DE2454052A1

DE2454052A1 - Verfahren zur herstellung von n-acylpentapeptiden

Info

Publication number: DE2454052A1
Application number: DE19742454052
Authority: DE
Inventors: Noriaki Kuwana; Tooru Sugitani; Kouichi Suzuki
Original assignee: Eisai Co Ltd
Current assignee: Eisai Co Ltd
Priority date: 1973-11-15
Filing date: 1974-11-14
Publication date: 1975-05-22
Also published as: JPS5076289A; JPS5625315B2; FR2251621A1; GB1486276A; US3929572A; FR2251621B1; DE2454052C2

Description

Verfahren zur Herstellung von N-Acy.lpentapeptiden

Die Erfindung bezieht sich auf ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von N-Acylpentapeptiden. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf ein neues Verfahren zur Herstellung von N-Acylpentapeptiden in hoher Ausbeute durch
Kultivierung von Streptomyces naniwaensisin einem Kulturmedium, das einen Vorläufer oder Vorläufer der N-Acylpentapeptide enthält.

Die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen N-Acylpentapeptide weisen nachstehende allgemeine Formel auf:

au ca, ca, ca,

OH, OH,«, CH, \/ \/

CH CH

OH CU, I OU

I/O V**»n

ii²

H-NH-Ca-CO-NH-CU-CC-IfH-CH-Cii-CH^-Ci^ KH-CH-CO-Kfl-CH-CH-CH₂-CÜOH

(D

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in der P ein Acylrest ist.

Die N-Acylpentapeptide der vorstehenden Formel (I), in der R Butyl, Propyl oder-Acetyl ist, wurden von N. Kuwana et al in den japanischen Patentschriften 39 U46/73 und ζ? 310/73 als Pepsidine A, B und C bezeichnet.

In der japanischen Patentschrift 35 900/70 wird das Pepsi-

din C von S. Murao et al als "S-PI" bezeichnet. Es sind

auch andere N-Acylpentapeptide der vorstehenden allgemeinen Formel (I) mit anderen Acylresten bekannt.

Es ist bekannt, daß alle diese N-Acylpentapeptide eine hohe Antipepsinaktivität aufweisen und daß sie durch Kultivieren von verschiedenen Actinomyces (Strahlenpilzen) erhalten werden. Die vorerwähnten Pepsidine A, B und C werden beispielsweise durch Kultivieren von Streptomyces naniwaensis EF 44-201 (ATCC 21689), einer Actinomycesart, erhalten.

Zur Kultivierung von Actinomyces zur Bildung von N-Acylpentapeptiden können verschiedene Nährböden verwendet werden, die verschiedene üblicherweise bei der Zubereitung von Nährböden verwendete Bestandteile enthalten, die zur Kultivierung v~n anderen Actinorvees verwendet werden.

Der Nährboden kann z.B. Zucker, wie Glukose und dgl., als Kohlenstoffquelle, Pepton und Fleischextrakt als Stick-

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stoffquelle und Natriumchlorid und verschiedene andere anorganische Salze enthalten.

Es ist bekannt, daß die Ausbeute an N-Acylpentapeptiden von der Art und/oder den Anteilen dieser in einem gegebenen Nährmedium enthaltenen Bestandteile abhängt (vgl. Japanese Agricultural and Biological Chemistry 35, 10, 11477-1481 (1971) und japanische Patentschrift 8996/72).

Es wurde jedoch gefunden, daß die Herstellung von N-Acylpentapeptiden in guter Ausbeute und/oder eine selektive Herstellung von bestimmten N-Acylpentapeptiden bei Ver-r wendung eines Nährbodens, der nur aus den üblichen Bestandteilen für die Kultivierung von Actinomyces besteht, nicht erreicht werden können.

tJberraschenderweise wurde nunmehr gefunden, daß die Ausbeute an N-Acylpentapeptiden beträchtlich erhöht werden kann, wenn ein Vorläufer oder Vorläufer der N-Acylpentapeptide in einen üblichen zur Kultivierung von Actinomyces verwendeten Nährboden eingebracht werden und daß ferner hauptsächlich ein bestimmtes N-Acylpentapeptid erhalten werden kann, wenn ein bestimmter Vorläufer, dessen Acylrest dem bestimmten N-Acylpentapeptid entspricht, dem Nährboden zugegeben wird.

Der Ausdruck "Vorläufer", wie er hier verwendet wird, bezeichnet Verbindungen, die einen Rest in einem entsprechenden N-Acylpentapeptid zur Verfügung stellen, ein-

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schließlich solcher Verbindungen, die als "N-Acylrestdonator" bezeichnet werden können*, z.B. M-Amino-3-hydroxy-6-methyl-heptansMure (AHMHAX per se oder in Form ihrer Derivate.

