DE1492097A1 - Verfahren zur fermentativen Herstellung von Tetracyclin - Google Patents
Verfahren zur fermentativen Herstellung von TetracyclinInfo
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Description
Verfahren zur fermentativen Herstellung
von Tetraoyolin
Die vorliegende Erfindung betrifft die fermentative Herstellung von Tetraoyolin unter Verwendung einer neuen Art Streptomyces,
für welche die Benennung Streptomyces subterraneus vorgeschlagen wird*
Es ist bekannt und wurde in wissenschaftlichen Publikationen schon sehr oft veröffentlicht, dass die Art Streptomyces aureofaciens
und ihre Mutanten sowie auoh andere Mikroorganismen vom gleichen Typ neben Tetracyclin in bestimmtem Verhältnis halogeniertes
Tetraoyolin, welches meistens mehr als 10 % der Gesamt·
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menge vom Antibioticum beträgt, erz« ι rs« ο, wenn Halov^r- -or* iüi
Ferraentationsnährboden vorhanden a Ind.
Es ist auch eine ganze Rölhe von Ve .'Cnhren bekannt, nach v/eichen
einige Mutanten von Streptomyces aureofaciena unter genau bestimmten
spezifischen Bedingungen der- Fermentation Tetracyclin erzeugen. Beispiele sind die Beeinflussung der metabolIschen Aktivität, in
Anwesenheit von bestimmten Rohstoffen Im Fermentationsnährboden, z. B. Sojamehl (Brit. Pat. 787 895) oder Ledoganrnlt-Extrakb
(Brit. Pat. 799 051 )i oder die Zugabe von spozlfi.TJhen Inhibitoren
der Chlorierung, wie z. B. von heterocyclischen Diazolen, Dithlooarbamaten,
Thiuramdisulfiden und substituierten Derivaten von
3,6-Pyri:la2ln [Goodman et al,, DAS 1 016 409 (1957), »AS
1 045 047 (1958), DAS 1 048 388 (1958)].
Der neue Streptomyces-Stamm, genannt Streptomyces subterranous,
wurde aus einer bei Rovinj entnommenen Erdprobe isoliert. Aus dem Boden, welcher direkt am Meer liegt« wurde die Probe ungefähr
20 cm unterhalb der Erdoberfläche auf sterile Weise entnommen. Die Probe war beinahe vollkommen sandig und kaum ein
wenig mit Erde vermischt. Durch Untersuchung im Laboratorium * wurde festgestellt, dass die Konzentration von Natriumchlorid
in dieser Probe sehr hoch war. Nach der Isolierung des Mikro-' Organismus konnte auch im Laboratorium bewiesen werden» dass die
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Sporen von diesen Mikroorganismus gegenüber hohen Konzentrationen
von Natriumchlorid» welche auf andere Mikroorganismen inhibierend wirken» resistant sind.
Schon durch diese Charakteristik unterscheidet sich dieser Mikroorganismus und das Verfahren zur Herstellung von Tetracyclin
nit diesen beträchtlich von den anderen Staunen» die
Tetracyclin erzeugen» besonders aber auch von den oben beschriebenen Stämmen und Verfahren zur Herstellung von diesen
Antibioticum (U.S. Pat. 2 712 517» Brit. Pat. 787 895» Brit.
Pat. 799 051 u.s.w. )·
Eine weitere» ausserst bedeutsame Charakteristik dieses Stammes
ist die Erscheinung» dass der Mikroorganismus und alle seine natürlichen oder induzierten Mutanten das Antibioticum Tetracyclin
erzeugen» ohne dabei das Halogen aus den Chlorid zu binden und halogenlerte Tetracycline zu erzeugen.
Durch Zugabe von Chlorid in die Fenaentationsnlthrlusung wurden
in keinen Fäll Spuren von Chlortetracyolin" erhalten. Ss wurde
auf solche Weise gearbeitet» dass z. B. In die Produktions-FermentationanMhrlÖsung
Chloride in überschuss zugefügt wurden. '
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Aa Bnde der Fomentation nach ungefähr 14O Stunden betrug die
Konsentration von Tetracyclin zwischen 9200 - 10200 I je Bl
FeraentatlonabrOhe, in welcher die Anwesenheit von Chlor«
tetracyclin nicht nachgewiesen werden konnte. Die Chloride wurden in die Fensentationsbrdhe in Fora von anorganischen
Salzen, organischen Salzen oder chlorierten organischen MolekOlen
eingebracht.
