DE1642745B2 - Verfahren zur Gewinnung von 6-Methyl-Δ ↑8,9↑ -ergolen-8-carbonsäure - Google Patents

Description

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In der belgischen Patentschrift 652378 ist ein Verfahren zur Gewinnung von 6-Methyl-/l^-ergolen-8-carbonsäure durch saprophytische Züchtung eines neuen, in vitro konidienbüdenden Pilzstammes der Species Claviceps paspali Stevens et Mall in Submerskultur resp. Permenterkultur und anschließender Exfraktion der o-Methyl-zlw-ergolen-e-carbonsaure aus dem Kulturfiltrat auf an sich bekannte Weise, beschrieben. Dieser Pilz wurde beim United States Department of Agriculture (Northern Utilisation Research and Development Division), Peoria, UL hinterlegt und erhielt dort die Depotnummer NRRL 3080.

Es wurde nun gefunden, daß man aus diesem Pilzstamm durch Röntgen- und/oder U.V. Bestrahlung und/oder Behandlung mit Äthylenimin auf an sich bekannte Weise Mutanten gewinnen kann, die im oben genannten Verfahren ö-Methyl-^w-ergolen-e-carbonsäure in größerer Ausbeute bilden als der Ausgangsstamm. Eine dieser Mutanten wurde beim United States Department of Agriculture (Northern Utilisation Research and Development Division), Peria, IH. hinterlegt und erhielt dort die Depotnummer NRRL 3167.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Gewinnung von ö-Methyl'Zlw.ergolen-e-carbonsäure durch saprophytische Züchtung eines in vitro der Konidienblldung fähigen Stammes der Species Claviceps paspali Stevens et Hall und durch Isolierung dieser Säure aus dem Kulturfiltrat ist nun dadurch gekennzeichnet, daß man Mutanten des Stammes NRRL 3080, die ein gegenüber dem Ausgangsstamm vergrößertes Alkaloidproduktionsvermögen besitzen, wöbet auch der Anteil an 6-Methyl-4W-ergolen-8-carbonsäure im Alkaloidgemisch gegenüber dem Ausgangsstamm höher liegt, umsetzt.

Die Herstellung der Mutanten kann beispielsweise wie folgt durchgeführt werden:

Man suspendiert Konidien des Pilzstammes NRRL

3080 in Wasser und verteilt diese Suspension auf die Oberfläche von Malzagar, mit dem Petrischajen ausgegossen werden, wobei pro Petrischale pa, 1000 Sporen ausgesät werden. Die Agaroberfläche wird dann mit ultraviolettem Hebt bestrahlt, bis pro Petrischale nur noch 5—10 Konidien auskeimen; dieses entspricht einer Abtöftwgsrate von 99—09JS^), Der Abstand von der lichtquelle (z, B. Hanaulampe) und die Belichtungsdauer werden in Vorversuchen empirisch ermittelt Aus den überlebenden Sporen entstehen im Verlauf von 10—14 Tagen bei 22° makroskopisch sichtbare Kolonien, Diese werden weiter überimpft, um auf die im Hauptpatent beschriebene Weise Kulturen mit Konidien zu gewinnen.

Aus den so gewonnenen Mutanten werden mit Hilfe von Züchtungsversuchen diejenigen ,Stämme ausgewählt, die sich durch ein besonders hohes AlkaloidbU-dungsvermögen auszeichnen und einer weiteren mutagenen Behandlung mit Hilfe von Äthylenimicunterworfen. Dazu werden die Konidien bei 24° während 2 Stunden in einer l%oigen Äthyleniminlösung suspendiert, die Sporen mittels eines Membranfilters von der Lösung getrennt, auf dem Filter mit sterilem Wasser gewaschen und dann auf Agarplatten ausgeimpft Bei dieser Behandlung beträgt die Abtötungsrate ca. 99%.

Von den überlebenden Stämmen werden wiederum, wie oben beschrieben, die Mutanten mit dem höchsten Aükaloklbildungsvermögen ausgewählt und ggf. noch 5—10 Male einer mutagenen Behandlung mit Athyleniniin unterworfen. So erhielt man beispielsweise bei 6f acher Wiederholung dieser Behandlung mit Äthylen-ΐπίάη einen besonders stark alkaloidbfldenden Stamm, der beim Unhed States Department of Agriculture (Northern Utilisation Research and Development Division), Peoria, QL die Depotnummer NRRL 3167 erhielt

Beispiel 1

Eine wie vorstehend beschrieben auf einer Malzagarplaite gewachsene Kolonie des Stammes NRRL 3167 wird mit einem Spatel in Stücke zerteilt und in ein Reagenzglas mit 12 cm³ des folgenden Agarnährbodens übertragen:

Bierwürze 500 ml Getrocknetes Maisquellwasser 60 g Milchsäure 1 ml Salmiaklösung bis pH 4,8

Agar-Agar 20 g
Dest Wasser ad 1 L

Um jedes Impfstück bildet sich e'tpz kleine Kolonie von zunächst weißem, später rotbraunem Mycel. Nach lOTagen beginnen sich an den Hyphenspitzen Konidien abzuschnüren. Nach 20 Tagen sind genügend Konidien vorhanden, um damit eine wäßrige Suspension herzustellen, mit welcher 20 Schrägagar-Röhrchen (Zusammensetzung des Agars wie oben angegeben) beimpft wurden können.

