DE1492017A1

DE1492017A1 - Verfahren zur Isolierung von sauren Polysaccariden aus tierischen Geweben

Info

Publication number: DE1492017A1
Application number: DE19641492017
Authority: DE
Original assignee: MALGOUZOU GUY LOUIS JOSEPH
Current assignee: MALGOUZOU GUY LOUIS JOSEPH
Priority date: 1963-02-21
Filing date: 1964-02-20
Publication date: 1969-02-20
Also published as: CH460248A; NL6401563A

Description

Verfahren zur Isolierung von sauren Polysaochariden aus tierisonnen Geweben Gegenstand der Erfindung ist die Behandlung von tierischen Geweben, insbesondere zur Abtrennung von sauren Polysacchariden.
Ziel der Erfindung ist insbesondere die Gewinnung von Polysacchariden, welche von den sie begleitenden Proteinen und Mineralsalzen irei sind.
Nach einer Ausführungsform dieses Verfahrens behandelt man ein tierisches Gewebe Ilt einer wässrigen alkalischen Lösung von Xthyl en diamin-tetraoseigsäure (ÄDTE), isoliert die fltiseige Phase oder den rohen Extrakt, behandelt diesen anschliessend mit einem Kationenaustauscherhars IR 50, in seiner Porme ç 64, bei einom pH-Wert von etwa 5, um aus den Extrakt den grösseren Anteil der Proteine zu entfernen und behandelt den teilweise von Proteinen befreiten Extrakt mit einer quaternären Ammoniumverbindung, die geeignet ist, die sauren Polysaocharide aussufällen.
Es whrde gefunden, dass die Behandlung mit dein Dinatriumsals der #DTE die im uraprünglichen Gewebe enthaltenen sauren Polysaccharide löslich machte.
Da letzteres aus einem Knochen- oder Knorpelgewebe besteht, übt das Dinatriumsal der #DTE ausserdem seine bekannte entkalkende Wirkung aus, wozu noch die Wirkung der Lösliohmaohung bestimmter Co 11 agen-Pro teine und der Chondroitin-Schefelsäure des Knorpel kommt.
Die wässrige alkaliscje Lösung von #DTE wird vorzugsweise aus dem Dinatriumsalz der Säure hergestellt, welches intereasanterweise direkt in Wasser löslich ist, was bei der Säure nicht der Fall ist, und das ausserdem viel weniger kostspielig ist..
Zur Erzielung bester Ergebnisse ist es zweckmässig, das Dinstriumsslz als gesättigte wässrige Lösung ansuwenden und den pH-Wert durch Zusatz von Alkali, z.B. 2nNaOH-Lösung auf etwa 8,6 einzustellen.
Bs erweist sich als Vortail, wenn man das Gewebe mit der grösstmöglichen Oberfläche, d.h. in feinverteiltem Zustand, in Kontakt mit der Behandlungslösung bringt. Während der Kontaktzeit, welche etwa 12 Stunden betragen kann, sollte das Geweben pulver vorzugaweise in der Behandlungeflüssigkeit in Bewegung gehalten werden.
Vor der Durchführung der Behandlung mit dem kationischen Harz lässt man den vom Gewebe getrennten alkalischen Extrakt vorteilhafterweise reifen, so dass die Hydrolyse vorzugsweise während 24 Stunden vor sich geht.
Vor der Reifung und im Hinblick auf die Herauslösung der löslichen Bestandteile aus dem Gewebe ist es zweckmässig, das Pulver von der die JIDTS enthaltenden Flüasigkeit abzutrennen und ea während einer längeren Zeit, etwa 12 Stunden lang, mit einer wässrigen Lösung von Ätznatron su waschen, insbesondere einer 4,'igen Lösung von 2nNaOH9 und dem alkalischen Extrakt zur Reifung des gesamten Materials die Waschfltlssigkeit zuzusetzen.