Als N-Acylrestdonatoren können aliphatische Säuren in Form ihrer anorganischen Salze, Ester und Amide erwähnt werden, wie Natrium-, Kalium- und Ammoniumsalze der Essigsäure, Propionsäure und Buttersäure, Ester von höheren Alkoholen, Polyalkoholen und anderen Alkoholen und aliphatischen Säuren, z.B. Stearyl- und Oleylacetat, -propionat und -butylat, und von Aminogruppen enthaltenden Verbindungen abgeleiteten Amiden, z.B. Aminosäuren und Aminozucker, insbesondere S-Acetylvalin und N-Acetylglukosamin. In diesem Zusammenhang wurde gefunden, daß die Verwendung eines coenzymartigen Acetylrestdonators wie eines Thiolesters der Fettsäuren, z.B. S-Acetylglutathion, zur vorwiegenden Herstellung von Pepsidin C besonders bevorzugt wird.

Die Menge an verwendetem Vorläufer ist nicht kritisch. Es wird jedoch im allgemeinen bevorzugt, eine Menge von 0,05 - 2,0% Gewicht/Volumen eines einzigen Vorläufers oder einer Mischung derselben, bezogen auf das verwendete Nährmedium, zu verwenden, um gute Ergebnisse zu erhalten.

Der Vorläufer oder die Vorläufer können in einen Nährboden in Form deren wässriger Lösung eingebracht werden.

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Sie können dem Medium auf einmal oder in Teilen zugegeben werden. .

Die Zusammensetzung des Nährmediums bei der Verwendung eines Vorläufers und die angewandten Bedingungen zur Kultivierung von Actinomyces naniv.-aensis EF UU-201 in diesem Medium gemäß der Erfindung sind nicht kritisch. Im allgemeinen kann die Kultivierung unter Schütteln und/oder Belüften bei einer Temperatur von etwa 20 2U⁰C während 10 - 120 Stunden durchgeführt werden.

Die Menge an in der kultivierten Brühe gebildeten Pepsidinen wird gemäß der verbesserten Methode zur Bestimmung der Antipepsinaktivität bestimmt, wie sie in der japanischen Patentschrift 35 900/70 beschrieben ist. 0,5 ml einer aus der kultivierten Brühe genommenen Probe wird mit einer Pufferlösung auf eine geeignete Konzentration verdünnt und 0,5 ml einer 0,01%-igen Pepsinlösung wird zugegeben. Die erhaltene Mischung wird 10 Minuten auf 37 .G erwärmt. Zur Mischung werden 2,5 ml einer 1%-igen wässrigen Caseinlösung CpH 1,6) zugegeben, 10 Minuten auf 37⁰C erwärmt und schließlich 2 ml einer 0,5 5 molaren Trichloressigsäure zugegeben. Die Mischung wird 10 Minuten in einem siedenden Wasserbad gehalten und dann mit Eis gekühlt. Der sich ergebende Niederschlag wird durch Filtration abgetrennt. Zu 1ml des Filtrats werden 5 ml einer 0,"+U molaren wässrigen Natriumcarbonatlösung und 1 ml Phenolreagenz (Folin's Reagenz) zugegeben. Nach 30-minütigem Erwärmen auf 37°C wird die Lichtabsorbtion der Mischung bei 660 nyu gemessen. Gleichzeitig wird die

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Lichtabsorption der Pufferlösung, die keine kultivierte Brühe enthält, zum Vergleich gemessen. Der Unterschied zwischen den beiden Lichtabsorptionswerten wird als Wert der Pepsininhibierungsaktivität der untersuchten Probe genommen.

Unabhängig von dem vorerwähnten Lichtabsorptionsversuch wird eine Kurve, die die Pepsininhibierungsaktivität als Standardmaß zeigt, graphisch aufgetragen, und zwar unter Verwendung von Lichtabsorptionswerten, die in ähnlicher Weise, wie vorstehend beschrieben, von wässrigen Lösungen erhalten werden, die standardisiertes kristallines Pepsidin C in verschiedenen Konzentrationen enthalten.

Die Gesamtmenge an in der kultivierten Brühe enthaltenden Pepsidinen werden dann durch Vergleich der Werte der Pepsininhibierungsaktivität in bezug auf die vorerwähnte Kurve als Standardmaß erhalten.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden N-Acylpentapeptide in höherer Ausbeute als bei bekannten Verfahren erhalten. Dies ergibt sich aus den Ergebnissen der nachstehenden Beispiele. Ferner ist besonders darauf hinzuweisen, daß eine bedeutende Erhöhung der Ausbeute bei einem bestimmten N-Acylpentapeptid durch geeignete Auswahl des Vorläufers erreicht werden kann.

