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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von cis-3-Hydroxyprolin.
Bei der Herstellung von 3-Hydroxyprolin durch chemische Synthese oder durch Gewinnung aus natürlichen Quellen (z. B. Kadaververwertung usw. ) fallen die beiden isomeren Formen, nämlich cis-3-Hydroxyprolin und trans-3-Hydroxyprolin in wechselnden Mengenanteilen an.
Die grundsätzlichen Möglichkeiten für die Synthese bzw. Isolierung von 3-Hydroxyprolin (Gemisch der cisund der trans-Form) sind a) Synthese aus Aminomalonsäure (in der Regel eingesetzt als Diäthylaminomalonsäure) und Acrolein, b) Synthese von cis- und trans-3-Phenoxyprolin nach J. Häusler und U. Schmidt in Liebigs Annalen der Chemie 1979, 1881-1889, c) Darstellung von cis- und trans-C-3-substituierten Prolinverbindungen von J. Häusler in Liebigs Annalen der Chemie 1281, 1073-1088, d) Isolierung aus bei der Kadaververwertung anfallenden, hydrolisierten Kollagenen, e) Isolierung aus Meeresschwämmen und dgl. mehr.
Die oben geschilderten Möglichkeiten der Gewinnung von 3-Hydroxyprolin haben u. a. den Nachteil, dass stets ein Gemisch der cis- und der trans-Form anfällt und dass teilweise hochgiftige Ausgangssubstanzen (z. B.
Acrolein) angewendet werden müssen.
In J. Häusler-Darstellung von cis- und trans-C-3-substituierten Prolinverbindungen (Liebigs Annalen der Chemie 1981. 1073-1088) ist u. a. der Vorschlag enthalten, cis-3-Hydroxyprolin aus 3-Acetyloxyprolin durch Hydrolyse mit Salzsäure herzustellen.
J. Häusler berichtet a. a. O. auch, dass sich die Natrium-l-pyrrolin-2-carboxylate mit Hilfe von Natriumborhydrid zu den cis-konfigurierten Prolinanaloga, so u. a. der 3-Acetyloxyverbindung reduzieren lassen.
Diese Reduktion soll mit hoher Selektivität (über 95 %) erfolgen. Allerdings ist die Reduktion des in der C-3Position durch eine Hydroxylgruppe substituierten 1. 2-Dehydroprolins zum cis-3-Hydroxyprolin von J. Häusler nicht beschrieben worden.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein einfach und grosstechnisch durchführbares Verfahren zur transcis-Isomerisierung von trans-3-Hydroxyprolin anzugeben.
Gemäss der Erfindung wird diese Aufgabe dadurch gelöst, dass man trans-3-Hydroxyprolin gegebenenfalls in Form eines Gemisches mit cis-3-Hydroxyprolin oder gegebenenfalls in Form eines Gemisches von bei der Kadaververwertung nach der Hydrolyse anfallenden Aminosäuren mit Hilfe eines Enzyms oder eines Enzymgemisches zur entsprechenden 1. 2-Dehydroverbindung oxidiert und die so erhaltene 1. 2-Dehydroverbindung mit einer komplexen Wasserstoffverbindung, insbesondere mit Natriumborhydrid (NaBH4) reduziert.
Der der Erfindung zugrundeliegende Lösungsgedanke beruht auf einer Oxidationsreaktion des trans-3-
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2-Dehydroverbindung1. 2-Dehydroverbindung zu cis-3-Hydroxyprolin.
Die erfindungsgemäss erhältliche Substanz cis-3-Hydroxyprolin ist eine bei Säugern (einschliesslich des Menschen) nicht vorkommende Aminosäure. Die zur erfindungsgemäss erhältlichen Verbindung isomere Verbindung (trans-3-Hydroxyprolin) ist ein wesentlicher, integraler Bestandteil des Basalmembrankollagens. Es ist bekannt, dass dieses Basalmembrankollagen die Gefässwand bei pathologischen Zuständen, wie z. B. bei Diabetes mellitus verdickt und so zu schweren Gefässverengungen führt.
