DE1620646A1

DE1620646A1 - Verfahren zur Inhibierung der Bildung von N-alkylierten Pyrrolidinen

Info

Publication number: DE1620646A1
Application number: DE19661620646
Authority: DE
Inventors: Argoudelis Alexander Demetrios; Johnson Leroy Emanuel; Pyke Thomas Richard
Original assignee: Upjohn Co
Current assignee: Pharmacia and Upjohn Co
Priority date: 1965-10-18
Filing date: 1966-10-14
Publication date: 1970-05-14
Also published as: CH479698A; US3313801A; NL6614333A; BR6683299D0; GB1160527A; BE688405A; FR1502946A; IL26601A; SE327958B; ES332302A1; DK114472B

Description

DH A

Dr. rkns Chr. Beil ^r13. Okti 1966

Frankfurt a. M.-Höchst

Adeloiutraße 58 - Tet 3126 4§ .

Unsere Nr/ 13 138

The Upjohn Company
Kalamazoo (Michigan), V.St.A.

Verfahren zur Inhibierung der Bildung von N-alkylierten

Pyrrolidinen

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Inhibierung der Bildung von N-alkylierten Pyrroli; dinen und substituierten Pyrrolidinen durch Mifcroorga-. nismen während Fermentationen. Insbesondere betrifft sie ein Verfahren, bei welchem ein Stoffwechselinhibitor in Form eines wasserlöslichen Sulfonamids mit antibakteriellen Eigenschäften und ferner ein Carbonylreagenz, welches Glutaminsäuredicarboxylase inhibiert, einer mikrobiologischen Fermentation zugesetzt wird zwecks Inhibierung der Bildung von N-alkylierten Pyrrolidinen und substituierten Pyrrolidinen.

Beispiele für Stoffwechselinhibitoren,, die im erfindungs- ' gemäßen Verfahren verwendet werden können, sind folgende Verbindungen und ihre Salze: SuIfanilamid, SuIfaguanidin, Sulfathiazol, Sulfadiazin, N-SuIfanilbenzamid, SuIfachinoxolin, Sulfabrommethazin, N'-Acetylsulfanilamid, Sulfadimethoxin, Sulfamerazin, Sulfamethazin, SuIfapyrazin_? Sulfapyridin, Thiocarbohydrazid, Semicarbazid, Thiosemicarbazid, Furancarbonsäurehydrazid, Isonicotinsäurehydrazid und Hydroxylamin.

009820/1918

BAD ORIGINAL

öas erfindungsgemäße Verfahren kann bei Fermentationen angewendet werden, welche mit dem Microorganismus Streptomyces lincolnensis var. lincolnensis arbeiten, der im US-Patent 3 086 912 als Produzent des Antibiotikums Lincomycin beschrieben wird. Wird ein, Stoffwechselinhibitor dem in Beispiel 1 des US-Patentes 3 086 912 beschriebenen Verfahren zugesetzt, so bildet sich das Antibiotikum Lincomycin D. Lincomycin D ist N-DemethyI-lincomycin der folgenden Formel

CH₃

C₃H₇ 1 HO - CH

JjC —- NH." CH

■ '■ S

0 H

OH H

SCH.

H OH

Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch auf die fermentative Bildung von Celesticetin angewandt werden, die in Beispiel 3 des US-Patentes 2. 928 844 beschrieben wird. Man erhält als Produkt die neue Verbindung N-Demethylcelesticetin, die folgende Formel besitzt:

ORIGINAL

009820/1910

-■■?.*

NH

CH*

PH

N-pemethy!celesticetin kann nach dem Verfahren des VS-Patentes 2 851 463 hydrolysiert werden unter Bildung neuen Verbindung N-Pemethyldesalicetini die folgende For·· mel besitzt:

CH.