Bei diesen Behandlungen mit #DTE, den W@sch- und Reifungsvorgängen kann man bei Temperaturen von wenigen Grad über 0 bis Umgebungstemperaturen von etwa 200arbeiten. Vorteilhaft ist das Arbeiten bei den niedrigsten Temperaturen dieses Bereichs, s,B, 4 bis 5°.
In der zweiten Stufe des erfindungsgemässen Verfahrens wird die Eigenschaft der Kationenaustausoherharse IR 50 in der Porm X@64 ausgenutzt, um die Proteine zu fi@ieren, welche mit einer Acetat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von etwa 5 ins Reaktionsgleichgewicht gebracht worden sind. Bei diesem pH-Wert beträgt die Kapazität dieser Harze 30 mg Proteine pro g der trockenen Harze, wobei die Fixierung ohne Ionenauetausch stattfindet.
Die Harze dienen als Abscheider fiir das Protein und ermöglichen durch einfaches Dekantieren die Trennung der Polysaccharide, des Dinatriumsalzes von ÄDTE und von Elektrolyten in der flüssigen Phase, und der Proteine in der festen Phase.
Man berechnet den proteingehalt des rohen Extraktes und bestimmt - von dieeer Ziffer ausgehend - die Menge der zu verwendenden IB 50-Harze. In der Praxis erhöht man die theoretische Menge um etwa so%, um ein gutes Ergebnis zu erzielen.
Mit Hilfe von Essigsäure kann man den rohen Extrakt auf einen pH-Wert von 5,5 bringen und dann ungefähr die ilälfte der ale notwendig erachteten Harnmenge zusetzen. Dae ganze wird heftig eine Stunde lang gerührt, dann werden die Harze, z. B durch Filtrieren durch eine Glasfritte abgetrennt.
Das Filtrat wird dann mit der übrigen Harzienge behandelt und nach einer Stunde erneut filtriert.
Der durch das Bars IR 50 teilweise von Proteinen befreite rohe Extrakt wird schliesslich mit einer quaternären Ammoniumverbindung behandelt. Innerhalb des Bereichs der Erfindung ist es möglich, in der umgekehrten Reiheniolge vorzugehen, d.h. sueret die Behandlung mit der quaternären Ammoniumverbindung und erst dann die Proteinentiernung mit dem Harz durchzuführen, doch ist die erstgenannte Durchführungsart leichter und wird bevorzugt. jis quaternäre Ammoniumverbindungen verwendet man im allgemeinen Verbindungen mit einer aliphatischen Kette mit mindestens 12 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 14 oder mehr. Insbesondere kann man Cetylpyridiniumchlorid, Trimethylhexadecylammoniumbromid (Cetiminium), [(p=Methylphenyl)-1-tetradeoyl] trimethylammoniumsulfomethylat und das (die-Isobutyl-phenoxy-äthoxy-äthyl )dimethylbenzylammoniumohlorid verwenden, au serdem, das fundtionell diesen quaternären Verbindungen angleichbare Bensidinchlo rhydrat.
Die fiir das Ausflocken der sauren Polysaccharide benötigte Menge der quaternaren Ammon iumverbindung ist von der Art dieser Verbindung sowie von der Art der in der Lösung anwesenden Ionen abhängig und scheint komplizierten Gesetzen zu unterliegen.
Ebenso ist es in der Praxis zweckmässig, die zu verwendende Menge durch vorhergehnde Versuche zu ermitteln. Auch hierbei kann man bei den oben angegebenen Temperaturen arbeiten, a bequemsten bei Umgebungstemperatur, doch erleichtern die niedrigen Temperaturen des Ber@ches, z.B. etwa 40, die Ausfällung.