Bei Tierversuchen an Maus und Ratte wurde festgestellt, dass das erfindungsgemäss erhältliche cis-3Hydroxyprolin, das bislang zur Verwendung als pharmazeutischer Wirkstoff mit dieser Indikation nicht vorgeschlagen worden ist, hier Abhilfe schaffen kann. Es hat sich nämlich überraschenderweise gezeigt, dass durch Einbau des zur trans-Form isomeren cis-3-Hydroxyprolins in Kollagen ein instabiles, minderwertiges und nicht helikales Kollagenmolekül gebildet wird, woraus eine insgesamt verringerte Synthese von Basalmembrankollagen resultiert.
Diese Beeinflussung des Kollagenstoffwechsels durch cis-3-Hydroxyprolin wurde durch die weiter unten wiedergegebenen Tierversuche bestätigt. Überdies ist das erfindungsgemäss erhältliche cis-3-Hydroxyprolin eine Substanz, die in Toxizitätsversuchen keine schädliche Wirkung gezeigt hat. Auch eine Teragotenität kann in der ersten Generation ausgeschlossen werden.
Das beim erfindungsgemässen Verfahren als Ausgangsstoffe dienende trans-3-Hydroxyprolin (das gegebenenfalls in Mischung mit cis-3-Hydroxyprolin vorliegen kann) kann auf verschiedene Weisen gewonnen werden. a) Isolierung von trans-3-Hydroxyprolin aus kommerziell erhältlichen Champignons, b) Isolierung von trans-3-Hydroxyprolin aus Schwämme, c) Synthese eines Gemisches aus cis- und trans-3-Hydroxyprolin aus Aminomalonsäure und Acrolein, d) Darstellung nach J. Häusler a. a. O. und e) (erfindungsgemäss bevorzugt) aus den bei der Kadaververwertung durch Hydrolyse anfallenden Aminosäuren.
Die bei der Kadaververwertung nach deren Hydrolyse anfallenden Aminosäuren enthalten als wichtigsten Bestandteil Prolin, das in grossen Mengen erzeugt wird und als Futtermittel Verwendung findet. Je Tonne Prolin
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fallen etwa 5 bis 10 kg trans-3-Hydroxyprolin an. Bislang wurde dieses zusammen mit den anderen Aminosäuren verworfen. Das erfindungsgemässe Verfahren ermöglicht es aber, das trans-3-Hydroxyprolin in grossem Massstab zu cis-3-Hydroxyprolin zu isomerisieren.
Bei der praktischen Ausführung des erfindungsgemässen Verfahrens erfolgt die Oxidation mit Hilfe von Aminosäureoxidasen (D-Aminosäureoxidase und L-Aminosäureoxidase) und Catalase. Da im Gegensatz zur Catalase die Aminosäureoxidasen sehr teuer sind, werden diese beim erfindungsgemässen Verfahren bevorzugt immobilisiert eingesetzt.
Die Immobilisierung kann dadurch erfolgen, dass die Enzyme in einem Dialyseschlauch (Hersteller : Union Carbide) eingeschlossen oder an Kügelchen (beads) gekuppelt eingesetzt werden. Diese Kügelchen können beispielsweise aus mit Cyanbromid aktivierter Sepharose 4B (Hersteller : Pharmacia, Uppsala) oder an Affi-Gel- 10 (Hersteller : Bio-Rad) bestehen.
Nach 24 Stunden langer Inkubation bei 37 C ist die Oxidation zur 1. 2-Dehydroverbindung abgeschlossen und die immobilisierten Enzyme können erneut eingesetzt werden. Beispielsweise können die an beads immobilisierten Enzyme durch einfache Sedimentation oder durch Zentrifugieren aus dem Reaktiongsgemisch abgetrennt werden. (Es folgt die Reduktion mit Natriumborhydrid.)
Pharmakologische Eigenschaften der erfindungsgemäss erhältlichen cis-3-HydroxyproIins : a) Teratogenizität :
10 weibliche, durch Inzucht erzeugte weisse Mäuse (Österr. Institut für Versuchstierkunde, Himberg) wurden für diesen Versuch verwendet
Die Schwangerschaft wurde durch die Vaginalpfropftechnik bestimmt.