CH,D-CH

HN

N ι

Das erfindungsgemäße Verfahren wird durchgeführt, indem man in ein Fermentationsmedium eine wirksame Menge eines metäbölischen Inhibitors, die im pereich von mehr als zu·^ fälligen Vereunreinigungen von Ö,P1 gijrö Liter bis zu 8 g pro Liter Öärmedium liegt, zusetzt.Der lüiJji^^tor kann ursprünglich im Hedium vorliegen,.' oder er kar^n der Züchtung

während der Fermentation zugeführt werden. Die Zufuhr kann kontinuierlich, halbkontinuierlich oder anderweitig erfolgen, wobei die Konzentration des Inhibitors im Fermentationsmedium das Wachstum der Organismen nicht derart beeinträchtigen darf, daß die Bildung der gewünschten Verbindung leidet. Vorzugsweise wird mit der Zugabe begonnen, sobald die Fermentation 24 bis 48 Stunden alt ist. Die toxische Konzentration des Inhibitors ist veränderlich und hängt vom Mikroorganismus, der Anlage und dem verwendeten Medium ab, wobei jedoch im allgemeinen zu jeder Zeit während der Fermentation eine Menge von weniger als 5 g pro Liter des Fermentationsmediums nicht toxisch wirkt. -JMari kann daher so vorgehen, daß die Zufuhr derart gesteuert wird, daß die Menge an Inhibitor nie mehr als 5 g pro Liter während der Fermentation beträgt. Bei Erhöhung der Menge kann, wiederum in Abhängigkeit von der Anlage oder dem betreffenden Medium, Toxizität festgestellt wer-,den, die sich z.B. in einem verminderten Mycelwachstum äußern kann. Wird das Mycelwachstum durch die Zugabe des Inhibitors merklich herabgesetzt, so erfolgt gewöhnlich auch eine merkliche Erniedrigung der Ausbeute an gewünschtem Produkt.

Wird ein Stoffwechselinhibitor der vorstehend beschriebenen Art einer Lincomycin-Gärung der in US-Patent 3 086 912 beschriebenen Art zugesetzt, so erhält man Lincomycin D und etwas Lincomycin. Bei Zusatz des Inhibitors zu einer Celesticetin-Gärung werden N-Dernethyl-celestl· cetin und etwas Celesticetin gebildet. Ein bevorzugtes Verfahren zur Aufarbeitung von Lincomycin D und N-Demthylcelesticetin besteht in der Verwendung eines flüssigen Kationenaustauschers. In der ersten Stufe dieses Verfahrens wird die Gärbrühe mit einem mit Wasser nicht mischbaren flüssigen Kationenaustauscher in Berührung ge-

00 9820/ 1918

_. 5 —

bracht, "welcher mindestens ein mit Wasser nicht mischbares organisches Verdünnungsmittel und mindestens, ein Öllösliches Salz einer aromatischen Sulfonsäure enthält, wobei diese Säure 1 bis 2 aromatische Ringe und mindestens eine Alk-ylgruppe und insgesamt mindestens 15 Alkyl-Kohlenstoffatome aufweist bei einem aromatischen Ring, mindestens 8 Alkyl-Kohlenstoffatome bei zwei aromatischen Ringen. In zweiter Stufe wird der eluierte flüssige Katiohenaustauscher mit einem Gemisch aus Wasser und mindestens einem Abstreifmittel in Form eines Amines, eines wasserlöslichen Säureadditionssalzes eines Amines oder eines wasserlöslichen quaternären Ammoniumsalzes bei einem pH-Wert von weniger als etwa 7 in Berührung gebracht. J] resultierende wässrige Lösung kann dann direkt als Quelle des Stickstoff-basischen Materials verwendet werden, oder das Stickstoff-basische Material kann auel der wässrigen Lösung in Form der freien Base oder in Form eines Säureadditionssalzes in an sich bekannter Weise isoliert werden.

Der mit Wasser nicht mischbare flüssige Kationenaustauscher enthält mindestens ein mit Wasser nicht mischbares organisches Verdünnungsmittel und mindestens ein öllösliches Salz einer aromatischen Sulfonsäure. Ein mit Wasser nicht mischbares Verdünnungsmittel ist ein solches _t das in Berührung mit einem gleichen Volumen Wasser ein flüssiges Zweiphasensystem bildet. Beispiele für geeignete mit Wasser nicht mischbare organische Verdünnungsmittel sind die Alkane wie z.B. Pentan, Hexan, Heptan, Oxan und dergleichen, insbesondere die handelsüblichen Gemische isomerer Hexane und Heptane, die Cycloalkane wie z.B. Zyclohexan, Methylcyclohexan und dergleichen, aromatische Kohlenwasserstoffe wie z.B. Benzol, Toluol, die Xylole, Trimethylbenzole, Äthylbenzol, Cymöl, Cumol, Tetrahydro-

