DE1793623B2 - Verfahren zur herstellung von prostaglandinen - Google Patents
Verfahren zur herstellung von prostaglandinenInfo
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C405/00—Compounds containing a five-membered ring having two side-chains in ortho position to each other, and having oxygen atoms directly attached to the ring in ortho position to one of the side-chains, one side-chain containing, not directly attached to the ring, a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, and the other side-chain having oxygen atoms attached in gamma-position to the ring, e.g. prostaglandins ; Analogues or derivatives thereof
-
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- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P31/00—Preparation of compounds containing a five-membered ring having two side-chains in ortho position to each other, and having at least one oxygen atom directly bound to the ring in ortho position to one of the side-chains, one side-chain containing, not directly bound to the ring, a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, and the other side-chain having at least one oxygen atom bound in gamma-position to the ring, e.g. prostaglandins
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Description
in welcher η eine Zahl zwischen 0 und 7, ρ eine säure (PGE3);
Zahl zwischen 2 und 6 und g eine Zahl zwischen i. UQd Prostaglandine F ^ F K (^ ^8 PQF1* und
0 und 12 darstellen, wobei die Gesamtzahl der pGF he^chnet)> namlich
Kohlenstoffatome in dem Molekül 18 bis 22, r "
vorzugsweise 20, beträgt mit tierischem Gewebe 9a,lla,15-Trihydroxy-prostl3-en-säure (PGFxa)
aus sekundären Geschlechtsdrüsen, Thymusdrüsen, und
Iris, Lungen, Eingeweiden, Pankreas, Neben- 15 ga.lla.lS-Trihydroxy-prosta-S.lS-dien-sfare
nieren oder Gehirn, oder aus solchem Gewebe (PGF <Y
hergestellten Zubereitungen in Anwesenheit von
Sauerstoff bei einem pH-Wert des Umsetzungs- PGE1, PGE2, PGE3 und PGF1* zeigen eine kontra-
mediums von 7 bis 9 und bei einer Temperatur hierende Wirkung auf glatte Muskeln und eine hypo-
von 10 bis 60°C behandelt wird. 20 tensive Aktivität, jedoch ist PGE2 bislang die aktivste
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn- Verbindung.
zeichnet, daß als Ausgangsfettsäure Gesai.it-cis- Die Prostaglandine sind durch Extraktion von
Eicosan-8,ll,14-triensäure, Gesamt-cis-Eicosan- Drüsengewebe von Säugetieren, insbesondere von
5,8,11,14-tetraensäure oder Gesamt-eis-N onade- Geschlechtsdrüsengewebe, wie von Samendrüsen iso-
can-7,10,13-triensäure verwendet werden. 25 liert worden. Es wurde festgestellt, daß die Ausbeute
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch an Prostaglandin aus diesen Quellen gesteigert werden
gekennzeichnet, daß als Gewebe Samendrüsen von konnte durch Zusatz kleiner Mengen an L»etergentien
Schafen verwendet werden. oder spezifischen Enzymen, insbesondere solchen mit
Esteraseaktivität. Die gesteigerten Ausbeuten wurden
30 zurückgeführt auf eine Desintegration der Zellmem-
branen oder auf eine Freisetzung der Prostaglandine,
die in gebundener Form in dem Gewebe vorliegen. Dieser Zusatz von Detergentien oder spezifischen
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Her- Enzymen, der eine verbesserte Extraktionsausbeute
stellung von Prostaglandinen. 35 liefert, stellt jedoch nur eine Verbesserung bei der
In der Samenflüssigkeit von Menschen und ver- Freilegung des aktiven Prinzips dar, welches als solches
schiedenen Tieren sind Hydroxycarbonsäuren mit vorliegen muß.
pharmakodynamischer Wirkung, z. B. hypertensiver Erfindungsgemäß werden nun Prostaglandine und
oder hypotensiver Aktivität und die glatte Muskulatur verwandte Hydroxycarbonsäuren nach einem biostimulierender
Aktivität festgestellt worden Die 40 synthetischen Verfahren hergestellt, das darauf beruht,
aktive Substanz, Prostaglandin genannt, wurde in daß Vorläufer unter bestimmten Bedingungen tieriverschiedenen
sekundären Geschlechtsorganen, ins- schem Gewebe oder daraus hergestellten Präparaten,
besondere in den Prostatadrüsen (glandulae vesicalis die in der Lage sind, Hydroxycarbonsäuren des
und ampullae ductus) festgestellt, jedoch auch in angegebenen Typs aus diesen Vorläufern zu synanderen
Organen, wie der Thymusdrüse, der Iris und 45 thetisieren, zugesetzt werden.
den Lungen. Die Samendrüsen von Schafen erwiesen Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung
sich als besonders reich an Prostag'andin, jedoch ent- von Prostaglandinen ist dadurch gekennzeichnet, daß
halten auch die Drüsen anderer Säugetiere wesentliche eine Gesamt-cis-Fettsäure der allgemeinen Formel
Mengen von Prostaglandin.
Mengen von Prostaglandin.
