DE1598739A1 - Mittel zur Bestimmung der Cholinesteraseaktivitaet im Serum - Google Patents

Mittel zur Bestimmung der Cholinesteraseaktivitaet im Serum

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Description

B. Merck 1 π QQT OQ
Aktiengesellschaft I 030/öS 2. juli 1969
Darmstadt
Mittel zur Bestimmung der Cholinesteraseaktivität
im Serum
Die Bestimmung der Aktivität der Serumcholinesterase ist für die frühzeitige Erkennung gewisser Erkrankungen außerordentlich wichtig. So kann z.B. aus einer verminderten Cholinesteraseaktivität auf degenerative Lebererkrankungen oder auf Vergiftungen mit organischen Phosphorsäureestern geschlossen und der Grad der Vergiftung festgestellt werden. Ferner kann auf diesem Weg die Wirksamkeit von Anticholinesterasen^. die bei verschiedenen Erkrankungen verabreicht werden, bestimmt werden. Außerdem ist es u.a. sehr wichtig, vor der Anwendung von Muskelrelaxantien bei Operationen die Höhe des Cholinesterase-Spiegels im Serum des Patienten zu bestimmen.
Aus der Literatur sind schon verschiedene Verfahren zur Bestimmung der Serumcholinesteraseaktivität bekannt. So ist z.B. vorgeschlagen worden, eine zu prüfende Serumprobe mit einer geringen Menge Substrat (Acetylcholin) in Gegenwart eines Farbindikators in lösung oder auf einem Papierstreifen zu vereinigen und den Farbumschlag, der durch die aus dem Substrat freigesetzte Essigsäure verursacht wird, nach einer gewissen Zeit zu schätzen oder colorimetrisch zu messen. Die bisher bekannten Prüfmittel und Prüfverfahren weisen jedoch erhebliche Mängel auf. Die Prüfung nach diesen Verfahren ist langwierig, da der apparative Aufwand groß und insbesondere die Inkubationszeit lang ist. Ferner liefern die bisher bekannten Papierstreifen-Verfahren größtenteils ungenaue Ergebnisse, die nur grobe Angaben über den Oholinesterasegehalt zulassen.
■Es wurde nun gefunden, daß die genannten Schwierigkeiten nicht auftreten, wenn für die Bestimmung der Serumcholinesteraseaktivität ein Träger verwendet wird, der mit Phenolrot, Naphtholphthalein
BAD ORIGINAL Neue Unterlagen (Art 711 Abe. 2 Nr. I Satz 3 do· Xndtrungag··. * 4.9.
009882/0421
und Substrat belegt ist.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist demnach ein Mittel zur Bestimmung der Cholinesteraseaktivität im Serum, das aus einem eaugfähigen Träger besteht, der Substrat und als Indikator Phenol-,rot und Naphtholphthalein enthält.
Mit dem Mittel nach der Erfindung kann der Cholinesterasegehalt auf einfache Weise ohne großen Aufwand an Hilfsmitteln bestimmt werden. Besonders vorteilhaft ist, daß bei der Anwendung des neuen Mittels nur kurze Inkubationszeiten erforderlich sind. So ist es möglich, unter Verwendung des mit Phenolrot, mit Naphtholphthalein und Substrat belegten Trägers nach der Erfindung den Cholinester-' asegehalt z.B. schon nach 6 bis 8 Minuten halbquantitativ anzugeben. Die Inkubationszeiten liegen damit merklich niedriger als bei Vsrwendung von bekannten Mitteln bei vergleichbarem apparativem / fwand. Gegenüber einigen bisher verwendeten Mitteln zur Bestiir jig der Cholinesteraseaktivität zeichnet sich der neue Träger nach der Erfindung dadurch aus, daß nicht mehrmals in gewissen lidtabständen, sondern nur einmal nach einer kurzen Zeit der Farbton des Indikators abgelesen werden muß. Das Mittel nach der vorliegenden Erfindung liefert somit im Vergleich zu den bekannten Mitteln eine beachtliche Arbeitsersparnis bei der Bestimmung der Cholinesteraseaktivität im Serum, die sich insbesondere bei Durchführung von Simultanbestimmungen auswirkt.