Um den Niederschlag der quaternären Ammoniumverbindung und der Polysaccharide zu reinigen und insbesondere die Ausschaltung der proteine zu bewirken, ist es vorteilhaft, ihn zu isolieren, dann erneut zu lösen und ihn mehrere Male erneut aussufällen und daswischen (z.B. mit Äther) zu trocknen. Inebesondere kann man die erneute Auflösung des ursprünglichen Niederschlags nach seiner Abtrennung durch Austausch der Ammoniundonen in wässerige Milieu gegen Natrium- oder Calciuiionen bewirken. Am eintachsten rerwendet man eine wässrige Lösung von Natriumchlorid, doch kann man z.B. auch eine wässrige Lösung von Caloiumchlorid verwenden. Zur erneuten Auefällung kann man einen niederen aliphatischen Alkohol wie s,B, Äthanol oder Butanol verwenden; vorzugsweise verwendet man Äthanol wegen seines preises und seines verhältnismässig niedrigen Siedepunktes. Man kann auch suerst einen derartigen Alkohol sur Lösung zusetzen, aus welcher ausgefällt wurde, um den ursprünglichen Niederschlag su lösen und dann Natrium- oder Caloiumionen iür die erneute Ausfällung zusetzen.
Man erhält schliesslioh ein weisses, in Wasser sehr gut lösliches Pulver, welches eine klare, viskose Lösung durch sauren Muoopolyaacohariden ergibt.
In dem besonderen Fall der Behandlung von Knochengewebe kann man auseerdem parallel sur Isolierung der Polysaccharide die Proteine in Form der Lösung der Aminosauren und Peptide mit kurzer kette gewinnen.
In diesem Falle trennt man nach einer besonderen Ausführungsform der Erfindung nach der Behandlung zum Entkalken und Löslichmachen mit #DTE die saure Polysaccharid-Fraktion mit den Proteinen ab und hydrolysiert diese getrennt, um sie in Aminosauren und Polypeptide mit kurzer Kette überzuföhren, damit diese Hydrolyse nicht die Polysaocharidfraktion zersetzt wie dies in ihrer Anwesenheit der Fall wäre.
Ausserdem kann man ron dem Skelett eines Woetue eines Säugetieres ausgehen, welche etwa die Hälfte seines Foetallebens erreicht hat (Kalb von 4 Monaten). Seine Aufbewahrung bei niedriger Temperatur erleichtert die Ab trennung des Fleisches vom kelett. Letzteres wird von dem grössten Teil der den Knochen anhaftenden weichen Gewebefetsen befreit.
Man Kan@ auch das Skelett eines ganz anderen Säugetieres ver-@enden, vorausgesetzt, dass dieses Tier nioht Trager eine Antigens von Porsmann ist.
Zur wirksamen Behandlung der Knochen und Knorpel, z.B. eines Säugetierakeletts, ist es von Vorteil, dies in kleine Teile zu zerlegen. Dies kann durch einfaches Mahlen oder durch Eintauchen in flüsiger Luft geschehen, wodurch die Knochen und die Knorpel leicht zerreibba@ werden und dann durch Mahlen in noch feinere Körner zerkleinert werden können.
Um die auf diese Weise erzielten Teilchen von dem Blutserum und dem Hämoglobin zu beireien, welche sie in eehr grosser Mengem enthalten, kann man aie mit destilliertem Wasser. das ein Antisepticum enthält, z.B. 0,01P Natrium-Quecksilberthiolat, waschen, bis die ausströmende Masse keine dem Auge sichtbare Färbung mehr zeigt.
In der Praxis ist es zweokmäa@ig, die auf diese Weise gewasoheneg Teilchen einer Byophilisierung zu unterziehen, da diese eine Anzahl von Vorteilen bietet.
1. die Möglichkeit der Lagerung und Konservierung des Rohmaterlalx, so dass man die Fabrikation über das ganze Jahr ausdehnen kann, 2. die Möglichkeit der Pulverisierung des trockenen Präparates mit einer Kugelmühle@ man erhält innerhalb einiger Minuten ein nicht fUhlbares Pulver, welches das ideale Material tür eine quantitativ und qualitativ hochwertige Extraktion darstellt.