Es wurde gefunden, daß das wirksame Prinzip, das 50 CH3-(CH2)„-(CH^CH-CH2)p-(CH2)q-COOH
Prostaglandin, eine Reihe ungesättigter, nichtaromatischer Hydroxycarbonsäuren enthält, die alle in welcher η eine Zahl zwischen 0 und 7. ρ eine Zahl verwandt sind mit der nachstehenden Stammsäure, zwischen 2 und 6 und q eine Zahl zwischen 0 und 12 der 7-(2'-Octyl-cyclopentyl)-heptansäure, die Prostan- darstellen, wobei die Gesamtzahl der Kohlenstoffatome säure genannt wird und die folgende Strukturformel 55 in dem Molekül 18 bis 22, vorzugsweise 20, beträgt besitzt (konventionelle Numenerung der Kohlen- mit tierischem Gewebe aus sekundären Geschlechtsstoffatome): drüsen, Thymusdrüsen, Iris, Lungen, Eingeweiden,
Prostaglandin, eine Reihe ungesättigter, nichtaromatischer Hydroxycarbonsäuren enthält, die alle in welcher η eine Zahl zwischen 0 und 7. ρ eine Zahl verwandt sind mit der nachstehenden Stammsäure, zwischen 2 und 6 und q eine Zahl zwischen 0 und 12 der 7-(2'-Octyl-cyclopentyl)-heptansäure, die Prostan- darstellen, wobei die Gesamtzahl der Kohlenstoffatome säure genannt wird und die folgende Strukturformel 55 in dem Molekül 18 bis 22, vorzugsweise 20, beträgt besitzt (konventionelle Numenerung der Kohlen- mit tierischem Gewebe aus sekundären Geschlechtsstoffatome): drüsen, Thymusdrüsen, Iris, Lungen, Eingeweiden,
Pankreas, Nebennieren oder Gehirn, oder aus solchem
H H Gewebe hergestellten Zubereitungen in Anwesenheit
ao W-Ki ! i 7-2 ι >f® 6° von Sauerstoff bei einem pH-Wert des Umsetzungs-
CH3 — (CH2), l2C 8C— (CH2)e — C. mediums von 7 bis 9 und bei einer Temperatur von
"I j OH 10 k's 6^°C behandelt wird. Die Umsetzung wird
,CH2 »CH2 bewirkt mit Hilfe der in diesen Geweben vorhandenen
\χ / En;-ymsysteme. Homogenisate oder Stücke der oben-
IuCH2 65 erwähnten Gewebe, insbesondere der Samendrüsen
von Schafen, können verwendet werden.
Die folgenden Prostaglandine sind identifiziert Wichtige Säuren und ihre Derivate, die für die
worden: Biosynthese in der oben beschriebenen Weise ver-
wendet werden können, sind folgende essentielle die Ausbeuten bei Einsatz der gleichen Gewebemenge
Fettsäuren: bei dem erfindungsgemäßen Verfahren um ein Viel-
Homo-y-Linolensäure (Gesamt-cis-Eicosan- faches h.öhjir· Das erfmdungsgemäße Verfahren ^röff-
8 1114-triensäure) net somit d'e Moghchkeit der Herstellung der Prosta-
Arächldonsäure (Gettunt-cis-Eicosan- 5 $mai™ ΪΞ einem Maßstab· d<* ψ ihre Nutzanwen-
5,8,11,14-tetraensäure), dung als Therapeutika notwendig ist.
Gesamt-cis-Eicosan-S.S.ll.W.n-pentaensäure, Die Biosynthese gemäß vorliegender Erfindung wird
Gesamt-cis-Nonadecan-T.lO.B-triensäure, nu» durc* d!e nachstehenden Beispiele beschneben.
Gesamt-cis-Nonadecan-V.lO.metraensäure. S°fera 1Q den Beispielen Pufferlosungen verwendet
xo wurden, wurden diese, sofern nichts anderes ange-
Obgleich verschiedene es&entielle Fettsäuren fesU geben wird, durch Auflösen der geeigneten Menge an
gestellt worden sind und die Mangelerscheinungen, Puffersubstanz in Wasser und Einstellen des pH-Wer-
die durch ihre Abwesenheit verursacht werden, aus- ies der Lösung auf den angegebenen Wert durch Zu-
f ührlich beschrieben worden sind, ist ihre genaue gäbe von Alkal' oder Salzsäure hergestellt.
Wirkungsweise nicht bekannt. Im Hinblick auf die 15 In dem Verfahren eines jeden Beispiels wurde die
nachstehend beschriebenen Versuche kann nunmehr Inkubierung auf herkömmliche Weise, nämlich durch
angenommen w. -den, daß eine Funktion dieser essen- langsames Schütteln der Reaktionsmischung in einem
tiellen Fettsäuren in ihrer Wirkung als Vorläufer luftoffenen Gefäß in einem Ofen, der thermostatisch
für die hormonartige Substanz PGE liegt. bei der gewünschten Inkubationstemeratur gehalten
So wirkt Homo-y-Linolensäure als Vorläufer für ao wurde, durchgeführt.
PGE1 und PGF,\; und Arachidonsäure wirkt als . . .