Als Träger für das Mittel nach der Erfindung dient jedes saugfähige geeignete organische oder anorganische Material, vorzugsweise geschichtete Träger aus Cellulose, z.B. Filterpapier, ferner Träger aus Glasfasern, Kieselgel oder auch Stäbchen aus geeignetem Material wie z.B. Aluminiumoxyd.
Der Indikator und das als Substrat verwendete Acetylcholin werden in geeigneter Form, vorteilhaft in Form einer lösung auf den Träger aufgebracht, wobei man das verwendete Lösungsmittel anschließend verdunsten läßt. Geeignete Lösungsmittel sowohl für
8*£> OFUGiNAL 009882/0421
das Substrat als auch für den Indikator sind gegebenenfalls mit Wasser vermischte organische Lösungsmittel wie Alkohol, insbesondere niedere Alkohole, z.B. Methanol, Äthanol, Isopropanolj ferner auch Ketone und Äther <vie Aceton, Dioxan, Tetrahydrofuran. Das Substrat kann in Form einer lösung des freien Acetylcholins auf den Träger aufgebracht werden. Jedoch hat es sich als besonders zweckmäßig herausgestellt» den Träger mit der Lösung eines Salzes des Acetylcholins, vorzugsweise mit der Lösung eines Hydrohalogenids, insbesondere des Hydrochloride oder auch mit der Lösung des Hydrobromids oder Sulfats oder eines Gemisches der Salze zu tränken.
Als Indikator wird nach der Erfindung eine Mischung von Phenolrot mit Naphtholphthalein verwendet. Die angewandte Indikatormischung ist besonders günstig» da sie auch im schwach alkalischen Bereich besonders deutliche Parbänderungenbei geringfügigem Wechsel des pH ergibt und so auch für die Messung des Oholinesterasegehalts von älteren Seren sehr gut geeignet ist. Die Indikatorlösung soll einen pH-Y/ert von etwa 5 bis etwa 8,5i vorzugsweise pH 6, aufweisen· Gegebenenfalls muß die Lösung des Indikators und Substrats vor dem Aufbringen auf den Träger auf den gewünschten pH eingestellt werden. Dies kann bei Verwendung sauer reagierender Salze des Acetylcholins durch Zusatz der entsprechenden Menge einer alkalischen. Substanz, vorzugsweise eines alkalischen Hydroxyds wie eines Alkalimetallhydroxyds, insbesondere Hatriumhydroxyd oder Kaliumhydroxyd oder auch einer anderen alkalisch reagierenden Verbindung, z.B. eines alkalisch wirkenden Salzes wie eines Alkalicarbonate oder -bicarbonate, z.B. Natriumcarbonat, Natriumbicarbonat, Kaliumcarbonat oder Kaliumbicarbonat·, erreicht v/erden. Verwendet man das basisch, reagierende freie Acetylcholin, so kann der gewünschte pH durch Zusatz sauer reagierender Substanzen, z.B. einer Säure wie Salzsäure eingestellt werden. Die zur Einstellung des pH erforderliche alkalisch bzw. sauer wirkende Substanz wird zweckmäßig in Form ihrer verdünnten, beispielsweise wäßrigen oder alkoholischen Lösung zugesetzt,
Es hat sich als vorteilhaft herausgestellt, Indikator, Substrat und die gegebenenfalls erforderliche alkalische bzw. saure Substanz in Form einer gemeinsamen Lösung auf den Träger aufzubringen.
