydro-17-hydroxy-3-oxo-3^IH-cyclopropa[6_J7j-17a-pregna-4,6-dien-21-carboxylsäure-Y-lacton, 28,4 % des 6ß₅7ß-Dihydro-Isomeren, 1,4 % nicht umgesetztes Ausgangs-

409338/1039

material und geringe Anteile nicht aufgeklärter Verunreinigungen enthielt.

Nach einer alternativen Verfahrensweise wird der gemäss Beispiel 1 erhaltene rohe Feststoff mit Imal 400 ml und 4mal 100 ml Benzol extrahiert. Die vereinigten Benzolextrakte v/erden mit 4mal 50 ml Wasser gewaschen und von etwaigen Teerrückständen getrennt. Die Benzollösung wird dann über Natriumsulfat getrocknet und auf etwa die Halte ihres ursprünglichen Volumens konzentriert. Die so erhaltene Lösung wird dann mit Hydrochinon behandelt, und zwar in derselben Weise wie das gemäss dem ersten Absatz dieses Beispiels erhaltene Material, um so eine Trennung zu erzielen.

Beispiel 2B

Die gemäss dem ersten Absatz des Beispiels 2A erhaltene-Lösung v/ird gerührt-und unter Rückfluss erhitzt, während eine Lösung von 16 g Hydrochinon in 89 ml Isopropylacetat zugegeben wird. Ungefähr 20 % der Hydrochinonlösung v/erden schnell zugegeben und erzeugen eine geringe bleibende Trübung, jedoch wird die Zugabe des Hydrochinons ungefähr 5 Minuten fortgeführt. In dieser Zeit bilden sieh weisse Kristalle. Es wird dann die Zugabe von Hydrochinon wieder aufgenommen, und zwar in solchen Anteilen und Abständen, dass der Komplex ohne andauernde Trübung der Lösung auskristallisiert. Die Mischung wird dann unter Rückfluss weitere 2 Stunden gerührt und die dichte weisse Peststoffmasse uird durch Filtrieren getrennt und mehrere Male mit einer heissen Benzol/Hexan-Mischung (Verhältnis 1:1), enthaltend wenig Wasser, gewaschen. Die Analyse dieser Feststoffe mittels Gas-Flüssig-Chromatographie ergibt, dass sie als 1:1-Komplex mit Hydrochinon 59 ₃ 2 % der α,-Methylenverbindung und 39j8 % der ß-Methylenverbindung enthalten und ausserdem L % nicht umgesetztes Ausgangsmaterial.

409838/103 9

" ¹⁵ - 2A10853

Das so erhaltene Piltrat lässt man 16 Stunden lang stehen; während dieser Zeit fallen !weitere Feststoffe aus. Die Lösung wird dekantiert und mittels Gas-Flüssig-Chromatographie analysiert. Es ergibt sich ein Steroidgehalt von 84j7 % ß-Methylenverbindung, 13,6 % α-Methylenverbindung und 1,7 % nicht umgesetztes Ausgangsmaterial.

Beispiel 2C

Die nach Beispiel 2B erhaltene End-Lösung wird mit einem Teil "Wasser vermischt und unter Rückfluss gerührt. Dann wird eine heisse Lösung von J>6,4 g Hydrochinon in ISO ml Isopropylacetat zugefügt ₃ und zwar in solcher V/eise, dass eine Fällung erfolgt, bevor der Hauptanteil der Lösung während weiterer 2 1/2 Stunden zugegeben wird. Die Mischung wird unter Rückfluss 2 1/2 Stünden gerührt und dann werden die Feststoffe durch Filtration abgetrennt. Der Feststoff ₃ der ein l:l-Komplex von Hydrochinon und Steroid ist, wird mittels Gas-Flüssig-Chromatographie analysiert. Die Analyse ergab 95,3 % ß-Methylenverbindung, 4,5 % α-Methylenverbindung und 0,2 % nicht umgesetztes Ausgangsmaterial.