Die Ausbeute dieses Verfahrens pro 100 g gemanlener und gewaschener Knochen und Knorpel beträgt etwa 33 g trockenes Pulver.
Es kann daher auf die folgende Weise vorgegangen werden: Man behandelt das Knochen- und Knorpelpulver mit einer wässrigen Lösung des Dinatriumsalzes von @DTE. Es wurde gefunden, das@ dieses Salz ausser seiner bekannten entkalkenden Wirkung die Löslichmachung bestimmter Collagen-Proteine und der Chondroitin-Schwefelsäure aus Knorpel bewirkt.
Während des unter den oben beschriebenen Bedingungen durchgeführten Kontakt es, dessen Dauer etwa 12 Stunden betragen kann, sollte das GEwebepulver in der Behandlungeflüssigkeit in Bewegung gehalten werden, Die folgende Verfahrensstufe besteht in der Behandlung der flüesigen Phase oder des rohen Extraktes mit einem Hars IR 50 in der Form tE 64, bei einem pH-Wert von ungefähr 5, doch ist es sweckmässig, wenn man vorher den vom Gewebe abgetrennten alkalaschen Exstrakt reifen lässt, damit sich die Hydrolyse, vorzugsweise für einer Zeit von 24 Stunden, fortsetzen kann.
D@nnach kann man den oben beschriebenen Wa ch- und Reifungevorgang durohführen.
Sämtliche Behandlungen des Pulvers mit #DTE, das Waschen mit Alkali wid die Reifung maohen nur einen Teil der Knochen- und Knorpelproteine löslich, bewirken Jedoch die Preisetsung aämthoher saurer Polysaocharide. Der auf diese weise erzielte erste Extrakt (roher Extrakt) enthält Proteine, Gluooproteine und neutrale Polysaccharide@ in geringer lenge findet man d rin ein Polyssooharid mit Heparinoid-Wirkung, welches eine viel bedeutendere elektrophoretisohe Beweglichkeit als die sauren Polysaccharide hat.
Es folgt dann die Abtrennung des grösseren Anteils der im rohen Extrakt enthaltenen Proteine, mittels IR 50, vorsugaweise in Form einer zweifachen Behandlung, wie es oben beschrieben wurde.
Die nach der Behandlung erzielten beiden Harzanteile werden dann vereinigt, mit einem Acetat-Puffer bei einem pH-Wert von 5,5 gewaschen und dann in Wasser suspendiert.
Diese Lösung wird dann mittels Soda auf den pH-Wert 10,5 gebracht. Mach den Piltrieren sind die Proteine von ihren Träger eluiert. Die Harze werden dann mit Wasser, welches 10% 2n Soda enthält, gewaschen.
Auf diese Weise werden fast die gesametn in Lösung befindliohen proteine im rohen Extrakt gewonnen und man erhält den sogenannton "gereinigten Proteinextrakt".
Zur Umwandlung der in grosser Menge im Proteinextrakt vorkommenden Proteine in Aminosäuren und Polypeptide mit kurzer Kette kann man jodes bekannte Verfahren d.s sauren oder ensymatisohen Anfsohlusses anwenden.
Insbesondere kann man sunäohst eine erste Hydrolyse mittels Papain, dann eine zweite Hydrolyse mittels Trypsin durohführen, den unlöslichen Rückstand entfernen und das Hydrolyseprodukt dadurch reinigen, dass man es über Aaberlit-Hars IR 120 in seiner sauren Form leitet, nach da ton Partridge und Brimley beschriebenen Prinzip der Verdrängungs-Chromatographie Bit einer 4n-Ammoniaklösung als Verdrängungsmittel.