Zum Zeitpunkt der Diagnose der Gravidität wurden sie mit einer 0, 1 g/Vol.-% Lösung von cis-3-Hydroxyprolin gefüttert. Die Schwangerschaft verlief im Vergleich zu nicht behandelten, trächtigen Mäusen ereignislos. Es traten keine postpartalen Blutungen auf. Die Gestationsperiode war von adäquater Länge. Die Zahl der Nachkommen war normal. Es wurden keine Änderungen des Verhaltens oder Kannibalismus festgestellt. Die Nachkommen begannen mit dem Saugen kurz nach der Niederkunft.
Die Plazenten hatten eine normale Grösse und ein normales Aussehen.
Die Nieren von zehn Tieren wurden im Elektronenmikroskop untersucht. Abgesehen von ProteinsekretTröpfchen konnten keine Änderungen beobachtet werden.
Bei der Autopsie getöteter Jungtiere konnten keine makroskopischen Organänderungen gefunden werden. Es konnten auch keine Missbildungen der Jungtiere festgestellt werden.
Schliesslich trat bei der Niederkunft oder danach keine Blutung auf.
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Kollagen Typ I wurde in 10 Ratten, die mit cis-3-Hydroxyprolin gefüttert wurden und bei 10 Ratten, die als Vergleichstiere dienten, bestimmt. Die verwendeten Tiere waren alle Diabetiker, ganz gleich, ob behandelt oder nicht behandelt.
Die Abtrennung von Kollagen des Typs I wurde nach einer Standardmethode ausgeführt. Das Kollagen wurde hydrolysiert und affinitätschromatografisch bestimmt.
Das Kollagen Typ I, wiedergegeben durch 4-Hydroxyprolinkonzentrationen, unterschied sich nicht zwischen der mit cis-3-Hydroxyprolin gefütterten Gruppe von Ratten und der Vergleichsgruppe.
Es konnten in den behandelten Tieren 1076 mg 4-Hydroxyprolin und in den nicht behandelten Tieren 1165 mg 4-Hydroxyprolin gefunden werden.
Der Student's t-Test zeigte keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen (p kleiner als 0, 3). c) Bestimmung von Kollagen Typ I aus der Haut :
Kollagen Typ I wurde aus der Haut von Mäusen isoliert. Die Versuchstiere wurden in Gruppen zu je 10 Tieren eingeteilt, wovon eine mit cis-3-Hydroxyprolin gefüttert wurde und die andere Gruppe als Vergleichsgruppe diente. Die Abtrennung des Kollagens Typ I erfolgte nach einer Standardmethode.
Das abgetrennte Kollagen wurde auf einer Mikrowaage gewogen. Dadurch wurde festgestellt, dass die Kollagenkonzentrate der nicht behandelten Tiere 575 mg 125 mg wogen, wogegen die Kollagenkonzentrate der mit cis-3-Hydroxyprolin behandelten Versuchstiere im Durchschnitt 539 mg 175 mg betrugen.
Durch Anwendung des Student's t-Test (p kleiner als 0, 4) wurden keine signifikanten Unterschiede festgestellt d) Bestimmung von Kollagen Typ IV :
Es wurden mit cis-3-Hydroxyprolin behandelte Mäuse und nicht behandelte Mäuse verwendet Die rechte Niere jedes Versuchstieres wurde für biochemische Bestimmungen und die linke Niere jedes Versuchstieres für Immunfluoreszenzuntersuchungen herangezogen.
Es wurden zwei Verfahren angewendet :
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Die Bestimmung von trans-3- und trans-4-Hydroxyprolin nach dem nachstehend beschriebenen Verfahren und ein affinitätschromatografisches Verfahren unter Verwendung von anti-IV-IgG, gekoppelt an Sepharose oder Agarose-Kügelchen.
Die mit cis-3-Hydroxyprolin behandelten Mäuse zeigten einen abnehmenden Gehalt von Kollagen Typ IV, wobei Pepsinaufschlüsse der Nieren verwendet wurden (p kleiner als 0, 01).
Die Bestimmung von trans-3- und trans-4-Hydroxyprolin zeigte signifikante Unterschiede in den Pepsinaufschlüssen der beiden Gruppen, welche anzeigten, das der Kollagen-Typ-IV-Gehalt in den Nieren behandelter Tiere verringert ist (p kleiner als 0, 005).