009820/ 1918

naphthalin und dergleichen,.haiogenierte Kohlenwasserstoffe wie z.B. Dichlormethan, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, 1,2-Dichloräthan, 1,1,2,2-Tetrachloräthan, Chlorbenzol, Dichlorbenzole und dergleichen, Äther wie Diäthyläther, Diisopropyläther und dergleichen, Ester wie Äthylacetat, Butylacetat, Methylbenzoat und dergleichen und Nitroverbindungen wie z.B. Nitromethan, Nitrobenzol und dergleichen. Dichlormethan wird als organisches Verdünnungsmittel speziell bevorzugt. Der kationische Anteil des öllöslichen SuIfosäuresalzes kann aus den verschiedensten Metallkationen bestehen. Bevorzugt werden Alkalimetallkationen wie z.B. Natrium-, Kalium- und Ammoniumionen, sowie Erdalkalikationen wie z.B. Magnesium-, Calcium- und Bariumionen. Jedoch können auch andere Metallkationen wie z.B. Aluminium-, Zink- und Kupferionen verwendet werden. Der anionische Anteil des öllöslichen SuIfonsäuresalzes kann aus verschiedenen aromatischen Sulfosäuren oder Gemischen davon stammen. Bevorzugte SuIfc*- säuren sind solche, die durch Sulfonierung von Mono- oder Polyalkylbenzolen oder Naphthalinen erhalten werden. Diese Sulfonsäuren und ihre öllöslichen Salze sind in sich bekannt und im Handel zugänglich. Zur Trennung von Lincomycin und Lincomycin D bei der fermentativen Herstellung von Lincomycin sowie von Celesticetin und N— Demethylcelesticetin bei der fermentativen Celesticetinherstellung sind weitere Operationen nötig. Beispielsweise kann man eine das Antibiotika-Paar enthaltende Lösung wiederholt bei einem alkalischen pH—Wert extrahieren. Als Lösungsmittel für Lincomycin und Celesticetin kann man beispielsweise ein chloriertes niedriges Alkan wie Methylenchlorid verwenden. Dieses Lösungsmittel extrahiert bevorzugt Lincomycin oder Celesticetin. Die zurückbleibende wässrige Lösung, die vorwiegend entweder Lincomycin D mit Spuren Lincomycin oder N-Demethylcelesticetin mit

0 0 9 8 2 0/1918

Spuren Celesticetin- enthält, wirxi zweckmäßig wiederholt . mit einem Lösungsmittel für Lincomycin D oder N-Demethylcelesticetin extrahiert, beispielsweise mit einem mit Wasser nicht mischbaren niedrigen Alkanöl wie n-Butylal·- kohol. Die Lösungsmittelextrakte können dann, weiteren Reinigungen unterworfen werden, beispielsweise einer Gegenstromverteilung, Verteilungschromatographiean Kieselsäure oder Diatomeenerde, vorzugsweise unter Verwendung .von Lösungsmitteln für Lincomycin D und N-De- ■ " methyl ^-Celesticetin der vorstehend beschriebenen Art, und unter Verwendung wässriger Gemische zu Eluierung, ferner durch Absorptionschromatographie an geeigneten Absorbentien, beispielsweise an Florisil (synthetisches SiIi-kat des im US-Patent 2 393 625 beschriebenen Typs, Hersteller Floridin Company), Tonerde oder Kohle, wobei Lincomycin D oder N-Demethylqelesticetin vorzugsweise mit Lösungsmitteln für diese beiden .Substanzen, die vorstehend beschrieben wurden, eluiert werden. ·

Fraktionierte Flussig-Flüssigextraktion erfolgt in Säulen zur Verteilungschromatogräphie oder in Gegenstrom— Verteilungsapparaten"unter Verwendung von^ Lösungsmittel— Systemen wie-z»B. n—But&lkohol und Wasser (1:1).

Die* Kristallisierung vor Lincomycin D oder N-Demethyl— celesticetin wird zweckmäßig erreicht, indem man ein vor— gereinigtes Salz dieser Verbindungen in Wasser löst:und ein niedriges Alkanon, beispielsweise Aceton zufügt* Die Umkristallisierung kann erfolgen, indem man das kristalline Salz in Wasser löst, ein mit Wasser niischbares Lösungsmittel, z*B. Aceton,; Methanol, Äthanol oder Z-Propanol zugibt und abkühlt, um die Kristallisation einzuleiten ader zu vervollständigen. Die Kristalle werden

009820/191 8 ' _baD

abfiltriert und mit wässrigen Lösungsmitteln und gegebenenfalls mit wasserfreien Lösungsmitteln gewaschen und dann im Vakuum getrocknet.