Beispiel 2D

Die nach Beispiel 2C und am Ende des Beispiels 2B erhaltenen Feststoffe werden vereinigt und mit 80 ml einer Mischung von Diisopropyläther und Isopropylacetat (Verhältnis 1:3) eine Stunde lang erhitzt. Die Mischung wird dann in einem Kühlschrank 5 Stunden lang gekühlt und der Feststoff wird durch Filtrieren abgetrennt. Der Feststoff wird dann mit 1700 ml Isopropylacetat vermischt;,und eine Mischung von 40 ml 10 #iger wässriger Natriumsulfitlösung und l60 ml 5 $iger wässriger rlatriumhydroxidlosung werden bei Raumtemperatur zugegeben, bis sich der Feststoff löst. Die wässrige Schicht wird dann abgetrennt und die organische Schicht wird 5mal mit einer v/äs sr igen Lösung von Natriumsulfat und Natrium hydroxid- gewaschen. Die organische Schicht ifird dann weiter

0 9 8 3 8/1039

mit V/asser bis zum lieutralpunkt gewaschen und dann über Natriumsulfat getrocknet. Die Lösung wird dann unter Normaldruck konzentriert bis zum Eintritt der Kristallisation, danach wird sie et v/a 45 Minuten bei Zimmertemperatur gehalten. Die gelbe oben schwimmende Flüssigkeit wird dekantiert j der weisse Rückstand wird mit einer Mischung aus Isopropyläther und Isopropyl'acetat dekantiert. Der Peststoff wird dann getrocknet und mittels Gas-Flüssig-Chromatographie analysiert. Er ergibt einen Gehalt von 94,7 % ß-Methylenverbindung, 4,9 % α-Methylenverbindung und O₃4 % Ausgangsmaterial. Eine zxneite Umkristallisierung aus Isopropylacetat ergibt einen Feststoff, der bei 176-5 bis I78 ⁰C schmilzt und 96,8 % der ß-Methylenverbindung, wie mittels Gas-Flüssig-Chromatographie festgestellt, enthält.

Beispiel 2E

gemäss dem ersten Absatz des Beispiels 2B erhaltene Feststoff wird 4 Stunden lang in Benzol unter Rückfluss erhitzt; dann wird ein gleiches Volumen Hexan hinzugefügt und die Rückflusserhitzung wird für eine weitere Stunde fortgesetzt. Die erhaltene Mischung wird gefiltert und der abgetrennte Feststoff wird 3 v/eitere Male mit Benzol und Hexan behandelt. Der erhaltene Feststoff besteht zu 91,5 % aus dem Hydrochinon-Komplex von 6T.3 7a-Dihydro-17-hydroxy-3-oxo-3 'H-cyclopropa-(]6,7]-17a-pregna-4,6-dien-21-carboxylsäure-Y-lacton, wie mittels Gas-Flüssig-Chromatographie festgestellt wurde. Die erhaltenen Fitrate wurden vereinigt und nach Abdampfen des Lösungsmittels verblieb ein Feststoff, der 71j6 % des Komplexes der ß-Methylenverbindung, 26,0 % des Komplexes der a-Methylenverbindung und 0,2 % nicht umgesetztes Ausgangsmaterial enthielt.

Der zu 91₃5 % reine Komplex der a-Methylenverbindung wird rückgewandelt in das freie Steroid mittels Behandlung mit

0 9 8 3 8/1 0 3 9

wässrigem Matriunisulfit und Natriumhydroxid;, wie in Beispiel 2D beschrieben. Dieses Material wird wiederholter Behandlung mit Hydrochinon unterworfen und ergibt 97 #ig reine α-Methylenverbindung, die bei ungefähr 216 - 217,5 °C schmilzt. Daran schliesst sich eine. Rückbildung in das freie Steroid und ergibt 96 ₃ 9 #ig reine a~Methylenverbindung, die bei 173 - 17*1,5 ⁰C schmilzt. Pur die ersten drei Behandlungen mit Hydrochinon wird als Lösungsmittel eine Mischung aus Benzol und Isopropylacetat verwendet., während für die vierte und letzte Behandlung mit Hydrochinon Isopropylacetat allein verwendet wird.