Der Nikroorganisaus, der isoliert wurde und in den Tabellen
beschrieben wird, ist volllconmen neu, und seine charakteristischen
Morphologischen Eigenschaften, seine Fähigkeit zur Bildung hoher Xonsentrationen des Antibioticum«, sowie auch die Beobachtung,
dass er durch seine aetabolisohe Kapazität die Halogenide in den Tetraoyelin-Typ des Moleküls nicht bindet, wie es in allen
bisher beschriebenen Verfahren der Fall war, wurden bis Jetzt nicht beschrieben. All dies , zusaaaen alt dem spezifischen
Metabolisaue dieser Art ergibt eine genügend klare Uheterscheidung
zwischen diesen Mikroorganisaus und den bisher bekannten und beschriebenen
Mikroorganismen, die Antiblotioa der Tetracyclin-Reihe erzeugen·
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TABBUE I
co ο to co ω
to
NXhrboden
Agar Nithrboden
Fora dor Kolonien
gewölbt. Oberfläche genarbt* Rand unregelntäesig
Wachstume-Inteneität
üppig
Vegetat. Mycel
gelblich
Luft-Myoel
LöslIcheB
Pigment
Pigment
hellgelblich
Bemerkung
Capeks — Agar
Synthetischer Agar
Olueoee- seiohfc, Ober-Aeparaginfläche
glatt. Agar Rend gezähnt
Kartoffel- aeioht» Ober-Agar flache glatt.
Rand innerhalb des Agar·
in Spuren
in Spuren
schwach
beige
grau
4> CO
ro ο
CD
mHasig
hellbraun
grau« weias
hellbraun
[beige]
[beige]
Sporophoren flach oder gewellt mit offener.
Ausläufern
NMhrbod«n
Form der
Kolonien
Kolonien
Wachstums-Intensität
Vegetat
Myoel
Myoel
Luft-Hycel
LBsliohes Pigment
Bemerkung
Kartoffel-Sahnitten
Blut-Agar
CD
Ca)
IO
Ca)
IO
Smersons
Agar
Agar
Linden—
bein»
Agar
Sabeurauds
Agar
Agar
gewölbt.
Oberfläche genarbt, Rand unrege lnässig
Oberfläche genarbt, Rand unrege lnässig
gewölbt.
Oberfläche genarbt, Rand gesahnt
Oberfläche genarbt, Rand gesahnt
sehr gewölbt. Oberfläche genarbt, Rand
unregelmässig
mittelnässig gewölbt, Oberfläche schwach
genarbt, Rand ungerade
üppig
mäseig
nässig
schwach
massig
schwarzbraun
farblos
hellbraun
hellbraun
hellbraun
grauweiss
gräulich bis hellbraun
gelblich bis hellbraun
grau
ΟΛ I
Conidien zylindrisch von 0,8 - 0,9 x 1#2 - 1,4 μ
hellbraun
CD
CD
Nährboden
Form der Kolonien
Waohsturns-Intensität
Vegetat. Wyoel
Luft-Myoel
Lösliches
Pigment
Pigment
Benerkung
Könne
Agar
Agar
CO
O
«D
OO
U>
IO
O
«D
OO
U>
IO
Synthet.
Agar nit
Pepton
Agar nit
Pepton
Glycerin-Asparaglx
Agar
Agar
Glucose·
Hefe-Agar
Hefe-Agar
schwach gewölbt, Oberfläche schwach glatt« Hand
unterhalb Oberfläche
mittelmäeeig gewölbt» Oberfläche
gefurcht. Rand unregelmässlg
sohwaoh gewölbt» Oberfläche glatt. Rand regelmässlg
sehr gewölbt, Oberflach« gefurcht« Rand
unregelmässlg
sohwaoh
farblos
massig
hellbraun
hellbraun
[beige]
[beige]
schwach
hellbraun [beige]
massig
braun
hellbraun
Form der Kolonien
Waohstuns-
Vegetat.