Zur Hydrolyse der Proteine kann man z.B. den pH-Wert des auf diese weise erzielten Gemischs mittels Essigsäure auf 5,5 einstellen, dann setzt man so oft wie nötig das folgende Gemisch z'11 rohes Papain 1 g Dinatriumsalz von #DTE 0,90 g Chlorhydrat von Cystein 0,39 g Acetat-Puffer zur Erreichung eines pH-Werts von 5 50 cci Die Hydrolyee wird während 36 Stunden bei einem pH-@ert von 5,5 und einer Temperatur von 600 durohgeführt.
Mach Beendigung dieser Zeit wird der pH-Wcrt mittels 2n-Soda auf 7,2 erhöht und man setzt so oft 400 ag Pancrinase Chosy (Quelle für Trypsin) su, wie g Papain benötigt werden.
Dieser sweite Teil der Hydrolyae wird während 24 Stunden bei 37° durchgeführt.
Mach Beendigung dieser baden Hydrolysen bleibt ein unlöslicher Rückstand, rohen man entfernt. Man ersielt ein Gemisch aus Aminosäuren und Polypaptiden, welche gereinigt werden müssen. dieser diesen Aminosäuren und Polypeptiden enthält das Gemisch Zersetzungsprodukt der Enzyme und Mineralsalze, welche aus vorherigen Behandlungen stammen.
Um das Gemisch von diesen Verunreinigungen zu befreien, verwendet man Amberlit-Harze IR 120 in saurer Form, wie sie oben erwähnt wurden, mit einer 4n-Ammoniaklösung als Verdränungsmittel.
Mach der Verdampfung des Ammoniaks aus dem Eluat erhält man eine bernateinfarbene Lösung, die sich durch Papierchromatographie vollständig charakterisieren lässt.
Das folgende Beispiel dient zur Erläuterung der Erfindung.
Beispiel 100 g trockenes Knochen- und Knorpelpulver wird ein erstes Mal mit 1000 com Wasser welches 110 g Dinatriumssls von #DTE enthält, behandelt, dann wird die Losung mittels 2nJaOH auf den pH-Wert 8,6 gebracht. Das ganze wird 12 Stunden bei Laborato0 riumstemperatur heftig gerührt.
Sobald die unlösliche Phase gewonnen ist, wird aie 12 Stunden mit einem Liter Wasser, welches 40 com 2nNaOh enthält, gewaschen. Man mischt die beiden Extrakte, welche in einem Volumen von etwa 2 Litern den rohen Extrakt bilden.
Bevor das Verfahren fortgesetzt wird, lässt man den Extrakt 24 Stunden laug reifen, um eine teilweise Hydrolyse durch Alkali hervorzurufen. Die nach der Methode von Lowry (Tyrosin-Index) durchgeführte Dosierung der Proteine betragt etwa 1500 Gamma pro cci.
Der feuchte unlösliche Rückstand wiegt etna 200 g.
Der pH-Wert des rohen Extraktes wird mittels Essigsäure auf 5 eingestellt.
Dann wird ein erstes Mal 200 g Amberlit-Harz IR 50 in der Porm XE 64 zugesetzt, das mittels eines Acetat-Puffers vom Typ Sorensen auf einen pH-Wert von 5 gepuffert wurde, Das ganze wird 1 Stunde heftig gerührt, dann werden die Harze auf einer Pritte Mr. 2 (Morm Afnorpyrex) abgetrennt.
In dem auf diese Weise behandelten rohen Extrakt ist daher eine Menge von eta 600 Gamma Proteinen/ccm anwesend.
Dann setzt man erneut 200 g Harz IR 50 zu, das mit einer Puffersubstanz auf den pH-Wert 5 gebracht worden war, und wiederholt das obengeuchriebene Verfahren.
Nacn dissen beiden Behandlungen ist das Gewicht der Proteine des rohen Extraktes auf 400 Gamma/ccm gesunken.