Diese Kulturen werden bei 24° C bebrütet Die Konidien keimen nach 24—36 Stunden. Nach 6 Tagen ist die Agaroberfläche von einem feinen, weißen Mycel gleichmäßig Überzogen, nach 10 Tagen ist eine braungraue, feingefurchte Myceldecke gebildet, welche dem Agar eng aufliegt und nur kurze Lufthyphen hat An diesen werden Konidien abgeschnürt Nach 12 Tilgen entstehen an mehreren Stellen im Mycel Zentren, an welchen kleine Tröpfchen einer rotbraunen Flüssigkeit ausgeschieden werden. Die Tröpfchen erreichen

efeen Durchmesser von 1—3jnm und werden bajd von sehr ssnlreichen Konidien mflcWg-flfltJ. Nach 16-48 Tagen ist die^piH<};enMdwg prelföseb ^geschlossen, ^ine jScbrigRgRriculiup in einemlReegeiwglRf yw 2 cm Durchmesser mit 12 ml AgarrN8hrt>pden(Zusammenseizung des NttrbocJens wie oben abgegeben) enthält ca, 1(P Konidien,

Für die Züchtung in Submerskultur wird zunächst eine Vorkultur wie folgt bereitet;
Als Medium wird eine 4,5prozentige wäßrige Malzextraktlösung mit pH 5,4 verwendet; Ein Liter dieser Lösung wird in einem 2-L-ErIenmeyerkoIben 20 Minuten bei 110° C sterilisiert, hernach mit 6.10* Konidien von einer 15 Tage alten Agarkultur beimpft und 3 Tage lang auf einer rotierenden Schüttelmaschine bei 24° C inkubiert Es entsteht eine dichte Kultur aus feinen MycelHocken. Die Flocken bestehen aus einem lockeren Knäuel von Hyphen haben einen Durchmesser von 2—4 mm. Es sind keine Alkaloide nachweisbar.

Zur Herstellung größerer Mengen Vorkultur werden Glasfermenter, welche je 1OL desselben Mediums enthalten, mit je.g.10⁹ Konidien beimpft und 3 Tage bei 23° C unter Beilüftung mit 6 L Luft pro Minute und Rohren mit 300 U.pM. bebrütet Zur Schaumbekämpfung wird eine Siliconemulsion verwendet Die so erhaltenen Fennenterkulturen sind von gleicher Beschaffenheit wie die Schüttelkulturen.

Für die Hauptkultur erweisen sich die folgenden Nährlösungen, die in 1 L destilliertem Wasser Methode

Nährlösung

Nährlösung
B

Sorbit

Bernsteinsäure
KH₂PO₄
MgSO₄

FeSO₄
ZnSO₄

7H₂O
7H₂O

50g
36g

2g

0,3 g

1 mg
10 mg

100 g

36 g

2g

1 mg
10 mg

enthalten und mit NH₄OH auf pH 5,4 eingestellt werden, als besonders zweckmäßig.

Die Nährlösung A wird mit 10% einer 3 Tage alten Vorkultur beimpft und in Portionen von 100 ml in 500 ml Erlenmeyerkolben auf einer reziprok schüttelnden Maschine bei 23" C inkubiert

Andere Kulturen werden in analoger Weise in einem 170L Nährmedium enthaltenden Fermenter aus rostfreiem Stahl gezüchtet Dabei wird mit 170 L Luft pro Minute belüftet und mit anfänglich 70, später 180 U.p.M. gerührt Zur Schaumbekämpfung wird eine Siliconemulsion verwendet

Auf diese Weise entstehen Kulturen aus zahlreichen, gleichartigen Mycelpartikeln. Diese haben einen Durchmesser von ca. 5 mm und besitzen einen kugeligen, kompakten Kern von ca. 1 mm Durchmesser aus pseudoparenchymatischem Gewebe. Dieser Kern trägt sternartig angeordnete, ca. 2 mm lange Fortsätze aus parallel gelagerten Hyphen. Am Ende der ca. lOtägigen Kulturdauer ist das Mycel dunkelbraun und das Filtrat intensiv rotbraun gefärbt Der pH-Wert verändert sich nur unwesentlich. Für das auf diese Weise erhaltene Kulturfiltrat wurde der Gesamtalkaloidgehalt kolorimetrisch bestimmt (bezogen auf ein Molekulargewicht von 300). Die Zusammensetzung des Alkaloidgemisches wurde papierchromatographisch ermittelt. Die so erhaltenen Werte sind nachstehend zusammengefaßt:

Gesamt- Zusammensetzung des aUmlöid· Aflcalöidgerofeebes gehalt,

mg/titer 6rMethyt Clavin-Kölwrfiltrat dWrergpten- ⁸^- 8-earbon- loide slure'; ^: ■ .