Die Erfindung wird nachstehend anhand von Beispielen näher erläutert.

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Beispiel 1

15 1 eines Nährmediums mit einem Gehalt von 3% Glukose, 3% Pepton, 1% Fleischextrakt und 0,5% Natriumchlorid wurden hergestellt, nachstehend als "Nährmedium A" bezeichnet. Das Nährmedium A wurde in einem 30 1 Fermentiergefäß in üblicher Weise sterilisiert. Nach der Sterilisation mit Dampf betrug das Gesamtvolumen des sterilisierten Nährmediums 15,6 1 und wies einen pH-Wert von 6,5 auf.

300 ml einer Flüssigkeit von Streptomyces naniv.'aer.sis EF 4U-201,-die getrennt kultiviert wurden, wurden auf das vorerwähnte, sterilisierte Nährmedium eingeimpft und die Mischung bei 27 C insgesamt ¹^U Stunden kultiviert, wobei bei 300 U/min unter Belüftung mit 15 1 steriler Luft je Minute gerührt wurde. Nach 21,5-stündiger Kultivierung wurden 500 ml einer wässrigen Lösung, die 150 g Natriumacetat enthielt, in Anteilen der Kultivierungsflüssigkeit zugegeben und die Kultivierung während des verbleibenden Zeitraums fortgesetzt. Die kultivierte Brühe wurde zur Entfernung des Myzels filtriert.

Zum Vergleich wurde eine andere Kultivierung unter gleichen Bedingungen durchgeführt, jedoch mit der Ausnahme, daß keine wässrige Natriumacetatlösung zugegeben wurde.

Die erhaltenen N-Acylpentapeptide, die in dem Filtrat enthalten waren, wurden gemäß vorerwähnter Methode be-

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stimmt. Die auf diese Weise erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle I angegeben.

Tabelle I

pH-Wert trockene ZeI- relative Ausbeuten Anfang Ende len (g/dl) Pepsidine⁺ Pepsidin C

Vergleich 6,5 8,8 1,12 100 100 mit Vor- _{6 5 9} _{t 1 20} ₁₁₂ _11H läufer ' ' '

eine Mischung von Pepsidinen

Die quantitative Bestimmung der einzelnen auf diese Weise erhaltenen Pepsidine wurde folgendermaßen durchgeführt :

Ein Butanolextrakt der kultivierten Brühe wurde auf einer Dünnschichtplatte aus Kieselgel als Fleck aufgebracht und mit Benzol: Methanol : Essigsäure (80 : 20 : 5, auf das Volumen bezogen) entwickelt. Die den einzelnen Pepsidinen entsprechenden Flecke, die mit Hilfe der Rydon-Smith-Reaktion aufgezeigt wurden, wurden durch Abkratzen von der Platte und Extrahieren mit Wasser getrennt gewonnen. Die PepsininhibierungsaktivitMt der einzelnen Pepsidine wurde dann gemäß der vorstehend beschriebenen Weise bestimmt.

Aus den Werten in vorstehender Tabelle I ist ersichtlich, daß die relative Ausbeute an Pepsidinen durch den Zusatz von Natriumacetat als Vorläufer erhöht wurde.

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Das Filtrat wurde mit Ammoniumsulfat ausgesalzen und das gewonnene Produkt in Methanol gelöst. Die Methanollösung wurde durch nachfolgende Chromatographie auf Aktivkohle und einem Anior.enaus tauschharz gereinigt. Es wurden 3,9 g Pepsidin C erhalten. In ähnlicher Weise wurden 3,2 g Pepsidin C von der kultivierten Vergleichsbrühe erhalten.

Beispiel 2

15 1 eines Nährmediums, nachstehend als "Nährmedium B" bezeichnet, wurden hergestellt, das 5% Pepton, 0,1% Salz, 0,1% Kaliumdihydrogenphosphat, 0,0001% Eisen(II)-sulfat, 0,0001% Mangansulfat, 0,0001% Kupfer(II)-sulfat und 0,0001% Zinksulfat enthielt. Zum Nährmedium B wurde 1% Natriumacetat als Vorläufer zugegeben.

Das erhaltene Nährmedium wurde in üblicher Weise in einem 30 1 Fermentiergefäß sterilisiert. Nach der Sterilisation betrug das Gesamtvolumen des NMhrmediums 14,5 1 und wies einen pH-Wert von 6,8 auf.

Zum Vergleich wurde ein dem Nährmedium B ähnliches Nährmedium getrennt ohne Zusatz von Natriumacetat hergestellt

In beide auf diese Weise hergestellten Nährmedien wurde Streptomyces naniwaensds EF 44-201 in gleicher Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben, eingeimpft.