Nachstehend wird das Verfahren zur Bestimmung von trans-3- bzw. trans-4-Hydroxyprolin erläutert :
Die Proben wurden nun durch den Ionenaustauscher (3 ml DOWEX 50 W-X8 von Bio-Rad Nr. 745-6441) geschickt und die aufgefangenen Aminosäuren mit 2 ml von 4 M Ammoniak eluiert, um anschliessend unter Stickstoff getrocknet zu werden.
Durch diese Vorbereitung mittels Aktivkohle und Ionenaustausch konnten störende Substanzen eliminiert
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30 min bei Zimmertemperatur ins Dunkle gestellt ; anschliessend wurde mit Stickstoff getrocknet. Das gewonnene dunkle, trockene Material wurde in 20 gl destilliertem Wasser gelöst und mit 20 d 7-Chloro-4-nitrobenz-2-oxa- 1, 3-diazol (8 mg/ml Äthanol, Sigma Nr.
C 5261) versetzt, danach für 10 min in ein 45 C-Wasserbad gestellt und anschliessend zentrifugiert. 10 gl dieser Mischung wurden dann auf HPTLC-Platten (LHP'KF von Whatman 4806-710) aufgetragen und mittels Laufmittel aufgetrennt (Laufmittel : Azeton : Chloroform : Methanol :
Triäthylamin = 20 : 60 : 12, 5 : 7, 5). Bei jeder Platte wurden Standardmischungen bestehend aus : trans-4-Hydroxyprolin (Sigma H 6002) cis-4-Hydroxyprolin (Sigma H 1637) trans-3-Hydroxyprolin (synthetisiert nach Häusler, a. a. 0.) cis-3-Hydroxyprolin (synthetisiert nach Häusler) verwendet. e) Ophthalmologische Untersuchungen :
10 mitcis-3-Hydroxyprolin behandelte Mäuse wurden mit 10 Vergleichstieren verglichen.
Nach einmonatiger Verabreichung von cis-3-Hydroxyprolin an die 10 Mäuse wurden die Augen mit der Spaltlampe untersucht und eine Fundoskopie ausgeführt.
Es konnten keine Unterschiede zwischen der behandelten Gruppe und der nicht behandelten Gruppe von Versuchstieren festgestellt werden.
Eine elektronenmikroskopische Untersuchung zeigte keine morphologischen Änderungen der Augen beider Gruppen.
Es gab weder klinische Hinweise noch Symptome für Sehstörungen. f) Überprüfung der Änderung von rasch wachsenden Organen :
Haare : es konnten keine Veränderungen der Haare von Mäusen und Sprague-Dawley-Ratten, die mit cis-3Hydroxyprolin behandelt wurden, festgestellt werden. Bei einer nach dem von G. Lubec in Lancet 1983,1985 beschriebenen Verfahren zur Infrarotspektroskopie ausgeführten Untersuchung konnten keine strukturellen Änderungen bei Mäusen festgestellt werden.
Zähne : Die Festigkeit der Zähne der Mäuse bzw. der Ratten unterschied sich nicht zwischen behandelten und nicht behandelten Tieren. Diese Feststellung wurde durch Röntgenuntersuchungen bestätigt.
Unterschiedliche Färbungen des Blutes zeigten keine quantitativen oder qualitativen Änderungen der Lymphocyten oder polymorphonuklearer Zellen, es konnten auch keine Einschlüsse oder Fusionen bzw.
Vakuolisierung festgestellt werden.
Ly) Hämoglobinänderunlren :
Durch Hämoglobinelektrophorese auf Zelluloseacetat konnten keine Unterschiede der Mäusesysteme zwischen behandelten und nicht mit cis-3-Hydroxyprolin behandelten Tieren festgestellt werden. h) Heilung von Wunden :
Zwei Gruppen zu je 8 weissen, weiblichen Ratten wurden für diesen Versuch herangezogen. Ein 10 mg Polyvinylschwamm wurde subkutan 4 Tage lang eingepflanzt. Darauf wurde der Schwamm entfernt und der Gehalt an trans-4-Hydroxyprolin nach dem Prinzip von Kivivikko, K. I., Laitinen, 0., Prokop, D. O. in Anal.
Biochem. 12, 249 (1967) bestimmt.