009882/0421 "^ obiq,nal
Günstig ist es beispielsweise, die Bestandteile in einer alkoholischen Lösung, in der-etwa 5 - 30 $, insbesondere etwa 15 c/° Acetylcholin und/oder Acetylcholinsalze und etwa 0,05 - 0,2 ^, insbesondere etwa 0,1 5^ Indikatorfarbstoff enthalten ist, zu verwenden. Der Träger kann auch mit Substrat und Indikator bzw. deren Lösungen nacheinander belegt werden. Die Reihenfolge, in der die Bestandteile einem gemeinsamen Lösungsmittel zugesetzt bzw. die Reihenfolge, in der sie auf den Träger aufgebracht werden, ist beliebig. Das auf diese Weise imprägnierte Trägermaterial, das z.B. in Form von Streifen, Platten oder in Gestalt anderer Formkörper vorliegen kann, wird nach Verdunsten des Lösungsmittels zweckmäßigerweise auf ein passendes Format gebracht. Z.B. wird ein auf die beschriebene Weise imprägniertes Filterpapier in Quadrate oder Rechtecke bzw. Streifen geschnitten. Bei Aufbewahrung des imprägnierten Trägers soll nach Möglichkeit die Einwirkung von Licht und Luft ausgeschlossen werden, um eine Veränderung des Farbtons zu vermeiden.
Die Anwendung des neuen Mittels ist außerordentlich einfach. Der imprägnierte Träger, z.B. das Testpapier, iwrd mit einer definierten Menge des zu prüfenden Serums, z.B. 0,05 ml/cm Testpapier, bei Temperaturen zwischen 15 und 25°C, vorzugsweise bei 20 0, zusammengebracht. Nach einer festgesetzten Zeit (zwischen etwa und 10 Minuten, vorzugsweise nach 6-8 Minuten) wird der durch die freigesetzte Essigsäure verursachte Farbton des Trägers mit den Farben einer unter gleichen Bedingungen geeichten Farbskala verglichen. Auf diese Weise kann direkt die Konzentration an Cholinesterase abgelesen werden. In Sonderfällen kann es zweckmäßig sein, eine etwas höhere Inkubationszeit, z.B. 15 Minuten, zu wählen«
In den folgenden Tabellen sind die Färb- und pH-Werte mit den zugehörigen Cholinesterase-Konzentrationen bei Prüfung von 0,04 ml
'2
Serum pro cm Träger nach 5 bzw. 10 Minuten Inkubationszeit bei einer Temperatur zwischen 15 und 250C eingetragen.
BAD
009882/04 2 1
farbe des Trägers pH-Wert Cholinesterasegehalt des Serums diagnostische Beurteilung
^IE/ml sehr stark erniedrigt
dunkelviolett 8,0 0 sehr stark erniedrigt
Zwischenwert 1 7,8 0,6 stark erniedrigt
Zwischenwert 2 7,6 1,3 erniedrigt
ziegelrot 7,4 2,0 normal
Zwischenwert 7,2 2,8 normal
rotorange 7,0 3,6 erhöht
Zwischenwert 6,8 4,4 fetark erhöht
gelborange 6,6 5,2' sehr stark erhöht
Zwischenwert 6,4 6,0 sehr stark erhöht
dunkelgelb 6,2 6,8
Eichtabelle 1: Cholinesterasegehalt und Farbe des mit Phenolrot/
üaphtholphthalein und Acetylcholin belegten Trägers
ρ bei Prüfung von 0,04 ml Serum pro cm Träger bei
15 - 250C und einer Inkubationszeit von 5 Minuten.
BAD ORIGINAL
009882/0421
• dunkelviolett - 6 pH-Wdrt - 1598739 . diagnostische Beurteilung
Farbe des Trägers Zwischenwert 1 Cholinesterasegehalt des Serums sehr stark erniedrigt
Zwischenwert 2 8,0 IE/ml sehr stark erniedrigt
ziegelrot 7,8 0 sehr stark erniedrigt
Zwischenwert 7,6 0,6 stark erniedrigt
. * ·
rotorange		 7,4 1,0 stark erniedrigt
[I Zwischenwert
II gelborange		 7,2 1,4 erniedrigt
Zwischenwert 7,0 1,8 normal
dunkelgelb 6,8 2,2 normal
Zwischenwert . 6,6 2,6 normal
zitronengelb 6,4 3,0 erhöht
6,2 3,5 erhöht
6,0 4,0 stark erhöht
5,8 4,5
5,0
Eichtabelle 2; Cholinesterasegehalt und Farbe des mit Phenolrot/
Naphtholphthaiein und Acetylcholin belegten Trägers
ρ bei Prüfung von 0,04 ml Serum pro cm Träger bei
15 - 250C und einer Inkubationszeit von 10 Minuten·
. Besonders vorteilhaft ist die Durchführung mehrerer Bestimmungen nebeneinander mit dem Mittel der Erfindung. Solche Simultanbestimmungen können beispielsweise auf einer Palette aus geeignetem Material wie Metall, Porzellan, Glas oder einem Kunststoff durchgeführt werden, wobei nach Auftragen der Serumproben und der imprägnierten Träger in die Vertiefungen der Palette zweckmäßigerweise eine durchsichtige, z.B. aus Glas oder Plexiglas bestehende Deckplatte eingesetzt wird. Das Papier kann auch auf einen Objekt-
BAD
.. 00^8 82/0421
träger gelegt, mit Serum angefeuchtet und mit einem zweiten Objektträger bedeckt werden. Nach kurzer Zeit, z.B. 6 bis 8 Minuten, kann dann d' r Cholinesterasegehalt für die ganze Versuchsserie durch Vergleich der erreichten Farbtönungen mit den Farben der Eichtabelle abgelesen werden.
