DE1767157A1

DE1767157A1 - Verfahren zur Anreicherung von L-Asparaginase

Info

Publication number: DE1767157A1
Application number: DE19681767157
Authority: DE
Inventors: Alfred Dr Arens; Klaus Dr Bauer; Eckart Dr Irion; Wilfried Dr Kaufmann; Erich Dr Rauenbusch; Otto Dr Wagner
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1968-04-06
Filing date: 1968-04-06
Publication date: 1971-09-02

Description

Verfahren zur Anreicherung von L-Asparaginase Gegenstand des deutschen Patentes . ... ... (Anmeldung P 16 42 615.6) und des Zusatzpatentes . ... ... (Anmeldung P 17 67 158.8) ist ein Verfahren zur Anreicherung von L-Asparaginase durch fraktionierte Fällung mit Polyäthylenglykol.
Das dort beschriebene Verfahren führt zu Spitzenprodukten mit einem Reinheitsgrad der L-Asparaginase bis zu 150 U/ mg Protein. Für die klinische Anwendung der L-Asparaginase erscheint es jedoch notwendig, den praktisch erreichbaren Reinheitsgrad weiter zu steigern. Das Verfahren zur Erreichung dieses Zieles soll außerdem auf technische Dimensionen übertragbar sein.
Es wurde nun gefunden, daß man die Reinheit der L-Asparaginase dadurch erheblich verbessern kann, daß man das mittels Polyäthylenglykol-Fällung auf eine Aktivität von 100 bis 150 U/mg Protein vorgereinigte Enzym einer Fällung beim isoelektrischen Punkt des Enzyms unterwirft.
An seinem isoelektrischen Punkt von etwa pH 4,9 hat das Enzym eine geringere Löslichkeit als alle übrigen in der Lösung noch vorhandenen Proteine. Dies führt zur Ausflockung der L-Asparaginase, welche man durch Zugabe von geringen Mengen Polyäthylenglykol oder von wassermischbaren organischen Lösungsmitteln unterstützen kann. Zweckmäßig@führt man diese Operation durch, indem man den pH-Wert auf etwa 4,9 bis 5,5 einstellt und die Fällung bei niedrigen Temperaturen vornimmt.
Der Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens gegenüber der reinen oder modifizierten Polyäthylenglykol-Methode der beiden obengenannten deutschen Patente liegt in folgendem: 1. Man benötigt keine oder nur geringe Mengen an Fällungsmitteln.
2. Man gelangt ausgehend von einer spez. Aktivität der L-Asparaginase um 100 bis 150 U/mg Protein zu einer spez. Aktivität bis zu 190 U/mg Protein.
3. Die Methode liefert das Ausgangsprodukt für die Kristallisation der L-Asparaginase.
Die erfindungsgemäß hergestellten Präparate sollen als Arzneimittel für die bekannten Indikationen der L-Asparaginase verwendet werden. Beispiel 1 100 g L-Asparaginase mit einer spez. Aktivität von etwa 100 U/mg Protein werden in 1000 ccm destilliertem Wasser bei Zimmertemperatur gelöst. Während des Lösungsvorganges wird der pH-Wert mit 1 n NaOH auf 8,5 bis 8,9 eingestellt. Das dann verbleibende Unlösliche wird 10 Minuten bei 6000 Umdrehungen/Minute abzentrifugiert. Der pH-Wert des .klaren Überstandes wird im Eisbad langsam auf pH 7 bis 6,8 gebracht. Ein sich dort abscheidendes öliges Sediment wird 25 Minuten bei 6000 Umdrehungen/Minute abzentrifugiert. Der klare Überstand dieser Zentrifugation wird mit 1 n HCl auf PH 5,3 eingestellt. Danach werden stufenweise je 25 ml einer 50-%igen Polyäthylenglykol-Lösung hinzugegeben und jeweils bei 6000 Umdrehungen/Minute über 10 Minuten abzentrifugiert. Man erhält auf diese Weise etwa 5 bis 6 Fraktionen, wobei die Hauptaktivität mit der höchsten spez. Aktivität in Fraktion 3 bis 5 enthalten ist.
Ausbeute: 60 bis 70 %. Beispiel 2 Es wird wie in Beispiel 1 verfahren, jedoch wird anstelle von Polyäthylenglykol kaltes Aceton in vier Schritten bis zu 20 N des Lösungsvolumens hinzugegeben. Die Ausbeuten sind denen aus Beispiell ähnlich.
Beispiel _3 Es wird wie in Beispiel 1 verfahren, jedoch wird anstelle von Polyäthylenglykol Äthylalkohol in fünf Schritten bis zu 20 % des Lösungsvolumens hinzugegeben. Die Ausbeuten sind denen aus Beispiel 1 ähnlich.
Beispiel 100 g L-Asparaginase mit einer spez. Aktivität von 110 U/mg Protein werden in 500 ml Wasser gelöst. Der pH-Wert der Lösung wird mit 1 n NaOH auf 8,_5 eingestellt. Ungelöst gebliebene Substanz wird bei 6000 Umdrehungen/Minute über 15 Minuten abzentrifugiert. Der ph--Wert der klaren Lösung wird bei 40C und mit 1 n HCl auf pH 6,8 eingestellt und der dabei auftretende Niederschlag abzentrifugiert. Der klare Überstand nach der Zentrifugation wird mit 1 n iiCl langsam auf pH 5,0 bis 5,1 eingestellt und bei 4 °C über mehrere Stunden belassen. Der danach aufgetretene Niederschlag wird abzentrifugiert. Er enthält die L-Asparaginase mit einer Ausbeute von 60 bis 80 % der eingesetzten Aktivität und mit einer maximalen spez. Aktivität bis zu 190 U/mg Protein. Beispiel 5 200 g Roh-Asparaginase mit einer Aktivität von 97 U/mg werden in 4000 ml Glykokollpuffer, pH 8,5, (Biochemisches Taschenbuch, Seite 91, 1964) gelöst und portionsweise 30 Minuten auf 600C erhitzt. Hierbei flockt inaktives Protein aus, während das Enzym unverändert in Lösung bleibt. Der Ansatz wird bei 6000 Umdrehungen/Minute klargeschleudert und mit Aceton fraktioniert. Der bei Zugabe von 40 bis 45 % Aceton ausfallende Anteil beträgt 16,4 g. Er enthält 863 U/mg. 9,3 g dieser angereicherten Asparaginase werden in 190 ml 3-molarer Harnstofflösung gelöst, mit Natronlauge auf pH 8,5 eingestellt und mit Polyäthylenglykol (50-%ige wäBrige Lösung) fraktioniert. Die nach Zugabe von 22 bis 30 ml anfallende Fraktion wird gewonnen und wie üblich aufgearbeitet. Ausbeute 2,1 g; U/mg: 3130.
Eine Lösung von 4,0 g dieser Probe in 40 ml bidestilliertem Wasser wird mit 1 n Salzsäure auf pH 5,2 eingestellt und mit Polyäthylenglykol-Lösung fraktioniert. Der nach Zugabe von 12,5 bis 15 ml ausfallende Anteil wird nach 20-minütigem Stehen bei Raumtemperatur abgeschleudert und nach zweistündigem Stehen unter Aceton mit weiterem Aceton gewaschen. Ausbeute 1,2 mg; U/mg: 6110.