Der mittlere Gehalt an 4-Hydroxyprolin in den Schwämmen von 8 Vergleichstieren betrug 1, 75 gag. Der durchschnittliche Gehalt an 4-Hydroxyprolin in den mit cis-3-Hydroxyprolin gefütterten Tieren betrug 1, 87 lig.
Es gab auch keinen signifikanten Unterschied zwischen den Gruppen, wenn diese nach dem Student's t-Test verglichen werden.
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i) Akute Toxizität :
100 mg cis-3-Hydroxyprolin wurden intravenös 10 Sprague-Dawley-Ratten verabreicht.
1 Tag nach der Verabreichung der Versuchsverbindung und 1 Woche danach wurden Blutproben von 5 Tieren gezogen. Es wurden die Parameter Creatinin, GOT (Glutamat-Oxalacetat-Transaminase), GPT (Glutamat-PyruvatTransaminase), yGT (Gamma-Glutamyl-Transpeptidase), Alkaliphosphatase und die üblichen hämatologischen Parameter bestimmt.
Im Vergleich zu den Vergleichstieren wurden keine signifikanten Unterschiede (p = 0, 4) beobachtet j) Bestimmung der Aktivität von Kollagenase in der Niere :
Zehn diabetische Wistar-Ratten wurden mit cis-3-Hydroxyprolin gefüttert und 10 Wistar-Ratten, die als Vergleichstiere dienten, gegenübergestellt. Die Nierenhomogenisate wurden hinsichtlich ihrer kollagenolytischen Aktivität nach der Vorschrift von Gries et al bestimmt.
Es konnte keine statistisch signifikanten Änderungen der kollagenolytischen Aktivität zwischen den beiden Gruppen von Versuchstieren festgestellt werden. Daraus folgt, dass die durch die erfindungsgemäss erhältliche Verbindung bewirkte Reduktion der Basalmembrandicke nicht die Folge einer erhöhten Kollagenolyse ist. k) Wirksamkeit von cis-3-Hydroxyprolin :
Die Gefässwand besteht aus Endothel, Epithel und der Basalmembran. Beim Diabetes mellitus kommt es zu einer signifikanten Verbreiterung der Basalmembran. Diese besteht zu 90 % aus Kollagen Typ IV. Der Angriffspunkt des cis-3-Hydroxyprolin ist am Kollagen Typ IV.
Affinitätschromatografische Studien zur Bestimmung von Kollagen Typ IV zeigen eine deutliche, statistisch signifikante Verminderung der pathologischen Basalmembranproliferation.
Diese Beobachtung wurde durch elektronenmikroskopische Untersuchungen untermauert.
Eine signifikante Reduktion der Basalmembrandicke kann nach Therapie mit cis-3-Hydroxyprolin im Unterschied zu einer nichtbehandelten Kontrollgruppe erhoben werden (vgl. oben Pkt. d).
Nachstehend wird das erfindungsgemässe Verfahren anhand von nicht beschränkenden Beispielen näher
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spezifischen Aktivität von etwa 65 000 U/mg, erhältlich bei Boehringer Mannheim), 1 mg D-Aminosäureoxidase (aus Schweinenieren, Hersteller Boehringer Mannheim, spezifische Aktivität etwa 3 U/mg) und mit 0, 5 mg L-Aminosäureoxidase (aus krotalus turisus, spezifische Aktivität 3, 5 U/mg, Hersteller Boehringer, Mannheim) in 0, 025 ml Phosphatpuffer (pH-Wert 8, 0) bei 37 C 24 Stunden lang inkubiert. Die eingesetzten Enzyme (Catalase und Aminosäureoxidasen) waren an Kügelchen (beads) aus mit Cyanbromid aktivierter Sepharose 4B (Hersteller Pharmacia, Uppsala) gebunden. Nach Beendigung der Inkubation wurden die beads durch Sedimentation vom Reaktiongsgemisch abgetrennt.
Hierauf wurde mit 10 mg Natriumborhydrid (NaBH4) reduziert und 0, 9 mg cis-3Hydroxyprolin erhalten.
Beispiel 2
1 mg trans-3-Hydroxyprolin wurde in 10 ml 0, 25 molarem Phosphatpuffer (pH 8, 0) aufgelöst, Es wurde 1 mg Catalase (65 000 U/mg, Hersteller : Boehringer, Mannheim) zugegeben.