Beispiel 1
62 mg Phenolrot, 62 mg Naphtholphthalein und 19 g Acetylcholinhydrochlorid werden in 100 ml einer Mischung aus Aceton und Wasser (Verhältnis der Lösungsmittelkomponenten 10 : 6) gelöst. Durch Zugabe einer Kaliumhydroxydlösung wird ein pH von 6,0 eingestellt. Mit der so erhaltenen Indikatorlösung werden Glasfaserpapier, Filtrierpapier bzw. Filterpappe durch kurzes Eintauchen imprägniert,
Beispiel 2
70 mg Phenolrot, 70 mg Naphtholphthalein und 15 g Aoetylcholinhydrochlorid werden in 100 ml Methanol gelöst. Anschließend wird die Lösung mit n/10 Kalilauge auf einen pH von 6,0 eingestellt M^t der so zubereiteten Indikatorlösung werden saugfähige Träger analog Beispiel 3 imprägniert.
Beispiel 3
150 mg Phenolrot, 150 mg Haphtholphthalein uni. 25 g Acetylcholinhydrochlorid werden in 100 ml 70 $igem Äthanol gelöst. Anschließend wird die Lösung durch Zusatz von Natronlauge auf einen pH von 7»ö eingestellt. Mit der so zubereiteten Indikatorlösung werden eaugfähige Träger wie in Beispiel 3 angegeben imprägniert.
BAD ORIGINAL 009882/0421
Beispiel 4
100 mg Plienolrot, 100 mg Naphtholphthalein und 15 g Acetylcholinhydrochlorid werden in 100 ml Methanol gelöst und anschließend durch Zusatz von Natronlauge auf pH 6,0 eingestellt. Mit der erhaltenen Lösung werden Filtrierpapierbogen getränkt. Nach dem Eintrocknen der Lösung wird das Filtrierpapier in Form von Streifen auf eine Kunststoffolie aufgebracht und mit einer zweiten Folie versiegelt. Hierauf wird der Bogen mit dem eingesiegelten, imprägnierten Filtrierpapier senkrecht zu dem aufgebrachten Papierstreifen in üblicher Weise in Streifen geschnitten.
In einer Variation des vorsteiend beschriebenen Herstellungsverfahrens wird der Filtrierpapierbogen zuerst auf die Kunststoffolie aufgebracht und erst danach mit der Lösung getränkt.
Die erhaltenen Teststreifen aus Kunststoffolie mit aufgebrachtem Indikatorpapier werden dann, für die Cholinesterasebestimmurig eingesetzt.
009882/04

Claims (1)

  1. Patentanspruch.
    1· Mittel zur Bestimmung der Cholinesteraseaktivität im Serum, bestehend aus einem Farbindikator und Substrat enthaltenden saugfähigen Träger, dadurch gekennzeichnet, daß als Indikator Phenolrot zusammen mit Naphtholphthalein, verwendet wird.
    BAD OR*GlNAt 0Q9882/0A21
DE1598739A 1965-01-26 1965-01-26 Mittel zur Bestimmung der Chohnesteraseaktivitat im Serum Expired DE1598739C3 (de)

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