DE1043585B

DE1043585B - Verfahren zur Gewinnung von hochaktivem ACTH

Info

Publication number: DE1043585B
Application number: DEV9930A
Authority: DE
Inventors: Dr Gerhardt Schaefer
Original assignee: Arzneimittelwerk Dresden GmbH
Current assignee: Teva GmbH
Priority date: 1955-12-22
Filing date: 1955-12-22
Publication date: 1958-11-13

Description

Verfahren zur Gewinnung von hochaktivem ACTH Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung hochaktiver Präparate des adrenocorticotropen Hormons des Hypophysenvorderlappens.
Es ist bekannt, daß man aus den Vorderlappen der Hypophyse ein Hormon isolieren kann, daß die Nebennierenrinde stimuliert. Dieses Hormon, das ACTH, hat in den letzten Jahren erhebliche Bedeutung für die Therapie und Diagnostik erlangt.
Die bekannten Herstellungsverfahren für dieses Hormon lehnen sich eng an die modernen Methoden der Eiweißfraktionierung an. Nach diesen Methoden wird das Ausgangsmaterial, und zwar Hypophysen vom Schwein, Schaf, Wal oder Rind, mit stark saurem wäßrigem Aceton mehrfach extrahiert. Aus den vereinigten Extrakten wird dann die ACTH-haltige Fraktion durch Erhöhung der Acetonkonzentration gewonnen. Aus dem so gewonnenen Rohhormon (Acid acetone powder) mit durchschnittlich 0,5 IE/mg wird entweder durch p$ Verschiebung oder durch fraktioniertes Aussalzen der Hauptteil der übrigen Vorderlappenhormone ausgefällt. Dem gereinigten und dialysierten Extrakt wird dann das ACTH durch Ausfällen tnit Aceton in weiter angereicherter Form entzogen (etwa 2IE/mg). Es enthält in dieser Form noch erhebliche Mengen Hypophysenhinterlappenhormone sowie kleine Mengen von Wachstumshormonen, Lactationshormon und gonadotropen Hormonen, Diese Begleitstoffe werden durch eine Säure-Hitze-Behandlung zerstört. Es ist jedoch nicht zu vermeiden, daß durch diesen Arbeitsgang auch ein gewisser Prozentsatz des ACTH inaktiviert wird (L i , L i d d 1 e, Reinhard und Bennet, Proc. soc. exp. biol. a. med., 78 S.665 [1951]).
Es ist bekannt, daß man die weitere Anreicherung des ACTH auf verschiedene Weise vornehmen kann, z. B. durch Adsorption an Kationenaustauscher (White, J. Am. chem. soc., 75, S. 503 [1953]; USA.-Patentschrift 2 669 536) oder durch Hydrolyse des ACTH mittels Säure oder Pepsin und anschließende Chromatographie (P a y n e, Raben und A s t w o o d , J. biol. Chemistry, 187, S. 719 [1950]).
Nach Heß, Carpentier und Li (J. Am. chem. Soc., 74, S. 4971 [1952]) wird für die Fraktionierung des ACTH ein bereits weitgehend gereinigtes Produkt eingesetzt und die letzte Reinigung mittels Verteilungs-Chromatographie auf Cellulosesäulen durchgeführt, ein Verfahren, das für die technische Herstellung wenig geeignet ist.
Des weiteren ist bekannt, daß sich für die Anreicherung die Adsorption an Oxycellulose besonders günstig erweist und diese Reinigungsmethode Präparate mit einem sehr hohen Reinheitsgrad ergibt, so daß sie auch für die intravenöse Injektion ohne Nachteil verwendet werden können (Astwood, Raben, P a y n e und G r a d y, J. Am. chem. Soc., 73, S. 2969 [1951]).
Die Herstellung hochgereinigter ACTH-Präparate nach den bekannten Verfahren ist sehr langwierig und kostspielig. Außerdem werden durch den langen Aufarbeitungsvorgang die Ausbeuten an reinem Hormon herabgemindert. Alle bisher bekannten Verfahren gehen von vorgereinigten Präparaten aus.