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- ίο -

Nach UO-stündiger Kultivierung unter Belüftung wurde das Myzel des eingeimpften Streptomyces naniwaensis aus beiden kultivierten Flüssigkeiten durch Filtration entfernt .

Die Werte bezüglich der beiden Kulturmedien sind nachstehend angegeben:

Tabelle II

Vergleich 6,9 8,8 0,63 100 100 Taufet" ⁶'^{8 8}>⁹ °'^{55 162 2U1}

eine Mischung von Pepsidinen

Aus dem Vergleich der vorstehenden Wert ist ersichtlich, daß eine beträchtliche Erhöhung der Ausbeute an Pepsidinen und insbesondere an Pepsidin C im Vergleich zum Kontrollversuch erhalten wurde.

Beispiel 3

Jeweils 100 ml der N^hrmedier A und B, die gemäß den vorstehenden Beispielen hergestellt waren, wurden in Schüttelkolben mit einem Fassungsvermögen von 50 ml aufgeteilt und der Inhalt der Kolben in üblicher Weise sterilisiert. Die sterilisierten Medien in den Kolben wurden mit Strepto-

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- ii -

myces naniwaens'is EF UU-201 geimpft und die Kultivierung unter Schütteln bei 27°C durchgeführt.

Gegen Ende der U8-stündigen Kultivierung wurde 1% Natriumacetat als Vorläufer zum Kulturmedium A zugegeben und die Kultivierung weitere 24 Stunden fortgesetzt.

Zum Kulturmedium B wurde andererseits 1% Natriumacetat be'im Beginn des Kultivierens zugegeben und die Kultivierung kontinuierlich .96 Stunden durchgeführt.

Die bei den kultivierten Brühen erhaltenen Werte sind nachstehend angegeben:

	h	(%]	Tabelle III	Vorläufer	relative	Ausbeuten
	72	O	Zusatz von	pH-Wert d. Filtrates	Pepsidi- ne⁺	Pepsi- din C
Kultivierung	72	1	I Zeitpunkt d. Zugabe	8,3	100 ·	100
Medium	96	O		8,5	123	123
A	96	1	nach 48 h	8,9	100	100
A		-	8,9	153	193
B		Beginn
B

eine Mischung von Pepsidinen

Aus einem Vergleich der vorstehenden Werte mit jenen der Kontrollversuche ist ersichtlich, daß eine bedeutende Erhöhung der Bildung von gemischten Pepsidinen und Pepsidin C bei den kultivierten Brühen, bei denen ein Vorläufer zugegeben wurde, beobachtet wird.

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Beispiel *♦

0,1% S-Acetylglutathion oder AHMHA als Vorläufer wurden bei der Herstellung zum vorerwähnten Nährmedium B zugegeben. Die Kultivierung und Bestimmung der kultivierten Brühe wurde gemäß Beispiel 2 durchgeführt. Die erhaltenen Werte sind nachstehend angegeben:

Tabelle IV

Zusatz an Vorläufer

Kulti- pH-Wert relative Aus· vierung d. FiI- beuten trats

	Konzentra tion (%)	Zeit punkt d. Zu satzes	(h)	8,8	Pepsi- dine ⁺	Pepsi- din C
S-Acetyl- gluta- thion	0	-	96	8,9	100	100
!t	0,1	Beginn	96	8,5	152	184
AHMHA	0	-	72	8,6'	100	100
»	0,1	Beginn	72	189	234

eine Mischung von Pepsidinen

Aus vorstehenden Werten ist ersichtlich, daß die Zugabe von bestimmten Vorläufern die Ausbeute an Pepsidinen im Vergleich zu Kontrollversuchen, bei denen keine Vorläufer zugegeben werden, beträchtlich erhöht. Besonders führt der Zusatz von Vorläufern zu einer erhöhten Bildung von Pepsidin C.

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Claims

- 43 - Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung von N-Acylpentapeptiden durch Kultivierung von Actinomyces, dadurch g e kennzeichne t, daß die Kultivierung in einem Kulturmedium durchgeführt wird,, das mindestens einen Vorläufer der N-Acylpentapeptide enthält.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Natriumacetat als Vorläufer verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß S-Acetylglutathion als Vorläufer verwendet wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß 4-Amino-3-hydroxy-6-methylheptansäure oder deren Derivate als Vorläufer verwendet werden.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennze ichnet, daß Streptomyces r.aniwaensis EF 44-201 (ATCC 21689) als Actinomyces eingesetzt wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5 zur Herstellung von Pepsidin C, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces naniwaensis EF 44-201 (ATCC 21689) in einem Natriumacetat oder S-Acetylglutathion als Vorläufer enthaltendem Nährmedium kultiviert.

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