In der so erhaltenen Lösung wurden 1 ml Kügelchen aus Affi-Gel-10 (Hersteller Bio-Rad), mit denen 1 mg D-Aminosäureoxidase und 0, 5 mg L-Aminosäureoxidase gekoppelt worden sind, suspendiert.
Die Kupplung der beiden Enzyme an die Kügelchen wurde wie folgt ausgeführt :
Der vorgequollene Gelkuchen wurde nach den Angaben des Herstellers gewaschen und mit 10 ml einer 0, 1 molaren Natriumbicarbonatpufferlösung (pH 8, 0) sowie mit der Enzymlösung (10 ml Bicarbonatpuffer und 1 mg jedes Enzyms) bei Raumtemperatur 4 Stunden lang in einem Schüttler vermischt. Die Blockierung der verbleibenden aktiven Gruppen wurde mit 10 ml eines 1 molaren tris-Puffers (pH 8, 0) und 4 stündigem Inkubieren bei Raumtemperatur ausgeführt. Das Gel wurde dann in einem Büchner-Trichter mit destilliertem Wasser (drei mal das Volumen des Gels) und einer 0, 025 molaren Phosphatpufferlösung (pH 8, 0) gewaschen.
Diese Suspension der immubilisierten Enzyme und des Substrates (trans-3-Hydroxyprolin) wurde 24 Stunden lang bei 37 C unter Durchleiten von Sauerstoff in einem Abzug (um die Entzündungsgefahr zu verringern) inkubiert.
Hierauf wurden die Kügelchen (beads) absitzen gelassen und die überstehende Flüssigkeit abgesaugt.
Zur überstehenden Flüssigkeit wurden 5 mg NaBH4 zugegeben und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert.
So wurden 91 % des eingesetzten trans-3-Hydroxyprolin in cis-3-Hydroxyprolin umgewandelt.
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Beispiel 3
1 mg trans-3-Hydroxyprolin wurde in 10 ml 0, 025 molarem Phosphatpuffer (pH 8, 0) aufgelöst und dann 1 mg Catalase (65 000 U/mg) zugegeben.
In die so erhaltene Lösung wurden 1 ml Kügelchen aus mit Cyanbromid aktivierter Sepharose 4B (Hersteller : Pharmacia, Uppsala) an die D-Aminosäureoxidase (1 mg) und L-Aminosäureoxidase (0, 5 mg) gebunden waren, suspendiert.
Das Koppeln der beiden Enzyme am Träger erfolgte wie folgt :
Das Gel (als Pulver) wurde in 0, 01 molarer Salzsäure quellen gelassen und schliesslich mit dem Ligandenpuffer, einem 0, 025 molaren Phosphatpuffer (pH 8, 4) in der Kälte (4 C) gewaschen. Die die beiden Enzyme enthaltende Ligandenlösung wurde dem suspendierten Gel zugegeben und 4 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert.
Hierauf wurde 4 Stunden lang bei Raumtemperatur mit molarem tris-Puffer (pH 8, 0) inkubiert, um die verbleibenden, aktiven Gruppen zu blockieren. Nach diesem Arbeitsschritt wurde das Gel mit der für die Enzymreaktion verwendeten Pufferlösung gewaschen.
Die immobilisierten Enzyme wurden mit dem Substrat 24 Stunden lang bei 37 C unter Sauerstoffdurchleitung in einem Abzug inkubiert.
Nach 24 Stunden wurden die Kügelchen (beads) absetzen gelassen und überstehende Flüssigkeit für die Reduktion abgetrennt.
Zur Ausführung der Reduktion wurden der überstehenden Flüssigkeit 5 mg NaBH4 zugegeben und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Auf diese Weise wurden 90 % des eingesetzten trans-3Hydroxyprolins als cis-3-Hydroxyprolin wiedergewonnen.
Beispiel 4
1 mg trans-3-Hydroxyprolin wurde in 10 ml 0, 025 molarem Phosphatpuffer (pH 8, 0) aufgelöst. In die Lösung wurden 2 ml von Kügelchen aus Affi-Gel-10 (Hersteller : Bio-Rad), an die 1 mg D-Aminosäureoxidase, 0, 5 mg L-Aminosäureoxidase und 1 mg Catalase gekoppelt waren, suspendiert.