Vorläufer für PGE2 und PGF2A; während Eicosan- Beispiel 1
5,8,11,14,17-pentaensäure (eine lichtessentielle Fett- Der Methylester von Gesamt - eis - Eicosan-
säure) als Vorläufer für PGE3 und PGF3* wirkt. Die 5,8,11,14-tetrainsüure wurde mit tritiumhaltigem Was-
Tatsache, daß PGE2 weitaus biologisch aktiver ist 25 serstoffgas in Gegenwart "ines Lindlar-Katalysators
als PGE3, läßt vermuten, daß in dem Organismus die reduziert. Nach Reinigung durch Dünnschichtchro-
essentiellen Fettsäuren als Vorläufer von größerer matographie und Verseifung auf übliche Weise wurde
Bedeutung für du. Synthese von Prostaglandinen sind. tritiummarkierte Arachidonsäure mit einer spezifischen
Im allgemeinen werden der Vjdäufer und die fri- Radioaktivität von 0,91 · 10 2 MilliCurie (mC) pro
sehen Organe oder die daraus hergestellten Zube- 30 mg erhalten. Die Probe wurde einer gaschromato-
reitungen innerhalb von mehreren -linuten bis mehre- graphischen Analyse unterworfen und es wurde
ren Stunden umgesetzt, vorzugsweise 15 bis 180 Minu- gefunden, daß sie zu 95,6% rein war. Das Infrarot-
ten. Die Zufuhr von Sauerstoff kann durch einfaches absorptionsspektrum zeigte, daß nicht mehr als 3%
Belüften der Reaktionsmischung während der Um- an trans-Doppelbindungen anwesend waren, und
setzung erfolgen. Bei der Umsetzung von größeren 35 durch das Ultraviolettabsorptionsspektrum konnte
Mengen an Substrat, z. B. den genannten essentiellen keine Konjugation festgestellt weiden.
Fettsäuren, wird, wie nachstehend im Beispiel 1 1 mg der tritium-markierten Arachidonsäure mit
beschrieben, zur Ermittlung der optimalen Menge des einer Aktivität von 4,1 · 10e gezählten Entladungen je
Vorläufersubstrats, welches je Masseneinheit der Minute (cpm) (Wirksamkeit des Zählgerätes 20,7%)
frischen Gewebe zugesetzt werden muß, verfahren. Zu 40 in 20 ml 0,15molarer Kaliuniphosphatpufferlösung mit
diesem Zweck werden verschiedene Konzentrationen einem pH-Wert von 7,5 wurde während verschiedener
des Substrats zu einer gegebenen Menge des frischen Zeitspannen bei 37 0C mit 20 g Samendrüsen von
Gewebes oder der daraus hergestellten Zubereitungen Schafen beimpft, die unmittelbar nach dem Schlachten
zugesetzt, und Proben werden zu verschiedenen Zeiten gesammelt, während einer Woche auf Trockeneis
abgezogen. Vorzugsweise werden die ganzen homo- 45 gelagert und in gefrorenem Zustand zermahlen worden
genisierten Gewebe verwendet, obgleich auch aktive waren.
Fraktionen erhalten werden können durch differen- Nach der Inkubierung wurden 160 ml 96%igcs
ziertes. Zentrifugieren. Eine Trennung der homogeni- wäßriges Äthanol, welches 15 ml normale Salzsäure
sierten Gewebe durch Zentrifugieren in überstehende je Liter enthielt, zugesetzt, und die Prostaglandine
Flüssigkeit und Niederschlag liefert nicht immer in 50 wurden nach folgender Verfahrensweise isoliert,
erwünschter Weise aktive Fraktionen. Aus den so Nach Zusatz des angesäuerten Äthanols wurde die erhaltenen Ausbeuteergebnissen können die optimalen Lösung über Nacht stehengelassen. Danach wurde die Reaktionsbedingungen ermittelt werden, welche dann Lösung filtriert, wodurch ein Filtrat und ein Rückstand bei der Herstellung der Prostaglandine mit nichtradio- erhalten wurden. Der Filtrationsrückstand wurde zweiaktivem Material verwendet werden. In diesen Ver- S5 mal mit dem angesäuerten Äthanol gewaschen. Das suchen können die bekannten Verfahren zur Be- Filtrat und die Waschflüssigkeit wurden vereinigt und Stimmung der Mengen an gebildeten Prostaglandinen im Vakuum unterhalb 400C auf etwa 1Z6 des Ursprung· (z. B. Bestimmung des Ultraviolett-Absorptionsspek- liehen Volumens konzentriert. Das rohe Konzentrat, trums bei 278 oder 280 Millimikron vor und nach welches so erhalten wurde, wurde mit 6n-Salzsäure Zusatz von Natriumhydroxyd) verwendet werden. 60 auf einen pH-Wert von 3 angesäuert und danach Es wurde weiterhin gefunden, daß sehr gute Eigeb- dreimal mit reinem Äther extrahiert. Die Ätherextrakte nisse erzielt werden, wenn ein Gewichtsverhältnis wurden vereinigt und mit Wasser gewaschen bis zur von ungesättigten Fettsäuren zu frischem Gewebe neutralen Reaktion. Die so behandelten Extrakte zwischen 1:1000 bis 1: 4000 und vorzugsweise wurden mit Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum zwischen 1: 2000 bis 1: 3000 verwendet wird. 65 zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde einer Im Vergleich zu den Mengen an Prostaglandinen, dreistufigen Gegenstromverteilung zwischen gleichen die aus Drüsengewebe von Säugetieren ohne vor- Volumina von 66 % Methanol und Petroläther unterhörige Zugabe der Vorläufer isoliert werden, liegen worfen.