Alternativ kann der ursprüngliche nichtaufbereitete Komplex dieses Beispiels durch Behandlung mit wässrigem Natriumsulfit und Natriumhydroxid in das freie Steroid umgewandelt werden ₃ das dann wiederholter Behandlung mit Hydrochinon unterworfen wird, gefolgt von einer Rückwandlung in das freie Steroid ₃ um so im wesentlichen reine α-Methylenverbindungen zu ergeben.

Beispiel 3

200 g l7-Hydroxy-3-oxo-17a-pregna-4₃6-dien-21-carboxylsäure-y-lacton werden entsprechend Beispiel 1 mit Dimethylsulfoxoniummethylid umgesetzt. Das erhaltene Rohprodukt wird in wenig heissem Benzol gelöst, mit Wasser gewaschen und dann über Natriumsulfat getrocknet. Die erhaltene Benzollösung wird erhitzt und dann mit einerjheissen Lösung von 59 g Hydrochinon in 175 ml Äthylacetat behandelt. Das Lösungsmittel wird dann unter vermindertem Druck abgedampft und der braune gummiartige Rückstand wird auf dem Dampfbad in einer Lösung von Isopropyläther/Isopropylacetat (Verhältnis 1:2) zerrieben. Dadurch wird das teerige Material gelöst, die Mischung wird filtriert und der abgeschiedene Feststoff wird mit Isopropyläther/Isopropylacetat gewaschen.

8 3 3/103 V

Der Peststoff wird dann in I3OO ml Äthylacetat gelöst, 3OO Volumenteile einer wässrigen Lösung von 5 $igem Natriumhydroxid und 5 tigern Natriumsulfit werden zugefügt und die Mischung wird gerührt. Die Äthylacetatschicht wird dann abgetrennt und 3mal mit Natriumhydroxid/Natriumsulfit gewaschenj anschliessend mit Wasser. Das Lösungsmittel wird dann unter vermindertem Druck abgedampft und hinterlässt einen Rückstand von α-Methylenverbindung und ß-Methylenverbindung.

Die erhaltene Mischung wird in 240 ml heissem Benzol gelöst und eine heisse Lösung von 10 g Hydrochinon in 35 ml Isopropylacetat wird zugefügt. Die Mischung lässt man dann auf Zimmertemperatur abkühlen. Ein Kristall des Komplexes der ^-Methylenverbindung wird" zugegeben und man lässt die Mischung bei Zimmertemperatur 16 Stunden lang stehen; während dieser Zeit fällt der Kydrochinon-Komplex der nt-Methylenverbindung aus. Der grössere Teil der Flüssigkeit wird durch Dekantieren entfernt, der Peststoff wird filtriert und mit Benzol gewaschen. Das Piltrat wird mit der dekantierten Flüssigkeit vereinigt und dann mit 10 g Hydrochinon in wenig heissem Isopropylacetat behandelt. Die Mischung wird geimpft mit einem Kristall des Hydrochinon-Komplexes der ß-Methylenverbindung und die Mischung wird dann l6 Stunden lang stehen gelassen. Der erhaltene Niederschlag wird durch Filtration getrennt und dann mit Benzol gewaschen und ergibt die ß-Methylenverbindung als Hydrochinon-Komplex in 97,5 $iger Reinheit; der Schmelzpunkt liegt bei 167,5 bis 170°C.

Beispiel H

Zu einer Mischung von 100 Teilen 6nc ,7a~Dihydro-17-hydroxy-3-0x0-3 'H-cyclopropa[ 6,7 j-lJ-x-pre^na-H j6-dien-21-carboxylsäure-y-lacton und 9o0 Teilen 2-Propanol wird eine Mischung von 15 Teilen Kaliumhydroxid in 100 Teilen Wasser gegeben. Die Mischung wird bis zum Siedepunkt unter Rückfluss in Stickstoffatmosphäre eine Stunde lang erhitzt; in dieser

409330/10 3 9

Zeit erfolgt Lösung. Das Lösungsmittel wird daraufhin durch Vakuumdestillation abgezogen, und* der Rückstand wird abgekühlt und mit Äthylacetat aufgeschlämmt. Das von der Schlämmung mittels Filtrieren isolierte kristalline Material ist Kalium-6a_J7a-dihydro-17-hydroxy-3-oxo-3^lH-cyclopropa[6_J7J- 17nf-pregna-4,6-dien-21-carboxylat ₃ das nach Trocknung an der Luft bei 248 - 25O°C unter Zersetzung schmilzt.