Der teilweise von proteinen befreite rohe Extrakt (ungerähr 2 Idter), deusen pH-Wert 5 beträgt, wird mit destilliertem Wasser auf 3 Liter aufgefüllt. Die ur Bewirkung einer Totalaurnokkung erforderliohe Menge Cetiminium wird ermittels. Zu diesem Zwecke werden zu jeweils 10 Proben von 10 com der auszuflockenden Lösung (in Reagenzgläsern) mittels eines Tropfenzählers im ersten Fall 1 Tropfen, ii zweiten 2 Tropfen, im dritten 3 Tropfen usw. einer wässrigen Lösung mit 20% Cetiminium sugesetzt. In allgemeinen vollzieht sich die Ausflockung in der Lösung, der 6 Tropfen zugesetzt worden waren. Im Hinblick darauf, dass 1 ccm der Lösung mit 20% Cetiminimum aus 36 Tropien besteht, sind 50 cci dieser Lösung notwendig, um das gewünsohte Ergebnis zu erzielen.
Nach heftigem Rühren des Gemisohs lässt man die flocken absitzen, welche abzentrifugiert werden. Das Feuchtgewicht des Miederschlags beträgt 35 g.
Dieser Miederschlag wird dann in 100 ccm qp%iger wässriger Natriumchlorid-Lösung gelöst. Die Auflösung vollzieht sich ziemlich langsam, und es muss heftig gerührt werden.
Die Lösung wird durch Zentrifugieren geklärt und der Bodensatz entfernt.
Schliessllch erhält man eine überetenende opalessierende gelbliche, leicht viskosse Flüassigkeit. lan fällt dann die Polyascoharide durch Zusatz von 200 ocm 95%igem Äthylalkohol unter Rühran aus. Man lässt sie absitsen und erhält einen weisslichen Miederschlag, der sioh durch Zentrifugieren gewinnen läsat.
Dieser Niederschlag wird dadurch dehydratisiert, dase man ihn nacheinander mit 50 ccm 80%igem Alkohol, danach 95%igei Alkohol und schliesslich abselutem Alkohol wäscht und zuletzt die Dehydratisierung durch eins letzte Waschung mit 50 ccm äther verevollständigt.
Wach dem Verdampfen des #thers bleibt ein weisses Pulrer surück, welches ungefähr ein Zehntel des Feuchtproduktes wiegt, nämlich 3,50 g. Dieses Produkt ist noch unrein und enthält insbesondere die bei der Ausfällung durch das Cetiminium mitgesohleppten Proteine, Um diese zu entfernen, löst man das erhaltene weisse Pulver in 50 ocm 1,8%iger wässriger Matriumchloridlösung, der man 2 com einer Puffersubatans bis zu einem pH-Wert von 5 zugesetzt hat. Die Polysaocharide lösen sich sehr schnell, während die Proteide unlöslich bleiben. Letztere werden absentrifugiert. Die überstenende flüasigkeit wird erneut mit dem zweifachen ihres Volumens an 95%igem Alkohol in Anwesenheit von 10 ccm wäsxssriger Matriumchloridlösung, Natriumchloridlösung behandelt, und dann auf die oben angegebene Weise dehydratisiert. Man erhält Puffersubstanz 2 g des trockenen Produktes, welches in wässriger Lösung eine vollständig durchsichtige und durchscheinende Lö-Lösung mit erhöhter Viskosität ergibt.

Claims

P A T E N T AN S P R # C H E t 1. Verfahren zur Behandlung von tierischen Geweben zur Abtrennung der in diesen Gerieben enthaltenen sauren Polysaccharide, dadurch gekennzeichnet, dass man ein derartiges Gewebe mit einer wässrigen alkalischen Lösung von #thylendfiamin-Tetraessigsäure (#DTE) behandelt, die flüssige Phase oder den rohen Extraltt isoliert, diesen anechliessend mit einem Katicoenaustsuacherhars IR 50, in seiner Form IL 64 bei einem pH-Wert von ungefähr 5 behandelt und den grössten Teil der Proteine aus dem Extrakt entfernt und den teilweise von den Proteinen befreiten Extrakt mit einer quaternären Ammoniumverbindung zur Ausfällung der sauren Polysaccharide behandelt.