erwünschter Weise aktive Fraktionen. Aus den so Nach Zusatz des angesäuerten Äthanols wurde die erhaltenen Ausbeuteergebnissen können die optimalen Lösung über Nacht stehengelassen. Danach wurde die Reaktionsbedingungen ermittelt werden, welche dann Lösung filtriert, wodurch ein Filtrat und ein Rückstand bei der Herstellung der Prostaglandine mit nichtradio- erhalten wurden. Der Filtrationsrückstand wurde zweiaktivem Material verwendet werden. In diesen Ver- S5 mal mit dem angesäuerten Äthanol gewaschen. Das suchen können die bekannten Verfahren zur Be- Filtrat und die Waschflüssigkeit wurden vereinigt und Stimmung der Mengen an gebildeten Prostaglandinen im Vakuum unterhalb 400C auf etwa 1Z6 des Ursprung· (z. B. Bestimmung des Ultraviolett-Absorptionsspek- liehen Volumens konzentriert. Das rohe Konzentrat, trums bei 278 oder 280 Millimikron vor und nach welches so erhalten wurde, wurde mit 6n-Salzsäure Zusatz von Natriumhydroxyd) verwendet werden. 60 auf einen pH-Wert von 3 angesäuert und danach Es wurde weiterhin gefunden, daß sehr gute Eigeb- dreimal mit reinem Äther extrahiert. Die Ätherextrakte nisse erzielt werden, wenn ein Gewichtsverhältnis wurden vereinigt und mit Wasser gewaschen bis zur von ungesättigten Fettsäuren zu frischem Gewebe neutralen Reaktion. Die so behandelten Extrakte zwischen 1:1000 bis 1: 4000 und vorzugsweise wurden mit Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum zwischen 1: 2000 bis 1: 3000 verwendet wird. 65 zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde einer Im Vergleich zu den Mengen an Prostaglandinen, dreistufigen Gegenstromverteilung zwischen gleichen die aus Drüsengewebe von Säugetieren ohne vor- Volumina von 66 % Methanol und Petroläther unterhörige Zugabe der Vorläufer isoliert werden, liegen worfen.
1 793 S2
720 des Materials (A), welches in der wäßrigen
Phase nach der dreistufigen Verteilung zwischen 66% Melnanol und Petroläther erhalten wurde, wurde
einer Dünnschichtchromatographie auf Kieselsäuregel (G; ein Kieselsäuregel, welches 13% Gips enthält
und nach der Methode von Stahl hergestellt wird) mit dem Lösungsmittelsystem Benzol: Dioxan: Essigsäure
(20:20:1) unterworfen (und verglichen mit einer
Bezugsprobe von reinem PGE2). Die Flecken wurden durch Anfärben mit Jod sichtbar gemacht, nach Verdampfung
des Jods getrennt von der Platte abgekratzt und mit Methanol eluiert. Das Methanol wurde
verdampft und die Radioaktivität wurde mit einem Packard-Tricarb-Spektrometergemessen.Tabellelzeigt
die Verteilung der Radioaktivität über den Chromategrammen nach 5,15 und 30 Minuten Inkubatioaszeit.
Aus dieser Tabelle ist ersichtlich, daß die Radioaktivität nach 30 Minuten fast vollständig innerhalb des
I i-Wertbereiches von 0,50 bis 0,62, in welchem Bereich die Vergleichsprobe von reinem PGE2 lag,
entwickelt war.
Rf*) | Entladungen pro Minute**) | a | b | C |
21447 | 23 869 | 7180 | ||
0,74 bis 1,0 | 2 445 | 3 404 | 7 731 | |
0,62 bis 0,74 | 766 | 10 362 | 25 307 | |
0,59 bis 0,62 | 189 | 380 | 20 565 | |
0,50 bis 0,59 | 218 | 513 | 1146 | |
0,41 bis 0,50 | 364 | 592 | 548 | |
0,29 bis 0,41 |
setzt, die Lösung wurde mit normaler Salzsäure angesäuert und zweimal extrahiert mit je 2 ml Äther. Der
Äther wurde entfernt und der Rückstand gelöst in 5 ml einer wäßrigen Lösung, die 0,9 g je 100 ml
Natriumchlorid, 0,02 g je 100 ml Kaliumchlorid, 0,02 g je 100 ml Calciumchlorid, 0,01g je 100 ml
Magnesiumchlorid, 0,1g je 100 ml Glukose, 0,1g
je 100 ml Natriumhydrogencarbonat und 0,005 g je 100 ml Natriumdihydrogenphosphat enthielt. Die biologische
Aktivität wurde getestet an Meerschweinchen-Darm und der Fleck mit einem Rf-Wert von 0,60,
entsprechend PGE, zeigte starke kontraktive Aktivität. Aus einem anderen V20 Teil des Materials (A) wurde
PGE isoliert und wieder einer Dünnschichtchromatographie unter Verwendung eines Kieselsäuregels G,
welches mit 10% Silbernitrat imprägniert war, unterworfen, während ein Lösungsmittelsystem aus Äthylacetat
: Essigsäure : Methanol : 2,2,4 - Trimethylpentan: Wasser (110: 30: 35 :10: IOC Volumenteile) angewandt
wurde. Nach Entwicklung wurde die Platte in verschiedene Zonen geschnitten, die abgekratzt und
mit Methanol eluiert wurden und von denen die Radioaktivität gemessen wurde. Die Ergebnisse dieses
Versuchs sind in Tabelle 2 zusammengefaßt.