409838/1039

Claims (1)

1. Patentansprüche

   1. Verfahren zur Isolierung von 6a^a-Di
   3-oxo-3'H-cyclopropa[6,7]-17'x-pregna-ⁱi ,6-aien-21~earboxylsäure-Y-lacton und 6ßj7ß-Dihydro-17-hydroxy-3-öxo-3'H-cyclopropa[6,7j-17a~pregna-^,6-dien-21-earboxylsäure-Y-lacton aus einer Mischung, die im v/esentliehen nur aus
   diesen !zwei Verbindungen besteht, dadurch gekennzeichnet, dass die Mischung der beiden Isomeren mit Hydrochinon

   in einem Medium behandelt wird, das ein polares Lösungsmittel, wie Alkanole, Alkylalkanoate, Alkanone, Alkannitrile, V/asser oder deren Mischungen und gegebenenfalls
   ein nichtpolares Lösungsmittel, wie gegebenenfalls alkyliertes Benzol,"Alkane, Cycloalkäne, Dioxan, polyhalogenxerte Kohlenwasserstoffe oder deren Mischungen enthält, unter
   Bildung eines schwer löslichen Komplexes.

   2. Verfahren zur Isolierung von angereichertem 6fx_>7a~Di~ hydro~17-hydroxy-3-oxo-3'H-cyclopropa[6,7]-17a-pregna-i}_J6-dien-21-carboxylsäure-v-lacton aus einer niehtaufbereiteten Mischung, die im wesentlichen nur 6α>7α- und 6fö,7ß-Dihydro-17-hydroxy-3~oxo-3^lH-cyclopropa[6₃,7]~17'x~pi'egna~4,6-dien-21-cat⁴boxylsäure-Y-lacton enthält, dadurch gekennzeichnet, dass eine mindestens 20 % 6ß,7ß-Dihydro-17-hydroxy-3-oxo-3^tH-cyclopropaC6,7]-17ft-pz'egna-ⁱi,6~dien-21-carboxylsäure-Y-lacton enthaltende Mischung mit einer der 6ß,7ß-Dihydroverbindung annähernd äquivalenten Menge Hydrochinon in einem Medium behandelt v/ird, das ein polares Lösungsmittel, wie Alkanole, Alkylalkanoate, Alkanone, Alkannitrile, Wasser
   oder deren Mischungen und ein nichtpolares Lösungsmittel, wie alkyliertes oder nicht-alkyliertes Benzol, Alkane, Cycloalkane, Dioxan, polyhalogenierte Kohlenwasserstoffe oder
   deren Mischungen enthält, unter Bildung eines schwer löslichen Komplexes der 6ß,7ß-Dihydroverbindung, dass ferner der Niederschlag abgetrennt und eine an 6<x,7a~Dihydro-17~ hydroxy-3~oxo-3^fH-cyelopropaCo,73-17f-pregna-4,6-dien-21-

   409838/1039

   carboxylsäure-y-lacton angereicherte Lösung erhalten wird.

   3· Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet ₃ dass das Reaktionsmeaium aus einer Mischung aus Benzol und lso~ propylacetat besteht.

   *}. Äquimolekularer Komplex von 6ß_i7ß~Dihydro-17-hydraxy~3-oxo-3'H-cyclopropa[6,7]-17a~pregna-4,6-dien-2l·carboxylsä^re■ γ-lacton mit Hydrochinon.

   5· Äquimolekularer Komplex von 6a>7a-Dihydro-17-hydroxy-3-0x0-3' H-cy clopropa[ 6 ₃ 7 3-17a-pregna-ⁱ} ₃ 6-dien-21-carboxylsäure-y-lacton mit Hydrochinon.

   6. Mischung aus den Komplexen gemäss Ansprüchen 4 und 5»

   Für:' G.D» Searle

   Skokie, 111.^V.St.A.

   Dr. H. J U/o Iff Rechtsanwalt

   409838/1039-