Myoel
Myoel
Luft-Myoel
Löeliohee
Pigeent
Pigeent
Stttrke-A gar
seicht, Oberfläche glatt» Rand unregeln&ssig
massig
farblos
grau
starke Hydroljee
CD O CO OO
Nitrat-Reduktion
Koagulation von Milch
Lusen der Gelatine
Produktion von reduziert ' niofat oo
koaguliert,
peptonisiert
peptonisiert
lust nicht
produziert
kein O
kein O
CD ISJ O CD
-•J
aureofaoiene ATCC 10 762
| Mähr- | |
| agar | |
| CD | |
| O | |
| CO on |
Capeke |
| Agar | |
| ro | |
| Kar | |
| toffel | |
| ro mm*. |
Agar |
eons
Agar
Agar
gewölbte Kolonien« Oberfläche genarbt» unregelnXaeig grob· Wachet um tippig. Mit
gelblichen vegetativen Mycel. Kein Luftmyeel,
lösliches Pigment hellgelb
Wachstum massig. Kolonien seicht mit glatter Oberfläche. Vegetatives Mycel
braun« Luftanroel Bauweise. Ea bildet
sich braue{beige]~farbenee lösliches
Pigment
Wachstum massig. Kolonien gewölbt mit faltiger Oberfläche, unregelmäeaig
grob. Bildet kein Luftnyoel, vegetatives
Myoel hellbraun. Lösliches Pigment hellbraun
Wachstum gut. Bildung von Luftaqreel suwellen
beschränkt· Weissgrau. Ohne lösliches Pigment.
Wachstum gallertartig· Knappes Luftmycel.
Pigment weiss bis sohwaohgelb
Pigment weiss bis sohwaohgelb
Wachstum gewölbt, Oberfläche genarbt· lösliches Pigement hellbraun
Wachstum gut. Bildet kein Luftmycel>
von
unten Kolonien farblos, van der rechten Seite farblos, in der Mitte Jedoch gelblich braun. Bildet kein lösliches Pigment
unten Kolonien farblos, van der rechten Seite farblos, in der Mitte Jedoch gelblich braun. Bildet kein lösliches Pigment
CD O CO OO
Qluoose-Asparagin· Agar
Olyoerin-Asparagin-A gar
Milch-Koa gulation
Wachstum schwach auf seichten Kolonien mit glatter Oberfläche, Rand
gezahnt. Vegetativ. Mcyel beige» Luftinyoel grau, bildet kein lösliches
Figaent
Waohstum schwach, Kolonien mit glatter Oberfläche, schwach gewölbt, vegetativ.
Myoel hellbrauner Farbe. Bildet werder Luftinyoel noch lösliches Pigment
koaguliert, peptonisiert Dünnes Luftmycel weisser Farbe, von unterer
Seite der Kolonie farblos, bildet kein lösliches Pigment
Waohetum gut, Kolonien gut sporuliert, Luft· hyphen grau, rosa, Kolonien von unterer
Seite grünlich braun. Bildet kein lösliches Pigment
koaguliert nioht, peptonisiert nicht
CO ΓΟ O
Unterschiede In charakteristlachen Eigenschaften der Statue
Streptomyces subterraneus und Streptonyoea aureofaciens ATCC
10
Streptomyoes
subterransus
subterransus
StreptoniyceB aureofaolens
ATCC 10 762
Luftmycel auf den Kartoffel-Sohitten
grKuIloh bis hellbraun
Vegetativ. My eel auf den Kartoffel-Schnitten
rotbraun
Sporophoren flach alt offenen Ausläufern
Conldien zylindrisoh von
0,8 - 0,9 x 1,2 - 1.4 μ
Wachstum von Prieäreyeel
serstreut
verbraucht weder lactose noch Maltose
Milch wird koaguliert und peptonislert
Luftmyoel auf den Kartoffel-Schnitten
weise
Vegetativ. Nyoel gallertartig,
nach 2-3 Tagen gelb
Sporophoren spiralig mit geschlossenen und halboffenen Ausläufern
Conldien sphärisch bis ellipsoid, der längste Durchmesser
1,5 H
VaohstuB von Prieäreycel
dick
verbraucht Lactose und Maltose
Gelbliches lösliches Pigaent, oft nicht feststellbar
Milch wird weder koaguliert noch peptonisiert
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Antagonistische Eigenschaften dee St Streptonyoes subterraneua
Saleooella eohottmUllerl +
Aspergillue nlger
Aspergillue fumigatus
Aspergillue fumigatus
2o*C für Fungi
9 0 9 8 3 2 / 1 2 6 7 BAD
Das erfindungageniäs3e Vor fahren zur Herstellung von Tetracyclin
besteht darin, dass der Mikroorganismus Stroptomycas sub·»
terraneus unter den Bedingungen der Submersfermentaclon bei