Die erfindungsgemäß erhältlichen Verbindungen können aufah aus der filtrierten GärbrUhe durch Absorption an Kationenaustauscherharzen gewonnen werden» Dabei kann man sowohl Kationenaustauscherharze vom Carbonsäure— wie auch SuIfonsäuretyp verwenden (geeignete Carbonsäureharze sind z.B. Polyacrylsäureharze, hergestellt durch Copolymerisation von Acrylsäure mit Divinylbenzol nach dem Verfahren von Kunin, Ion Exchange Resins 2. Auflage (1958), Seite 87, John Wiley and Sons, Ine; Carbonsäurekationenaustauscherharze dieser Art sind unter dem Handelsnamen Amberlite IRC-50 und Zeokarb 226 erhältlich. Geeignete Sulfonsäureharze sind z.B. kernsulfonierte Polystyrolharze, die durch Divinylbenzol vernetzt sind, und welche nach dem ,Verfahren von Kunin cit., Seite 84 hergestellt werden können. SuIfonierte Kationenaustauscherharze dieser Art sind unter den Handelsnamen Dowex 50, Amberlite IR-120, Nalcite HGR, Chempron C-20, Permutit Q und Zeokarb 225 erhältlich).

Das Antibiotikum wird aus dem Harz mit einer Säure, vorzugsweise bei einem unter dem pKa-Wert des Kationenaustauscherharzes liegenden pH-Wert eluiert. Befriedigende Ergebnisse erhält man bei einem pH-Wert von etwa 1 bis Das Elüat wird dann mit einer Base, beispielsweise Natriumhydroxyd, öder einem stark basischen Anionenaustauscherharz auf einen pH-Wert von 7,5 bis 8,5 gebracht (geeignete Anionenaustauscherharze für diesen Zweck werden durch Chlormethylierung von mit Divinylbenzol vernetztem Polystyrol erhalten. Herstellung siehe Kunin, loc. cit., Seite 84, 88 und 97 und Quaternisierung mit Trimethyl-

009 820/1918 ■ _{βΔη nDI}„

BAD ORIGINAL

18 20 -6 48

amin pder pimethyläthanplamin,, lpe, cit. Seite 97. A^iipnenaustauseherharze dieser Art sind unter den Handels— namen Qq-yfex 2_% Ppwex' ZQ,, Ämberlite IRA-^QO_? puplite A-1Q2 und Bermutit ^--1 erhält!iph.)

Pie erfindungsgemäß erhältlichen neuen Verbindungen können durph -WAederhplte. y^ergänge vpjn Rrptpnierten in den nicht-prQtGnierten Zust-and und umgekehrt weiter gereinigt werden,, insbespndere bei Btiischenschaltung anderer Reinigungspperatipnen, beispielsweise Lösungsmittele|£träfetipnisnι |iasphen_? CiiTqfnsLto.gra.fleren und fraktipnierte flttssig-; fltissig-S^traktiPnen. Auf diese Weisei können die Salze ¥pn Linppmycin Q und N-Deniethylcelesti.cetin zur Isplierung Pder. Reinigung de§ entspreehenden Antibigtifctujis dienen* Uß-n kann beispielsweise das Antibiptikum in. ^*?* unlijsliphes Salz wie das Picrat überfuhren_? das dann gereinigt und danaph durch Behandlung mit Alkali in die.freie Base zurilekverwandelt wird« Auch kann man das, Antibiptikum. in ein wasserlösliches Salz_? beispielsweise das, ΐί^άψο-, chlprid pder Sulfat überführen, die wässrige Lösjing mit verschiedenen ι mit Wasser nipbt mischbaren Losupggmititel extrahieren und danach die freie Base durch ÖehandjLung mit Alkali regenerieren.

Salze vpn Lincpmycin P₁ N-Demethylpelesticetin un4 N--)3e^ , methyldesalicetin können fUV die. gleichen biplpgigehen Zwecke wie die freien B.a^en einge^etgtt werden. Daneben können sie zur Reinigung der Antipiptica dienen.