2. Verfahren nach Anspruch l, dadurch gekennzeichnet, dass man als wässrige Lösung von #DTE eine gesättigte Lösung des Dinatriumsalzes dieser 8äure verwendet, welche die für einen Ph-Wert von etwa 8,6 erforderliche Menge Alkali enthält.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, daduroh gekennzeichnet, dass man das Gewebe in feinteiligem Zustand mit der alkalisohlen wässrigen Lösung von ÄDTE fUr eine Zeit von etwa 12 Stunden in Kontakt bringt.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gokennzeichnet, dass man nach der Abtrennung der flüssigen Phase die Be vorzugsweise etwa 24 Stunden ruhen lässt, bevor man die Behandlung mit den kationischen Harzen durchführt.
5. Verfahren nach einem de. vorstehenlen Ansprüche, dadurch gokennzeichnet, das man da Gewebe nach der. Abtrennung von der Lösung von #DTE mit einer wässrigen Lösung ron #tsnatron wäscht, insbesondere mit einer 4%igen wässrigen Lösung von 2nNaOH und die Waschflüssigkeit der nach Anspruch 4 ruhenden flüssigen Phase Zusetzt.
6. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man f@ir die Behandlung mit dem Kationaustauscherharz einen Überschuss des letzteren über die in Bezug aui die im rohen Extrakt enthaltene Proteinmenge berechnete Menge, insbesondere einen berschuss von etva 50%, ver@endet.
7. Verfahren nach einem der vorstehenden Anaprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man dem rohen Extrakt Essigs@ure zusetzt, bis bei der Behandlung mit dem Kationenaustauscherharz ein pH-Wert von etwa 5 erreicht ist.
8. Verfahren nach einem der vorstehenden Anspruche, dadurch gekennzeichnet, dass man als quaternäre Ammoniumvarbindung eine Verbindung mit einer aliphatischen Kette mit mindestens 12, insbesondere mindestens 14 Kohlenstoffatomen verwendet, insbesondere Trime thylhexsrdey lammoniumbromi d.
9. Verfahren nach einem der voratehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man den Nied reschlag von quaternärem Ammoniumsalz und sauren Polysacchariden löst und anschliessend wieder ausfällt und adbei insbesondere einen Austausch der Ammoniumionen gegen Natrium- ode Calciumionen bewirkt, wobei man insbesondere den Niederschlag isoliert und zu einer wassrigen Lösung eines Natrium- oder Calciumsalzes, Vorzugsweise des Chlorids, gibt, dann einen niederen aliphatischen Alkohol zusetzt oder Uberdies einen derartigen Alkohol der Lösung zusetzt, aus der der Nied@rschlag entstanden ist, um ihn wie@er aufzuldsen und dann eine wässrige Lösung des Natrium- oder Caloiumsalzes zusetzt.
10. Verfaiiren nach einem der voratehenden Ansprüche, d@duroh gekenrszeicnnet, daes man im Falle eines Knochengewebes iDTE in einer Menge v.rwendet, die ausser der Löslichmachung der sauren Polysaccharide die Entkalkung und Lösung der Collagenproteine und d Chondroitin-Sch jefelaqure des Knorpel bewirkt.
11. Verfahren nach Anspruoh 10, dadurch gekennzeiohnet, dass man die von den IR 50-Harzen zuruokgehaltenen Proteine und gegebenenfalls diejenigen, die im unlöslichen Rückstand aus der Behandlung mit #DTE vorliegen, einem sauren ensymatischen Abbau unterwirft, insbesondere einer ersten Hydrolyse mittels Papain und dann einer z@eiten Hydrolyse mittels Trypsin.