30
*) Rf 0,59 bis 0,62 entspricht POE,
Rf 0,29 bis 0,41 entspricht PGF,
Rf 0,29 bis 0,41 entspricht PGF,
nicht umgesetzte Arachidonsäure zeigt einen Rf-Wert von
0,74 bis 1,0.
**) a = 5 Minuten Inkubation,
b = 15 Minuten Inkubation,
c = 30 Minuten Inkubation.
b = 15 Minuten Inkubation,
c = 30 Minuten Inkubation.
Eine andere Probe in einei Menge von V20 des
Materials (A) wurde eirsr Dünnschichtchromatographie,
wie oben beschrieben, unterworfen. Nach Verdampfung des Metnanols wurden 2 ml Wasser züge-
Rf | Entladungen pro Minute |
0,34 bis 0,35 | 182 |
0,47 bis 0,59 | 1110 |
0,59 bis 0,67 | 2484 |
0,67 bis 0,73 | 645 |
0,73 bis 0,79 | 552 |
0,79 bis 0,85 | 619 |
0,85 bis 0,94 | 666 |
Die höchste Aktivität wurde bei einem Rf-Wert von 0,63 gefunden, der dem von PGE2 entspricht.
Die Ergebnisse zeigen klar, daß Arachidonsäure in PGE2 entsprechend nachstehendem Schema umgewandelt
wird:
CH3 — (CH2), — CH = CH — CH2 — CH HC- CH2 — CH = CH — (CH2)3 — COOH
/ \ CH 9HC
CHg — (CH2)I — CHOH — CH = CH — C ■
C — CH2 — CH = CH — (CH2)3 — COOH
CH HO''' ^CH2'
Eine grobe Berechnung, die lediglich auf der in PGE2 festgestellten Radioaktivität basiert, zeigt, daß
die Arachidonsäure mindestens zu 16% erfindungsgemäß in PGE2 umgewandelt wird.
Unter Berücksichtigung der Tatsache, daß Material während der Isolierung verlorengeht, und daß sicherlich
Tritium, welches an dem Kohlenstoffatom 9
65 der Arachidonsäure haftet, von dem Molekül abgespalten wird, kann man sagen, daß die tatsächliche
Ausbeute noch wesentlich höher liegt.
0,5 g Kaliumarachidonat, welches in 21 O.lmolarer
Kaliumphosphatpufferlösung (pH-Wert = 7,5), wel-
7 \ 8
ehe 5g Rinderserumalbumin enthielt, gelöst war, B ei so i el 4
wurde innerhalb von 2 Stunden bei 37°C mit der
überstehenden Lösung eines Homogenisates inkubiert, 36 kg Samendrüsen von Schafen wurden in kleinen
welches aus 1250 g frischen Samendrüsen von Schafen Anteilen in 3610,1 m Kaliumphosphatpuffer (pH-Wert
erhalten worden war. Diese überstehende Flüssigkeit 5 = 7,5) in einem Hochgeschwindigkeitshomogenisator,
wurde auf folgende Weise erhalten: Die frischen Drü- der auf 00C gekühlt wurde, homogenisiert. 12 g
sen wurden mit 2,51 0,1 molarer Kaliumphosphat- Homo-y-Linolensäure wurden in 121 0,15 m Glycinpufferlösung
(pH-Wert = 7,5) vermählen und die puffer (pH-Wert = 9,0) gelöst.
so erhaltene Aufschlämmung wurde in einer Ultra- 3-1-Portionen des Homogenisates wurden zu 25 1
zentrifuge 10 Minuten bei 4000 g und 2°C behandelt. io Glycinpuffer mit einem pH-Wert von 7,5 zugesetzt,
Die überstehende Flüssigkeit wurde abgehebert, und der in einem Gefäß aus nichtrostendem Stahl auf
der Rückstand wurde in 300 ml der gleichen Puffer- 750C gebracht worden war, und 0,51 der Homolösung
suspendiert und nochmals zentrifugiert. Die y-Linolensäurelösung wurden zugesetzt. Die Mischung
überstehende Flüssigkeit wurde wieder abgehebert wurde 21I2 Stunden bei 37°C unter Rühren und
und mit der ersteren vereinigt. Die gesamte opali- 15 ständigem Durchleiten eines Sauerstoffstroms inkusierende
Lösung enthielt etwa 50 g Proteinmaterial, biert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 8 η H2SO4,
in welchem das aktive Enzymsystem vorlag. Die bis der pH-Wert unterhalb 3 lag, beendet. Auf diese
Gesamtmenge von Prostaglandinen E, welche hierin Weise wurden 24 Ansätze inkubiei t.
