DE1445619C - Verfahren zur Herstellung von 7 Amino cephalosporansauree stern - Google Patents

Description

1 2

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur 19,3 mg Extrakt Nr. 2 (chloroformlöslicher Nieder-

Herstellung von 7-Amino-cephalosporansäureestern, schlag), der nach Dünnschichtchromatogramm (Ta-

das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Diester des belle 1) und IR-Spektrum (Banden bei 5,61, 5,75 und

Cephalosporin C mit niedermolekularen Alkylalko- 5,93 ιημ) neben wenig Ausgangsmaterial Nebenpro-

holen, p-Nitrophenol, 2,4-Dinitrophenol, 2,3,6-Tri- 5 dukte enthält.

nitrophenol, Benzylalkohol, p-Nitrobenzylalkohol, 4,3 mg Extrakt Nr. 3 (aus Anteil Puffer pH 3,3),

p-MethoxybenzylalkohoI, Benzhydrol oder p,p-Di- nach Dünnschichtchromatogramm (Tabelle 1) wenig

methoxybenzhydrol mit freier Aminogruppe in Ben- Ausgangsmaterial enthaltend.

zol, Nitromethan, Dioxan oder chlorierten Kohlen- 26,8 mg (44% Ausbeute, auf Cephalosporin bezowasserstoffen in einer Konzentration von etwa 0,2 io gene Gesamtausbeute: 25,4%) 7-Amino-cephalospobis 1% bei Zimmertemperatur, gegebenenfalls in ransäurebenzylester in Extrakt Nr. 4 (aus 2% Phos-Gegenwart von Essigsäure oder wäßriger Essigsäure, phorsäure-Anteil). IR-Spektrum in Methylenchlogewünschtenfalls zusammen mit Pyridin, einige Tage rid: Banden bei 5,62 und 5,75 ιτιμ. Nach Dünnschichtstehen läßt und den 7-Amino-cephalosporansäure- chromatogramm (Tabelle) einheitlich,
ester isoliert. 15 Das Produkt kann in Eisessig in Gegenwart von

Die Ester können durch Hydrolyse oder Hydro- Palladiumkohle (10% Pd) zur 7-Amino-cephalospo-

genolyse in die freie 7-Amino-cephaIpsporansäure ransäure hydriert werden.

übergeführt werden. In dieser Beziehung besonders Der als Ausgangsstoff verwendete Cephalosporin

günstig ist der Benzhydrylester, der mittels Trifluor- C-dibenzylester kann wie folgt hergestellt werden:

essigsäure und Anisol gespalten werden kann, auch der 20 9,43 g Cephalosporin C (20 mMol) werden in 250 ml

p-Methoxybenzylester kann so hydrolysiert werden; 1 n-Natriumbicarbonat gelöst, mit 3,62 ml tertt-Bu-

sehr geeignet sind ferner der p-NitrobenzoI- und tyloxycarbonylazid (26 mMol), gelöst in 150 ml Di-

Benzylester, die mittels katalytisch erregten Wasser- oxan, versetzt und 5 Stunden bei 40° gerührt. Die an-

stoffs gespalten werden. schließend im Vakuum bei 0,5 mm Hg und 30° auf

Die als Ausgangsmaterial verwendeten Diester 25 etwa 150 ml eingeengte Lösung verdünnt man mit

des· Cephalosporins C werden beispielsweise herge- 200 ml Wasser und extrahiert mehrere Male mit

stellt, indem man die freie Aminogruppe des Cephalo- Essigester. Die mit Kochsalz gesättigte, wäßrige

sporins C durch eine Aminoschutzgruppe, z.B. eine Phase wird darauf bei pH 2,0 in der Kälte er-

Acylgruppe, wie Trifluoracetyl, Tosyl, Carbobenzoxy schöpfend mit Essigester ausgezogen. Trocknen des

oder vor allem tert.-Butyloxycarbonyl, Trityl oder 30 mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschenen Extrak-

o-Nitrophenylsulfenyl, blockiert, dann die Carboxyl- tes über Natriumsulfat und Eindampfen im Vakuum

gruppen verestert und die Aminoschutzgruppe ab- ergibt 10,7 g amorphes, farbloses N-fert.-Butyloxy-

spaltet. carbonyl-cephalosporin C (91,6% Ausbeute).