Spezielle Salze der erfindungsgeinäß erhältlichen Verbiß* düngen kann man herstellen durch Neutralisiereri der freien Base mit der entsprephendeii Säure bis z^eipem pH-Wert unter _etwa I₁O und yprzugsweise bis pH-2-6, Qeeignete Säuren zu diesem ZwePk sind z.B, Salzsäure_r Schwefelsäure, PhPSphprsäure,, Essigsäure_f

003820/1918

Zitronensäure, Milchsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, urei GhQlsäure, Palmitinsäurei Schleimsäure,

ei Glutarsäure| glycolsäure, Phthalsäure, Weinsäure j |jauPiriSäure ι Stearinsäure, Salicinsäure, 3-Phenylsalicylsäurej 5-Phenylsalicylsäure, 3-Methylglutarsä*jre, Qrthpsulfobenzoesäurei Cyclohexansulfainsäure_? G^clopentanpropionsäurej 1^,-Cyclohexandicarbonsäure, ^-GyclphexencarbQnsäupe, Octadecenylbernsteinsäure ι QGtenylbernsteinsäure, Methansulfonsäure, Benzolfulfansäure, Heliantsäure, Reinecke's Säure, DimethyldithioearbamiRsäure, Sorbinsäure, Monpchloressigsäurei Undecylensäure, kι-Hydroxyazobenzol-ii—SuIfonsäure, QctadeGylsehKefels.äure, Piprin,säure| Benzoeeäure, Zinnsäure und dergleichen.

Q feetnn in Kliniken zur Isolierung von Klebsiella pneumonia aus Abstrichen oder Körperexudaten von Patienten ver^eniiet werden, in welchen gemischte Populationen bestimmter anderer Organismen wie Bacillussubtilis und StaphylococcHs aureus vorhanden sind. Letztere Organismen sind gegenüber Lincomycin D relativ empfindlich, während Klebsieila pneumoniae relativ resistent ist. Bei einer entsprechenden Konzentration an Lincomycin Dim Medium wächst Klebsieila pneumoniae,! während Bacillus subtilis oder Staphylococcus aureus nicht mehr wachsen. Die neuen Vepbindunfen können auch zur Inhibierung grampositiver _t Spprenausbreiter aus Agar-Platten bei der Isolierung von Schimmelpilzen, Hefen, Actinomyceten und graHi-negativen Organismen verwendet werden. Beispielsweise kann nt&n sie bei der Isolierung von Microorganismen BQdenprQben wie. auch bei der Isolierung gram-negativer ! beispielsweise von Pseudomonas, Proteus' und cpli aus Mischinfektionen in Gegenwart von oder Streptöcoccen verwenden.

Q Q 9 S 2 Q / 1 Q 1 8

BAD

N-Demethylcelesticetin und N-Demethyldesalicetin können verwendet werden zur Herstellung von ß-Hydroxyäthylcelestosaminid (ß-HTC),"in demjnan in den Beispielen und,2 des US-Patentes 3 208 996 Celesticetin und Desalicetin entsprechend ersetzt. N-Demethylcelesticetin und N-Demethyldesalicetin können ferner verwendet werden zur Herstellung antibakteriell aktiver Analoga von Celesticetin und Desalicetin, die vpn Celesticetin und Desalicetin abweichende antibakterielle Spektren aufweisen. Durch Äthylierung erhält man beispielsweise Verbindungen, die gegen gram—negative Bakterien aktiv sind. - " _

■'■■■■' m

In den folgenden Beispielen sind alle Prozentangaben auf ^ das Gewicht bezogen und alle Lösungsmittelgemische in Volumenteilen angegeben, falls nichts anderes vermerkt wird. ·

Beispiel 1

,A. Fermentation von Lincomycin D Ein .Schrägnährboden von Streptorayces lincolnensis yar. lincolnensis NRRl 2936 wurde verwendet, um eine Reihe von 500 ml Erlenmeyerkolben zu inoculieren, von denen jeder 100 ml eines sterilen Mediums mit folgenden Bestandteilen enthielt: ^

Glucosemonohydrat	Auf-	25	S
Pharmamedia *		25	S
Leitungswasser zum
füllen auf	1	Liter

♦Pharmamedia ist ein technisches Baumwollsamenmehl, Hersteller Trader's Oil Mill Company, Fort Worth, Texas. Der pH-Wert bei der Vorsterilisierung betrug 7,2. Das Wachstum erfolgte während 3 Tagen bei 28°C auf einer Gump^SchÜttelmaschine mit 2 50 ü.p. bei einem Laufweg von 6,3 cm. ■""

00,9820/1918 : bad

Ein 5 %iges Inculum der obigen Medien (5,0 ml) wurde verwendet, um 500 ml Erlenmeyer-Kolben zu inoculleren, die je 100 ml eines sterilen Fermentationsmediums folgender

it

Zusammensetzung enthielten:

Glucosemonohydrat	15 g
Stärke	40 g
Molassen	20 g
Pharmamedia	25 g
CaCO₃	8 g
Leitungswasser zum Auf
füllen auf	1 Liter.