anwesend war, betrug weniger als 50 mg. Zu der Reaktionsmischung wurden 2401 96°/oiges
Nach Inkubierung wurden 151 96°/oiges, wäßriges ao wäßriges Äthanol zugesetzt, und die Mischung wurde
Äthanol zugesetzt, mit normaler Salzsäure wurde über Nacht stehengelassen. Die überstehende Flüssigauf
einen pH-Wert von 4 angesäuert und der Nieder- keit wurde soweit wie möglich abdekantiert, und der
schlag wurde abgefiltert. Die Lösung wurde auf etwa Rückstand wurde wieder zweimal mit 1201 96°/oigem
11 duich Vakuumdestillation bei einer Temperatur Äthanol extrahiert.
unterhalb 300C eingeengt. Der Rückstand wurde drei- »5 Die vereinigten Alkoholextrakte wurden filtriert
mal mit je 500 ml reinem Äther extrahiert. Nach dem und durch Eindampfen im Vakuum bei 35°C einge-Trocknen
über Natriumsulfat wurde der ätherische engt. Zu dem Rückstand wurde eine gleiche Volumen-Extrakt
zur Trockne eingedampft und der Rückstand menge Wasser zugesetzt. Diese Lösung wurde dreimal
von etwa 15 g zwischen 750 ml 66%igem wäßrigem mit Diäthyläther extrahiert.
Methanol und 750 ml Petroläther verteilt. 3° Die ätherischen Extrakte wurden vereinigt, mit
Methanol und 750 ml Petroläther verteilt. 3° Die ätherischen Extrakte wurden vereinigt, mit
Die wäßrige Phase wurde im Vakuum zur Trockne destilliertem Wasser gewaschen, bis der pH-Wert des
eingedampft und es wurden etwa 3 g eines Öls erhalten, Waschwassers etwa neutral war, und mit wasserweiches
etwa 340 mg PGE2 enthielt, bestimmt durch freiem Natriumsulfat getrocknet. Die Hauptmenge
Dünnschichtchromatographie und die Änderung in des Äthers wurde im Vakuum abgedampft. Der Rückder
UV-Absorption bei Zusatz von Alkali. 35 stand, der etwa 7 g rohes PGE, in etwa 800 g Lipid-
Das Material wurde durch Kolonnenchromatogra- material enthielt, wurde in Mengen von je 15 bis
phie über Kieselsäure gereinigt, die vor Verwendung bei 20 g auf Kolonnen (Durchmesser 5 cm), die mit 150 g
115CC aktiviert worden war. Die Substanz wurde in Kieselsäure (Mallinckrodt 100 Analysenreagens) ge-Äthylacetat:
Benzol (30: 70) gelöst und auf die Kiesel- packt waren, chromatographiert.
säurekolonne (30 · 2 cm) aufgebracht. Die Kolonne 4° Die Fraktionen, welche das Prostaglandin E entwurde mit Äthylacetat: Benzol 32:70) durchgewaschen. hielten und mit Chloroform, welches 2 bis 5% Das Prostaglandin E wurde dann mit Äthylacetat: Methanol enthielt, eluiert wurden, wurden vereinigt Benzol (60: 40) eluiert. Das PGE wurde durch Be- und nochmals in derselben Weise chromatographiert. handlung von aliquoten Teilen der Fraktionen mit Danach wurde das so erhaltene, noch unreine Prosta-0,5 normaler Natriumhydroxydlösung in 50°/„igem 45 glandin E durch Chromatographie unter Verwendung wäßrigen Äthanol bestimmt, wonach die Absorption des umgekehrten Fhasei systems gereinigt, welches im bei 278 Millimikron gemessen wurde. Nach 30 Minu- Beispiel 2 beschrieben wurde. Die das PGE1 enthalten wurden die das PGE enthaltenden Fraktionen tenden Fraktionen wurden vereinigt, und das Lösungsvereinigt und im Vakuum eingedampft. Der Rück- mittel wurde im Vakuum bei einer Temperatur stand wurde in Portionen von 1 g durch Chromato- 50 unterhalb 35° C abgedampft. Das zurückbleibende graphie über einer Kolonne mit umgekehrter Phase Material wurde aus wäßrigem Methanol umkristalligereinigt, wobei als Träger mit Dimethyldichlorosilan siert und ergab 4 g reines PGE1, Schmelzpunkt 114° C. behandelte Diatomeenerde und als stationäre Phase