Es wurde nun gefunden, daß man den Aufarbeitungsvorgang verkürzen, die Ausbeuten an reinem Hormon steigern und dabei ein hochaktives ACTH gewinnen kann, wenn man das aus Gesamt-Hypophysen in bekannter Weise gewonnene Rohhormon ohne Zwischenreinigung in 0,1 molorem C H.C O O H löst, bei pA 3 bis 4 an Oxycellulose adsorbiert, das Adsorbat mit verdünnter H,CI eluiert und aus dem Eluat das hochaktive Hormon mit tiefgekühltem Aceton fällt.
Das so gewonnene ACTH ist frei von Beimischungen anderer Hypophysenhormone. Diese Tatsache erweist sich als besonders günstig, da vor allem die Hypophysenhinterlappenhormone den ACTH-Präparaten hartnäckig anhaften und nur durch sehr komplizierte und verlustreiche Fraktionierungsmaßnahmen zu entfernen sind.
Das erfindungsgemäße Verfahren gestattet weiterhin, aus den nicht adsorbierten Teilen des Rohpulvers weitere Hypophysenhormone zu isolieren und für die Therapie nutzbar zu machen, während sie bei den bekannten Verfahren durch Erhitzen mit Säure zerstört werden müssen, wobei gleichzeitig ein Teil des ACTH inaktiviert wird. Beispiel 0,5 kg frische, gefrorene Gesamthypophysen vom Schwein werden möglichst fein zerkleinert und in 21 eines Gemisches aus 21 Aceton, 0,251 Wasser und 50 ml konzentrierter Salzsäure suspendiert. In diese Mischung wird so lange feste Kohlensäure eingetragen, bis sich die Mischung auf -20 bis -25° C abgekühlt hat. Das Gemisch wird -dann auf dem siedenden Wasserbad innerhalb 20 Minuten auf 20° C gebracht und anschließend 1 Stunde kräftig gerührt. Nach der Filtration wird der Rückstand nochmals mit 11 80"/oigem Aceton 1 Stunde extrahiert. Die vereinigten Extrakte werden in 15 i auf -5° C abgekühltes Aceton gegossen. Nachdem Absitzen wird der Niederschlag nach gründlichem Waschen mit Aceton im Vakuum getrocknet. Ausbeute: etwa 16 g Rohpulver mit etwa 1;5IE/mg.
Das Pulver wird in 500m1 0,lmolarer Essigsäure gelöst und das pH der Lösung auf 3,0 bis 4,0 eingestellt. Zu dieser Lösung gibt man 1,5 g Oxycellulose mit einem Karboxylgehalt von 11 bis 12%, die man vorher mit 0;1motarer Salzsäure, Wasser und 0,1molarer Essigsäure ausgewaschen hat. Die Mischung_ wird bei Zimmertemperatur 24 Stunden gerührt. Dann wird die Oxycellulose abfiltriert und intensiv erst mit O,lmolarer Essigsäure und dann mit destilliertem Wasser gewaschen. Die Lösung wird nochmals 12 Stunden mit 0,8 g Oxycellulose gerührt, filtriert und die Oxycellulose wie oben mit Essigsäure und Wasser gewaschen.
Die Oxycellulose wird in 250 ml O,lmolarer Salzsäure suspendiert und unter kräftigem Rühren 12- Stunden -extrahiert. Die Mischung wird filtriert und in die 12fache Menge auf -5° C abgekühltes Aceton gegossen. Den ausfallenden Niederschlag läßt man absitzen, gießt das überstehende Aceton ab und zentrifugiert den Rest. Das Hormon wird im Zentrifügenglas mehrmals mit absolutem Aceton gewaschen und dann im Vakuum getrocknet. Ausbeute: 0,35 g mit etwa 30 IE/mg, insgesamt 10 500 IE. Demnach werden etwa 90% des im Rohpulver vorhandenen Hormons in hochgereinigter Form gewonnen.

Claims

PATENTANSPRUCH: Verfahren zur Gewinnung von hochaktivem ACTH, dadurch gekennzeichnet, daß man das aus Gesamthypophysen in bekannter-Weise gewonnene Rohhormon ohne Zwischenreinigung, gelöst in 0,lmolarem C H3 C O OH, bei pg 3 bis 4 an Oxycellulose adsorbiert, das Adsorbat mit verdünnter H Cl eluiert und aus dem Eluat das hochaktive Hormon mit vorgekühltem Aceton fällt. In Betracht gezogene Druckschriften: Heß, Carpentier und Li, J. Americ. chem. Soc., 74, S. 4971 (1952) ; Payne, Raben und Astwood, J. biol. Chemistry, 187, S. 719 (1950).