diner Temperatur von 28 - 320C unter Mischen und Durchleiten
von Luft Xn dem Permentationsnöhrmedium, das als Kohlenstoff-Quelle
Stärke» Maismehl, Glucose und dgl., weiterhin als Stickstoff
-Quelle Malsquellwasser (Corn-steep), Sojamehl, Erdnussmehl, sowie
auch Ammoniums »Uze, wie z. B. Ammonlurasulfat und Ammoniumchlorld,
Wachsturns-Faktoren, Mineralsalze, Spurenelemente und
Calciumoarbonat als Puffer enthalten kann, gezüohtet wird. Hierbei
erzeugt der Mikroorganismus Streptomyces sub'cerraneus Tetracyclin
in hohen Konzentrationen ohne Spuren der halogenieren
Tetracycline, auoh dann, wenn die Halogenide in der FermentationaflUssigkelt
anwesend sind. Mit Hilfe von bekannten analytischen Methoden zur Bestimmung von Tetracyclin durch Papierchromatographie,
DünnschichtChromatographie und spektrophotonetrisohe
Analyse konnten diese Antibiotioa nicht einmal in Spuren nachgewiesen
werden·
Die Fermentation dauert 120 - 14O Stunden· Nach beendeter Fermentation
wird die FeraeiitatiotisbrUhe filtriert und die Isolierung
des Antiblotiouaa vorgenommen, vorzugsweise Indem dieses mit Hilfe
von Methylieobutylketoxin auegefällt» die ao erhaltene schwer
909832/1267 BAD OfiiG'NAL
lösliohe Verbindung abgeschieden und das Antibioticum aus dieser
Verbindung in Form von Hydrat bzw. Hydrochlorid regeneriert wird. Die Ausbeute von Tetraoyolin beträgt 64 bis 68 %,
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken.
Die Beimpfung erfolgt mit einer Sporen-Suspension von
MaIz-Schrägagar in Kolben, die 100 ml Nährboden folgender
Zusammensetzung enthalten:
(Corn-steep) 50 Jß-ig 20 g/l
Sojaöl 3 g/l
Nach 16- bis i8»stUndiger Inkubation bei 28*C auf einem Schottel«
apparat erhält man ein dichtes Kulturenwachstum.
Mit 100 «1 bo vorbereiteten Inoculum impft man den Vorferaentor
alt der Nährlösung der oben angefahrten Zusammensetzung.
909832/1287 ollJAI
ftbrtt
5 - 10 Ji VarfernentatlonanHhrlBeung in dae Fermentatione-
gßtMma Übertragen, daa eine NKhrieaung folgender Zusaaaenaetsung
•nthältt
(Com-ateep) 50 Jt-Ig 25 g/1
Stärke 45 βΑ
Manganeulfat 0,14 g/l
Kobaltohlorid 5 mg/1
Der anfängliche pH-Wert beträgt 6,4 - 6,6. Bedingungen der
Fermentation! Belüftung! 0,5 1 Luft/1 Hährlöeung/fcin., Temperatur!
28*C. Mach 96 bis 120-atttndiger ZUohtung enthält die
Fermentationeflttsalgkalt 9 410 K/il an Tetracyclin.
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Kolben, beimpft mit Sporensuspensionen von Malz-SohrSgagar,
werden auf einen SohUttelapparat bei einer Temperatur von 28 eC
lnkublert. Kaoh 16 bis 18 Stunden wird in den Vorfermentor über·
tragen, der eine HBhrlösung folgender Zusammensetzung enthaltι
Maisquellwasser (Corn-Bteep) 50
Jüanoniumaulfat
Saccharose Calolumearbonat KB2PO4
Sojaöl
Sojaöl
Der anfängliche pH-Wert betragt 6,4 - 6,6. Belüftung: 0,8
Luft/1 NHhrlöatmg/ftin. Temperatur t 28*C. Nach 16- bis 18-stUndiger
Feraentatlon werden 10 % des so bereiteten Inoouluos
In den Permeator übertragen, der eine Nährlösung folgender Zueammensetsung
enthältt
(Corn-steep) 50 Jt-Ig 25 gA
| 20 | g/l |
| 4 | 8/1 |
| 30 | g/l |
| 7 | gA |
| 0,6 | g/l |
| 5 | 8/1 |
StBrke 55
ftmmoniumsulfat 8,5 g/l
atchlorld 5 «g/l
BAD 909832/1267
Maismehl 15 β/1 Soimalzöl 20 g/1
Der anflngllohe pH-Wert betrügt 6,4 - 6,6. Belüftung 0,5 1
Luft/1 Nährlösung/min. Temperatur 28 *C. Naoh 120-stündiger
Kultivierung enthalt die FermentatlonsflUselgkeit 9430 B/al
an Tetracyclin·
Kolben, beimpft mit einer Sporensuepenslon von Nals-Sohrlgagar,