Die Nachsterilisierung folgte bei einem pH-Wert von 6,8.

Die Fermentationskolben wurden bei 28 C auf einer Gump- ■

Schüttelmaschine mit 2 50 U.p.M. mit einem Laufweg von ,6,3 cm incubiert. Nach 24-stündiger Fermentation wurden ,pro ml des Mediums 5 mg Sulfanilamid (0,5 g pro 100 ml Medium) zugegeben. Die Aufarbeitung erfolgte nach 96-stündiger Fermentation.

B. Aufarbeitung

Die gesamten GäkrbrUhen aus einer Serie von Lincomycin D-Fermentationen wurde mit Hilfe von Diatomeenerde filtriert. Der Filterkuchen wurde mit Wasser gewaschen und die Waschlösung wurde mit dem Filtrat vereinigt. Die vereinigte klare Brühe (4 Liter), wurde auf pH-6,0 einge-r stellt und einmal mit 400 ml einer 9%igen Lösung von Natrium-Dinonylnaphthalinsulfonat und Skellysolve B (isomere Hexane) extrahiert. Die extrahierte Gärbrühe wurde dann einmal mit 400 ml Skellysolve B extrahiert. SuIfonatextrakt und Extrakt mit Skellysolve B wurden danach vereinigt und mit 200 ml Wasser gewaschen. Die wässrige Waschlösung wurde verworfen und die Sulfonat-Skellysolve B-Phase wurde mit 1 ίίι ml einer 2 5 ?Sigen Lö—

0 0 9 8 2 0/1918 ^BA0 ORIGINAL

16206-Λ6

sung von Aliquat-33u (technisches Tricaproylmethylammoniumchlorid, Hersteller General Mills, Chemical Division Kankfcakee, Illinois) in Skellysolve B und 200 ml Wasser gemischt. Das Gemisch wurde gut geschüttelt und dann ließ man es zur Bildung von 2 Phase»ruhen. Die wässrige Phase wurde aufbewahrt. Die organische Phase wurde zweimal mit je 200 ml Wasser gewaschen und die wässerigen Extrakte wurden mit dem ersten wässrigen Extrakt vereinigt; die vereinigte wässrige Lösung wurde zweimal mit je 200 ml Skellysolve B gewaschen, und dl ff , und die Skellysolve B-Lösung wurde verworfen. Die vereinigten wässrigen Lösungen gK

wurden auf pH-10 eingestellt und dreimal mit je 3 50 ml Methylenchlorid extrahiert. Der Methylenchloridextrakt wurde zur Trockne eingedampft, wobei man ein Präparat erhielt, welches gemäl3 Papierchromatographie Lincomycinverbindungen enthielt, jedoch kein Lincomycin D-. Die verbrauchte wässrige Lösung wurde dann mit n-Butanpl (4 χ je 3 50 ml) extrahiert, die Extrakte wurden vereinigt und zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde mit 95 %igem Äthanol verrieben und man erhielt 140 mg unlösliches kristallines Material, das abfiltriert wurde. Dieses Material bestand hauptsächlich aus Lincomycin D und geringen Anteilen verwandter Lincomycinverbindungen. Es

wurde umkristallisiert durch Auflösen in 4 ml Wasser und W

Zugabe von 2 5 ml Aceton;dabei wurden 50 mg eines kristallinen Präparats aus Lincomycin D mit folgender Analyse erhalten:

Berechnet für C, „Η-,,,N₀OrS^HCl.H_o0:

1/ 3d c ο 2 ' - ■

C-45,73; H=7,9O; N- 6,28; "S-T₁Le;

Cl- 7,Hr 0-25,08. ,

Gef.: C-45,62; H-7,78; N-6,23; S*7,31; _r:

Cl- 7,28; 0-25,24 (Diff.).