säurekolonne (30 · 2 cm) aufgebracht. Die Kolonne 4° Die Fraktionen, welche das Prostaglandin E entwurde mit Äthylacetat: Benzol 32:70) durchgewaschen. hielten und mit Chloroform, welches 2 bis 5% Das Prostaglandin E wurde dann mit Äthylacetat: Methanol enthielt, eluiert wurden, wurden vereinigt Benzol (60: 40) eluiert. Das PGE wurde durch Be- und nochmals in derselben Weise chromatographiert. handlung von aliquoten Teilen der Fraktionen mit Danach wurde das so erhaltene, noch unreine Prosta-0,5 normaler Natriumhydroxydlösung in 50°/„igem 45 glandin E durch Chromatographie unter Verwendung wäßrigen Äthanol bestimmt, wonach die Absorption des umgekehrten Fhasei systems gereinigt, welches im bei 278 Millimikron gemessen wurde. Nach 30 Minu- Beispiel 2 beschrieben wurde. Die das PGE1 enthalten wurden die das PGE enthaltenden Fraktionen tenden Fraktionen wurden vereinigt, und das Lösungsvereinigt und im Vakuum eingedampft. Der Rück- mittel wurde im Vakuum bei einer Temperatur stand wurde in Portionen von 1 g durch Chromato- 50 unterhalb 35° C abgedampft. Das zurückbleibende graphie über einer Kolonne mit umgekehrter Phase Material wurde aus wäßrigem Methanol umkristalligereinigt, wobei als Träger mit Dimethyldichlorosilan siert und ergab 4 g reines PGE1, Schmelzpunkt 114° C. behandelte Diatomeenerde und als stationäre Phase
Isooctanol: Chloroform (1:1); Verhältnis der statio- Beispiel 5
nären Phase zur beweglichen Phase 1:10, verwendet 55
wurden. Die Packung der Kolonne bestand aus ' Samendrüsen von Schafen (25Og) wurden mii
22,5 g Trägerstoff mit 20 ml stationärer Phase. Die 600 ml 0,1 m Phosphatpuffer (pH-Wert = 7,1) ir
Ausbeute an praktisch reinem Prostaglandin E 2, die einem auf 0°C gekühlten Hochgeschwindigkeits
so erhalten wurde, betrug 250 mg. homogenisator während 30 Sekunden homogenisiert
60 Das Homogenisat wurde dann innerhalb von 10 Minu
B e i s ρ i e 1 3 ten bei 4000 g zentrifugiert und die überstehend
Flüssigkeit wieder einer Zentrifugierung unter den
Beispiel 2 wurde wiederholt, es wurde jedoch selben Bedingungen unterworfen. Die so erhaltene
nun als Vorläufermaterial 0,5 g des Kaliumsalzes trübe Lösung wurde dann in einer ültrazentrifug
von Homo -γ- Linolensäure (Gesamt-eis-Eicosan- 65 60 Minuten bei etwa 100 000 g zentrifugiert.
8,ll,14-triensäure^ verwendet, die in PGE1 unige- Der Niederschlag wurde mit 200 ml einer Puff ei
8,ll,14-triensäure^ verwendet, die in PGE1 unige- Der Niederschlag wurde mit 200 ml einer Puff ei
wandelt wurde. Die so erzielte Gesamtausbeute an lösung vom pH-Wert = 8,0, die 0,01 m Trikaliun
PGE, betrug 190 mg, F. = 114°C. phosphat,0,01 m Dinatriumdihydrogenäthytendiamii
1 Π
ίο
tetraacetat und 0,001 m Cystein enthielt, aufgerührt der Carboxylgruppe und der Cyclopentylgruppe
und nochmals 60 Minuten bei 100 000 g zentrifugiert. stehen).
Die gewaschene Fraktion enthielt etwa 1,9 g Protein Nach chromatographischer Reinigung und Kri-
und nur 1,6 mg Prostaglandin E. Sie wurde in 100 ml stallisation des NOr-PGE1 aus wäßrigem Methanol
0,1m K iliumphosphatpuffer, pH-Wert = 8,0, sus- 5 wurden 9,6 mg nadeiförmige Kristalle erhalten. Dieses
pendiert und dann 5 Minuten bei 300C mit einer Material wurde durch Massenspektroskopie als Nor-0,2
m Tris - (hydroxymethyl) - aminomethan - HCl- PGE1 identifiziert (Molekulargewicht 540). Durch
Pufferlösung (pH-Wert — 8,0), die 200 'ng Homo- Gaschromatographie konnte keine Verunreinigung
y-Linolensäure und 75 mg Propylgallat enthielt, inku- mit PGE1 oder PGE2 festgestellt werden. Der Schmelzbiert.
Die Inkubation wurde durch Zugabe von io punkt betrug 890C.
0,2 m Zitronensäurelösung, bis zum pH-Wert von . . . „
0,2 m Zitronensäurelösung, bis zum pH-Wert von . . . „
5,5 (etwa 150 ml) beendet. Die angesäuerte Mischung Beispiel »
wurde zweimal mit demselben Volumen von Diäthyl- Ein Stück Zwölffingerdarm (65 g Feuchtgewicht)
äther extrahiert. In dem ätherischen Extrakt waren eines männlichen Schafes wurde in Stücke geschnitten
19 mg (8 °/0) PGE1 enthalten. 15 und in einem Hochgeschwindigkeitshomogenisator
„ . . , , mit 200 ml 0,01 m Kaliumpliosphatpuffer (pH-Wert
Beispiel 6 = 80) hornOgenisiert.