werden auf elnea Sohttttelapparat bei einer Temperatur von 280C Inkubiert, laoh 16 bis 18 Stunden wird in den Vorfermentor
übertragen, der eine Nährlösung folgender Zusammensetzung
enthält)
(Corn-eteep) 50 *-lg 20 g/l
Sojaöl . 3
Naoh 16- bis 18-etOndiger Inkubation bei 28*C bei einem anflngliohen
pH-Wert von 6,2 bis 6,4 und einer Belüftung von
0,8 1 Luft/1 HährlBeung/Kin. werden 10 % des so bereiteten
Inoouluma in den Feraentor übertragen, der eine Mährlöeung
folgender Zusammensetzung enthälts
909832/1267 BAD
| ?5 | g/l |
| 65 | g/l |
| 8 | g/l |
| 2 | g/l |
| 9 | g/l |
| O, | 14 g/3. |
| 5 | mg/1 |
| 15 | g/l |
| 5 | g/l |
| 5 | g/l |
| 10 | g/l |
- 18 -
Malsquellwasser
(Cc-a-ßfceep) 50
Stärke
Aiiimoniumsulfat
Ammoni urachl or id Calciumoarbonat
Mangansulfat Kobaltchlorid Maismehl
Sojamehl
Glucose
Schmalzöl
Der anfängliche pH-Wert beträgt 6,4 bis 6,6. Belüftung: 0,5 1
Luft/1 Nährlösung/Min. Temperatur: 289C. Nach 120-stündiger *
Züchtung enthält die PermentationsflUselgkeit 10 300 B/ml an
Tetracyclin.
In allen angeführten Beispielen wurde nach der Filtration der PermentationaflUasigkeit die Isolierung des Antibiotiouras Tetra·
oyclin durch Fällung mit Methyllsobutylinitoxia, Abscheidung
der so erhaltenen sohner löeliohen Verbindung und Regenerierung des Antibioticunae in Form von Hydrat bzw. Hydrochlorid durchgeführt. Die Ausbeuten von Tetracyclin betrugen 64 bis 68 £.
der so erhaltenen sohner löeliohen Verbindung und Regenerierung des Antibioticunae in Form von Hydrat bzw. Hydrochlorid durchgeführt. Die Ausbeuten von Tetracyclin betrugen 64 bis 68 £.
909832/1267 BAD o*!G!NAL
Claims (1)
- Patentanspruch·1 · Verfahren sur fernentatlven Herstellung von Tetracyclin« dadurch gekennzeichnet, dass die neue Art von Mlkroorganissjus* Streptomyoes subterraneus sp. nov. genannt· oder eine ihrer natürlichen oder induzierten Mutanten aubners und aerob in einen flüssigen Nähneedium, welches Kohlenstoff- und StiokstoffQuellen» Mineralsalze und WaohatUMsfaktoren enthält« ohne Zugabe von Inhibitoren der Halogenierung kultiviert wird·2, Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Fementationsnährlösung 3?&rke, Olucose, Maismehl als Kohlenstoffquelle« Naisquellwasser« Sojanehl« Erdnuesnehl und AssaoniuBsulfat sowie AnaoniuBohlorid als Stickstoff-Quelle und Mineralaalse, wie Mangansulf et, Zinksulfat« Kaliusphosphat« enthllt«3· Verfahren nach Anspruch 1« dadurch gekennzeichnet, dass die Fermentation bei Teaperautur von 28 - 32#C und bei eines pH-Wert von 6,4 - 6.6 wihrend 120 bis 1*0 Stunden durchgeführtBAD ORIGINAL909832/1267
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| YU104764 | 1964-07-27 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE1492097A1 true DE1492097A1 (de) | 1969-08-07 |
Family
ID=25552552
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE19651492097 Pending DE1492097A1 (de) | 1964-07-27 | 1965-05-27 | Verfahren zur fermentativen Herstellung von Tetracyclin |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| AT (1) | AT261809B (de) |
| DE (1) | DE1492097A1 (de) |
| GB (1) | GB1075023A (de) |
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-
1965
- 1965-05-27 DE DE19651492097 patent/DE1492097A1/de active Pending
- 1965-07-19 AT AT662965A patent/AT261809B/de active
- 1965-07-26 GB GB3178765A patent/GB1075023A/en not_active Expired
- 1965-07-27 NL NL6509680A patent/NL6509680A/xx unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NL6509680A (de) | 1966-01-28 |
| AT261809B (de) | 1968-05-10 |
| GB1075023A (en) | 1967-07-12 |
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