Das Koppeln der drei Enzyme an die Kügelchen erfolgte wie in Beispiel 2 angegeben.
Die Oxidation und die Reduktion wurde ebenfalls wie in Beispiel 2 angegeben, ausgeführt.
Nach diesem Verfahren wurden 85 % des eingesetzten trans-3-Hydroxyprolins in cis-3-Hydroxyprolin umgewandelt.
Beispiel 5
In 100 ml 0, 025 molarem Phosphatpuffer mit pH 8, 0 wurden 1 mg trans-3-Hydroxyprolin aufgelöst. In 5 ml 0, 025 molarem Phosphatpuffer (pH 8, 0) wurden 1 mg Catalase, 1 mg D-Aminosäureoxidase und 0, 5 mg L-Aminosäureoxidase aufgelöst und die Lösung in einem Dialysebeutel (hergestellt aus einem üblichen Dialyseschlauch) eingefüllt.
Der Dialysebeutel wurde dann in die die Ausgangsverbindung (trans-3-Hydroxyprolin) enthaltene Pufferlösung gegeben.
Hierauf wurde unter Rühren und Sauerstoffdurchleiten 24 Stunden bei 37 C unter einem Abzug inkubiert.
Nach beendeter Inkubation wurde der die Enzyme enthaltende Dialysebeutel entfernt (und einer weiteren Oxidationsstufe zugeführt) und die erhaltene Lösung wie in Beispiel 2 angegeben, reduziert.
Es wurden 82 % des eingesetzten trans-3-Hydroxyprolins in cis-3-Hydroxyprolin umgewandelt.
Beispiel 6
1 mg trans-3-Hydroxyprolin, 1 mg Catalase, 1 mg D-Aminosäureoxidase und 0, 5 mg L-Aminosäureoxidase wurden in 10 ml eines 0, 05 molaren Phosphatpuffers (pH 8, 0) aufgelöst und in einen Dialyseschlauch gegeben.
Der Dialyseschlauch wurde in 100 ml des oben erwähnten Puffers gegeben und die Inkubation wie in Beispiel 5 angegeben unter Rühren ausgeführt.
Es wurden 80 % des als Ausgangsverbindung eingesetzten trans-3-Hydroxyprolins in cis-3-Hydroxyprolin umgewandelt.
Beispiel 7
Falls das als Ausgangsverbindung eingesetzte trans-3-Hydroxyprolin nicht racemisch ist, was beim Säugetiersystem der Fall sein kann, dann kann bei den oben erwähnten Ausführungsbeispielen 2 bis 6 auch ein Verhältnis zwischen L-Aminosäureoxidase zu D-Aminosäureoxidase von 1 : 10 verwendet werden.
Beispiel 8
Die in den Beispielen 2 bis 7 beschriebenen Reaktionen können auch in Gegenwart anderer, natürlich vorkommender Aminosäuren, Iminosäuren, wie z. B. in Hydrolysaten ausgeführt werden.
Je nach der Konzentration und der Natur der Aminosäuren werden 77 bis 90 % von trans-3-Hydroxyprolin in cis-3-Hydroxyprolin umgewandelt, wenn die Verfahrensweisen der Beispiele 1 bis 7 angewendet werden.
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Beispiel 9
Nach der Vorschrift von J. Häusler (Liebigs Annalen der Chemie, 1981. 1073-1088) wurde trans-3Hydroxyprolin hergestellt und als Kristalle gewonnen. Das so hergestellte trans-3-Hydroxyprolin kann nach den Vorschriften der Beispiele 1 bis 8 in cis-3-Hydroxyprolin umgewandelt werden.
Nachstehend werden einige Vorschriften für die Herstellung von Substraten, wie sie für die Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens eingesetzt werden können, angegeben.