400 g Samendrüsen von Schafen wurden mit 400 ml Das Homogenisat wurde 10 Minuten bei 4000 g
Wassei in einem gekühlten Hochgeschwindigkeits- zentrifugiert. Die trübe überstehende Flüssigkeit wurde
homogenisator homogenisiert und weiter verdünnt mit ao 60 Minuten bei 100 000 g zentrifugiert. Der Nieder-800
ml destilliertem Wasser. Alle Arbeitsgänge wurden schlag, der bei der zweiten Zentrifugierung erhalten
bei O0C ausgeführt. In kleinen Anteilen wurden 200 ml wurde, wurde in 12 ml 0,1m Kaliumphosphatpuffer
(Feuchtvolumen) handelsübliches Anionaustauschharz (pH-Wert = 8,0) suspendiert. Diese Zubereitung wurde
50 bis 100 Maschen (ein Styrol-Divinylbenzol-Polymer- für die folgende Inkubation verwendet; sie enthielt
Gerüst mit 2% Divinylbenzol, enthaltend quaternäre 25 30 mg Protein je Milliliter.
Ammonium-Austauschgruppen, Handelsname Dowex Die Enzymlösung (1,5 ml) wurde mit 95 Mikro-
AGl- X2), in der OH-Form, gesättigt mit CO2, gramm (l-14C)-Homo-y-Linolensäure (950OOcpm) in
unter Rühren zugesetzt, während gleichzeitig ein 1 ml 0,2 m Tiis-(hydroxymethyl)-aminomethan-HClschneller
CO2-Strom durchgeleitet wurde. Die Mi- Puffer (pH-Wert = 8,0) lö Minuten bei 3ö"C inkuschung
wurde durch ein Tuch zur Entfernung von 30 biert.
Bindegewebe und Ionenaustauschern filtriert. Die so Nach der Inkubation wurde die Mischung angeerhaltene,
trübe Lösung (1,2 I, pH-Wert = 8,2) ent- säuert und mit Äther extrahiert. Nach Zusatz von
hielt nur wenige Milligramm von endogenen Prosta- 182 Mikrogramm PGE1 und 100 Mikrogramm PGF1 \
glandinen. Sie wurde aerob 30 Minuten bei 30°C mit wurden die ätherischen Extrakte zur Trockne gebracht.
175 mg Arachidonsäure inkubiert, die in 400 ml einer 35 Das Material wurde über einer dünnen Schicht von
0,05 m Kaliumphosphatpuffer (pH-Wert = 7,5) und Kieselsäuregel G mit dem Lösungsmittelsystem Cl Io-0,2
m Tris - (hydroxymethyl) - aminomethan - HCl- roform-Methanol-Essigsäure-Wasser (90 : 6 : 1 : 1,
Puffer enthaltenden Lösung gelöst war; pH-Wert = 9,0 Volumen) als Eluierungsmittel Chromatographie«,
(in einem Volumenverhältnis von 1:1). Die Lage der Prostaglandine wurde bestimmt, indem
Nach der Reaktion wurde die Mischung mit 40 das Chromatogramm Joddämpfen ausgesetzt wurde
4n-Schwefelsäure angesäuert, bis ein pH-Wert unter und die das Prostaglandin E bzw. F enthaltenden
3,5 erreicht war. Dann wurden 250 ml Alkohol züge- Zonen nach Verdampfung des Jods abgekratzt
setzt. Das Gemisch wurde zweimal mit je 11 Äther wurden. Das PGE1 wurde aus dem Kieselsäuregel
extrahiert. Der ätherische Extrakt enthielt 65 mg mit Methanol eluiert und mit 0,5 m methanolischer
PGE2 (Dünnschichtchromatographie und Änderung 45 KOH 10 Minuten bei 20°C behandelt. Das so gebildete
der UV-Absorption bei Zusatz von Alkali) und 14 mg Entwässerungsprodukt wurde durch Dünnschicht-
PGF2A (Dünnschichtchromatographie). Chromatographie über Kieselsäuregel G mit dem
. . Lösungsmittel Äther-Essigsäure (100:2) isoliert. Ein
Beispiel 7 ^ejj ^1Jd6 auf Radioaktivität getestet, in einem ande-
Ausgehend von 400 g Samendrüsen und 200 mg 50 ren Teil wurde die Extinktion bei 280 Millimikron
Gesamt-cis-T.lO.lS-Nonadecatrierisäure unter Verwen- gemessen. Es wurde berechnet, daß das durch die
dung derselben Verfahrensweise wie im Beispiel 6 Biosynthese gebildete PGE1 eine Radioaktivität von
beschrieben, wurden in dem ätherischen Extrakt 167 cpm besaß. Dünnschichtchromatographie über
27 mg NOr-PGE1 und etwa 5 mg NOr-PGF1(X erhalten mit Silbernitrat imprägniertem Kieselsäuregel G ver-(unter
Nor-Proslaglandinen werden Prostaglandine 55 ursachte keine weitere Abnahme der spezifischen
verstanden, in wekhen 5 Methylengruppen zwischen Radioaktivität des entwässerten PGE1.
Claims (1)
1. Verfahren zur Herstellung von Prostaglan- (PGE1)- J
dinen. dadurch gekennzeichnet, daß 5 .,V.f^Z.\ , ~ - <
« «· -
eine Gesamt-cis Fettsäure der allgemeinen Formel ll^Dihydroxy-9-oxo-prosta-5,13-d.en-saure
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C3 | Grant after two publication steps (3rd publication) | ||
E77 | Valid patent as to the heymanns-index 1977 |