- 14 - 16 20 G ^ G

Beispiel 2

Im Verfahren gemäß Beispiel 1 können folgende Stoffwechselinhibitoren anstelle von Sulfanilamid verwendet werden, wobei man Lincomycin D erhält: Sulfaguanidin, Sulfathiazole Sulfadiazin, N-Sulfanilylbenzamid, SuIfachinoxolin, Sulfabrommethazin, N'-Äthylsulfanilamid, Sulfadimethoxin, Sulfamerazin, SuIfamethazin, Sulfapy-•razin, Sulfapyridin, Thiocarbohydrazid, Semicarbazide Thiosemicarbazid, Furancarbonsäurehydrazid, Isonicotinsäurehydrazid und Hydroxylamin.

Beispiel 3

N-Üemethylcelesticetin

Gibt man einen Stoffwechselinhibitor gemäk Beispiel 1 oder 2 der Fermentation nach Beispiel 3 des US-Patents 2 928 844 in der in Beispiel 1 beschriebenen iieise zu, so erhält man N-Demethylcelesticetin, das wie in Beispiel 1 beschrieben isoliert werden kann unter Bildung der kristallinen Verbindung mifr folgenden Analysenwerten:

Berechnet für C₂₃H₃^N₂O₉S: C-53,64; H-6,65; N=5,44

0=27,96; S-6,23.

Beispiel 4

N-Demethyldesalicetin.

Arbeitet man nach dem Verfahren von Beispiel 3, jedoch unter Verwendung von N-Demethylcelesticetin anstelle von Celesticetin, so erhält man N-Demethyldesalicetin.

009820/1918 SAD ORIGWL

Claims

Patentansprüche;

1. Verfahren zur Inhibierung der Bildung von N-alkyllierten PyrroÜdinen und substituierten Pyrrolidinen durch Mikroorganismen während Fermentationen, dadu-rch gekennzeichnet, daß man dem Fermentationsmediüm ein· wasserlösliches Suifonamid mit antibakteriellen Eigenschaften zugibt.

2. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das wasserlösliche Suifonamid in einer Menge von mehr als zufälligen Verunreinigungen bis zu 8 g pro Liter des wässrigen Gärmediums zugibt. *

3. Verfahren nach Patentanspruch 1 oder"2, dadurch gekennzeichnet, daß man dem Fermentationsmedium ferner Carbonylreagentien, welche Glutaminsäuredicarboxylasen inhibieren, zugibt, .

4. Verfahren nach Patentanspruch 1· bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Zugabe zu einer Lincomycin- oder Celesticetin-Fermentation erfolgt«

5· . Verfahren nach Patentanspruch 1 bis 4, dadurch ge"-kennzeichnet, darj die Zugabe zu einer Fermentation-"mit Streptomyces lincolnensis var, lincolnensis unter aeroben Bedingungen erfolgt.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man das so erhaltene Lincomycin D isoliert,

7· *^r -ehren nach Patentanspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dal; man als Inhibitor Sulfamlamid verwendet-r·

0 0 9 8 2 0/1918 BAD

8. Verfahren nach Patentanspruch 5» dadurch gekennzeichnet, daß das wässrige Nährmedium Sulfanilamid in einer Menge von mehr als zufälligen Verunreinigungen von 0,01 g pro Liter bis 8 g pro Liter des Nährmediums enthält. ■

9. Verfahren nach Patentanspruch 5» dadurch gekennzeichnet, daß die Züchtung bei einer Temperatur von etwa 1 8

erfolgt.

etwa 18 bis 37°C während einer Zeit von etwa 2 bis 1

10. Verfahren nach Patentanspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man nach 24-stündiger Fermentation und bis zum Zeitpunkt, zu welchem das Medium durch Bildung von Lincomycin aktiv ist, einen Spiegel von 5 mg Sulfanilamid pro"ml Medium aufrecht erhält.

11. Verfahren nach Patentanspruch 1 bis k_t dadurch ge- * kennzeichnet, daß man Streptomyces caelestis unter aeroben Bedingungen züchtet, bis das Medium eine wesentliche Aktivität durch N-Demethylcelesticetin zeigt.

12. Verfahren nach Patentanspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man so erhaltene N-Demethylcelesticetine isoliert. . *'

13. Verfahren nach Patentanspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß man das so erhaltene N-Demethylcelesticetin zum N-Demethyldesalicetin hydrolisiert.

Für The Upjohn Company

Rechtsanwalt

0 0 9 8 2 0/1918 BAD ORlGJNAi