Flache Prismen; Braunfärbung bei 225°C; Sintern ab 260°C; Schäumen ab 2700C und vollständige Zersetzung ab 274'DC. Die so erhaltenen Kristalle werden aus wäßrigen Lösungen durch Zusatz organischer Lösungsmittel, wie Aceton oder Alkohol, oder durch Zugabe von Polyäthylenglykol umkristallisiert. Die Kristalle zeigen folgende Analysenergebnisse:

Wassergehalt: 12,5

Die H20-Gehaltsbestimmung erfolgte durch

6-stündiges Trocknen im Hochvakuum bei

110°C in einer Spezial-Trockenpistole

nach J. Unterzaudrer /Mikroehem. 18,

315 (1935)7. Auf Gewichtskonstanz wurde

durch fortgesetzte Trocknung geprüft.)

Glührückstand: 0,11

(Die Bestimmung des Aschegehaltes von

Proteinen erfolgte nach F. Pregl und

H. Roth /Quantitative organische Mikro-

. analyse, Seite 174, Springer, Wien

(194927).

Proteingehalt: 88,0

(Die Proteinbestimmung erfolgte nach

Triehloressigsäurefällung nach der

BTURET-Methode /fi.E. Weiselbaum,

Am. J. Clin. Path. (Techn. See.), 10,

40 (194627).

Gesamtvolumen: 4 ml (davon 2 ml

Biuret-Reagenz):

Die Sedimentationskonstante zeigte einen Wert von

Claims

Patentansprüche 1. Verfahren zur Anreicherung von L-Asparaginase, dadurch gekennzeichnet, daß man das mittels Polyäthylenglykol-Fällung auf eine Aktivität von 100 bis 150 U/mg Protein vorgereinigte Enzym einer Fällung beim isoelektrischen Punkt des Enzyms unterwirft.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Fällung durch geringe Mengen Polyäthylenglykol unterstützt.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Fällung durch wassermischbare organische Lösungsmittel unterstützt.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man hochprozentige Lösungen einer vorgereinigten L-Asparaginase einer Fällung am isoelektrischen Punkt des Enzyms unterwirft.
5. Kristallisierte L-Asparaginase.