Schüttelkultur 3300 89% 11% Fermenterkultur 2480 93% 7%

jo Die Isolierung der 6-Metbyl-/J⁸i⁹-ergplen-8-c4.;bon' säure aus dem Kulturfiltrat kann nach verschiedenen Methoden erfolgen. Vorzugsweise wird sie dem Kulturfiltrat durch einen stark sauren Kationenaustauscher auf der Basis von Sulfonsäureharzen entzogen, von diesem durch Behandlung mit verdünntem Ammoniak- abgelöst und durch Einengen des Eluates und Einstellen des pH-Wertes der Lösung auf ihren isoelektrischen Punkt zur Kristallisation gebracht

Beispiel 2

e-MethyM^-ergolen-e-carbonsäure

5 L Kulturfiltrat des neuen Stammes von Claviceps paspali Stevens et Hall gemäß Beispiel 1 mit einem kolorimetrisch bestimmten Gesamtgehalt an Ergolin-Derivaten von ca. 3300 mg/L (bezogen auf ein Mol-Gew. von 300) und einem pH-Wert von 5,6 werden durch eine mit Wasser eingeschlämmte Säule von 3500 g eines stark sauren Kationenaustauschers auf der Basis von Sulfonsäureharzen (Durchmesser der Säule 2fl cm; Höhe 115 cm) filtriert Die Durchlaufgeschwindigkeit beträgt 500 Atl/Std. Nach dem Waschen der Säule mit 6 L Wasser wird die 6-Methyl-/lW-ergoIen-8-carbonsäure mit 5proz. Ammoniak eluiert Der in Fraktionen von je 500 ml gesammelte Durchlauf wird durch Fluoreszenz im UV. und Farbreaktion nach Keller (FeCb-Eisessig, H₂SO₄ konz.) auf den Gehalt an Ergolin-Derivaten geprüft Die ersten vier Fraktionen (insgesamt 2 L) dampft man bei 13 mm Torr und 30° Badtemperatur auf 500 ml ein, stellt die Lösung mit Eisessig auf einen pH-Wert von 5,5, filtriert vom ausgefallenen Harz (Keller-Farbreaktion negativ) ab, engt das Filtrat im Vakuum auf ca. 25 ml ein, fügt 20 ml Methanol zu, kocht die Lösung kurz auf und läßt bei 5" einige Std. stehen. Die auskristallisierte Säure wird nach dem Abfiltrieren mit Wasser und Methanol gewaschen und bei 80° 2 Std. im Vakuum getrocknet Die folgenden sieben Fraktionen des Ammoniak-Durchlaufs liefern nach der gleichen Aufarbeitung eine weitere Menge

so kristallisierter e-Methj'l-zlW-ergolen-e-carbonsäure.

Zur Reinigung der rohen Säuren werden die kristallisierten Produkte vereinigt, in 5proz. alkoholischem Ammoniak gelöst, die Lösung nach Filtration mit 2 N Essigsäure auf pH 5,5 gestellt, kurz auf dem

Wasserbad erwärmt, die kristallisierte Säure nach einigen Std. abfiltriert, mit Wasser und Methanol gewaschen und im Vakuum bei 80° getrocknet Smp. 243-245° (Zers.),[«]_o« -180* (0,1 NNaOH).

Hydrochlorid:

Smp.257-259° (Zers.);
[«]d=-176° (in 0,1 N HCI).

Vergleichsversuch

Die nachstehende Tabelle gibt einen Vergleich des Alkaloidproduktionsvermögens des Stammes NRRL 3080 gemäß der BE-PS 6 52 378 und NRRL 3167 in der Schüttelkultur.

NRRL AIIwIpW ,. ,

4^ergp|en- Lysergsäure, "»mid, " """"" IsplysCTgsRwre,

3080 620mg/L 86,5%

3167 3330 mg/L 89% 11%

Die obigen Ergebnisse zeigen die gegenüber dem Stand der Technik mit dem neuen Stamm NRRL 3167 erzielten höheren Ausbeuten an Alkaloiden.

Claims (3)

Patentansprüche;

1. Verfahren zur Gewinnung von e-MetbyM^-ergolen-8-carbonsäure durch saprophytische Zöchtung eines in vitro der KonidienbiJdung fähigen Stammes der Species Claviceps paspali Stevens et Hall und durch Isolierung dieser Säure aus dem Kulturfiltrat, dadurch gekennzeichnet, daß man Mutanten des Stammes NRRL 3080, die ein gegenüber dem Ausgangsstamm vergrößertes Alkaloidproduktionsvermögen besitzen, wobei auch der

.Anteil an fr-Methyl-^W-ergolen-e-carbonsäure im Alkaloidgemisch gegenüber dem Ausgangsstamm höher liegt, einsetzt

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zur saprophytischen Züchtung die Konidien verwendet

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mutante des Stammes NRRL 3080 den Stamm NRRL 3167 einsetzt