Vorschrift l
Synthese von trans-3-und cis-3-Hydroxyprolin durch Umsetzen von Acrolein mit Amminomalonsäure :
Zu einer Lösung von 2, 2 g Natriummetabisulfit in 30 ml l molarem Natriumacetat (pH 4, 5) wurden 1, 4 ml frisch destilliertes Acrolein unter Rühren bei einer Temperatur unter 30 C zugegeben. Nach 45 Minuten wurden 1, 19 g Aminomalonsäure, aufgelöst in 30 ml molarer Kaliumacetatpufferlösung (pH 4, 5), zugegeben und 18 Stunden lang bei bis zu 60 C stehen gelassen. Hierauf wurde eine weitere Äquivalentmenge des, wie oben beschrieben, hergestellten Acrolein-Bisulfit-Adduktes in Lösung (30 ml) zugegeben. Das Gemisch wurde bei 60 C 40 Stunden lang stehen gelassen.
Man erhielt so 31 % trans-3-Hydroxyprolin und 63 % cis-3Hydroxyprolin.
Die so erhaltene Mischung der beiden 3-Hydroxyproline konnte für die Verfahren der Beispiele 1 bis 8 nicht eingesetzt werden. Es wurde daher noch die folgende Vorbehandlung ausgeführt :
Mit dem oben erhaltenen Reaktionsprodukt wurden 50 g Aktivkohle vermischt und nach intensiver Durchmischung bei 2000 g zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde auf einen Dowex W 50 Ionentauscher in der W -Form aufgegeben und die Aminosäuren fraktioniert eluiert.
Nach dem Eindampfen konnten die Aminosäuren für die enzymatische Behandlung (Beispiele 1 bis 8) verwendet werden, nachdem sie in einem 0, 025 molarem Phosphatpuffer mit pH 8, 0 aufgelöst worden sind.
Vorschrift 2
Gewinnung von trans-3-Hydroxyprolin aus Kadavern :
100 g Säugetierkadaver (Mäuse und Ratten) wurden während 16 Stunden bei 105 C mit 500 ml 6 normaler Salzsäure einer sauren Hydrolyse unterzogen.
Das erhaltene Gemisch wurde filtriert und die primären Aminosäuren nach der Vorschrift von F. Irreverre, K.
Morita, A. V. Robertson und B. Witkop (J. Amer. Chem. Soc. 8. 5" 2824 (1963) einer Trinitrophenylierung
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Hydrolysat), gefolgt von Filtration oder Zentrifugieren bei 2000 x g und Aussalzen auf einem Ionenaustauscher (Dowex W 50) in der H+-Form und fraktionelle Eluierung durch einen Ammoniumgradienten mit 0, 1 bis 0, 2 M durch Flüssigkeits-Chromatografie gewonnen.
Vorschrift 3
Abtrennung von trans-3- und cis-3-Hydroxyprolin aus handelsüblichen Champignons :
5 g feuchter Champignons werden bei 105 C 16 Stunden lang mit 20 ml 6 normaler Salzsäure hydrolysiert.
Nach beendeter Hydrolyse wurden die primären Aminosäuren zu ihrer Abtrennung einer Trinitrophenylierungsreaktion unterzogen. Nach der Filtration und einer Aktivkohlenbehandlung des Produktes (wie in Vorschrift 2 angegeben) wurde das Reaktionsgemisch durch Radialchromatografie nach dem Eindampfen zur Trockene abgetrennt.
Das cis-3-Hydroxyprolin wurde abgetrennt und verwertet und das trans-3-Hydroxyprolin wurde wie in den obigen Beispielen angegeben, in cis-3-Hydroxyprolin umgewandelt.
Vorschrift 4
Abtrennung von trans-3-Hydroxyprolin aus Kadavern :
100 g Säugetierkadaver (Mäuse) wurden bei 105 C 16 Stunden lang mit 500 ml 6 normaler Salzsäure hydrolysiert.
Das Gemisch wurde filtriert und die primären Aminosäuren einer Trinitrophenylierungsreaktion unterzogen, wie dies von Irreverre und Mitarbeitern a. a. O. beschrieben ist
Nach dem Abfiltrieren der primären Aminosäuren wurde das Reaktionsgemisch mit Aktivkohle (100 dol00 ml Hydrolysat) versetzt und hierauf filtriert oder bei 2000 g zentrifugiert
Die Abtrennung und Isolierung von trans-3-Hydroxyprolin wurde nach Eindampfen zur Trockene durch Flüssigkeit-Chromatografie ausgeführt.