Als Nebenprodukt wird bei der Aminolyse ε-Ami- Rf-Wert im Papierchromatogramm im System 1

noadipinsäur'elactam-monoester gebildet. Dieser läßt 35 [n-Butanol—Essigsäure (10:1) gesättigt mit Wasser]:

sich als neutrale Substanz von dem gewünschten ba- 0,80; im System 2 (wassergesättigtes n-Butahol + 1%

sischen-Reaktionsprodukt leicht trennen, z. B. durch Eisessig): 0,51. Bioautographischer Nachweis mit

Extraktion mit sauren Lösungsmitteln, Chromato- Staph. aureus.

graphie oder Gegenstromverteilung. Zu einer Lösung von 3,2 g (6,15 mMol) N-tert.-

In den nachfolgenden Beispielen sind die Tempera- 40 Butyloxycarbonyl-cephalosporin C in 64 ml . abs.

türen in Celsiusgraden angegeben. Äthylenglykoldimethyläther läßt man im Verlaufe von

η ■ ■' 1 1 5 Minuten 185 ml ätherische Phenyldiazomethanlö-

^BeisP^{iel 1} sung, enthaltend 16 mMol Reagens, zutropfen und

100 mg Cephalospirin C-dibenzylester werden in rührt 40 Minuten bei 25° im Dunkeln. Hierauf wird

20 ml reinstem Methylenchlorid gelöst und im Dun- 45 überschüssiges Reagens durch Zugabe von 2 ml Eis-

keln bei 22° stehengelassen. Die dabei ablaufende intra- essig zerstört, wobei man 30 Minuten im Dunkeln

rriolekulare Reaktion läßt sich bequem im IR-Spek- weiterrührt. Die Reaktionslösung wird im Vakuum

trum (l-mm-Zelle) verfolgen: eingedampft, der Rückstand in 120 ml Methylenchlo-

Die Amidbande des Ausgangsmaterials bei 5,93 ηιμ rid aufgenommen, zweimal mit 60 ml eiskalter n-Na-

wird im Laufe mehrerer Tage stetig schwächer, wäh- 50 triumbicarbonatlösung und dann zweimal mit 50 ml

rend sich daneben bei 6,00 πιμ eine neue Bande wach- 10%iger Natriumchloridlösung gewaschen. Die wäß-

sender Intensität ausbildet (Lactambande des Spalt- rigen Phasen werden der Reihe nach zweimal· mit

Produktes d-Carbobenzoxy-o-amino-valerolactam). 40 ml Methylenchlorid nachextrahiert. Die mit Na-

Nach 20 Tagen dampft man im Vakuum ein, nimmt triumsulfat getrockneten und im Vakuum eingedampf-

in Chloroform—Äther (1:3) auf und schüttelt nach- 55 ten Methylenchloridlösungen ergeben 6,17gamorpheh,

einander mit 0,1-molarem Phosphatpuffer pH 3,3 und zum Teil öligen Rückstand, welcher an der zwanzig-

2 % wäßriger Phosphorsäure aus. Dabei scheidet sich fachen Gewichtsmenge Silicagel (entaktiviert mit

ein Niederschlag ab, der in Chloroform gelöst wird. 5 Gewichtsprozent Wasser) chromatographiert wird.

Die beiden wäßrigen Auszüge extrahiert man bei Mit Methylenchlorid-Aceton-Gemisch (95:5) lassen

pH 8,5 separat mit Essigester. Die über Magnesium- 60 sich 2,73 g (Ausbeute 63%) N-tert-Butyloxycarbonyl-

sulfat getrockneten organischen Phasen geben beim cephalosporin C-dibenzylester elüieren, welcher aus

Eindampfen folgende Rückstände: Aceton—Äther—Petroläther (Kp. 50 bis 70°) umkri-

25,9 mg Extrakt Nr. 1 [Chloroform—Äther (1:3)- stallisiert wird. F. 88,5 bis 91°.

Anteil], der nach IR-Spektrum (Banden bei 5,75 und IR-Absorptionsspektrum in Nujol: Banden unter

6,00 ΐημ in Methylenchlorid) aus <5-Carbobenzoxy- 65 anderem bei 2,98 μ, 5,61 μ, 5,78 μ (mit Schulter bei

0-amino-vaIerolactam besteht. Im Dünnschichtchro- 5,70 μ), 5,91 μ, 6,05 μ, 6,57 μ, 6,83 μ, 7,24 μ, 7,69 μ,

matogramm keine Flecke mit Jodstärke und Nin- 8,02 μ, 8,17 μ, 8,55 μ, 8,99 μ, 9,32 μ, 9,53 μ, 9,75 μ,

hydrin-Collidin. . 10,37 μ, 11,0 μ, 11,53 μ, 13,37 μ und 14,40 μ. UV.-Ab-

Sorptionsspektrum in Feinsprit: λ,_ηαχ 265 ηιμ (ε = 8200).

Rf-Wert im Dünnschichtchromatogramm auf SiIicagel (System Benzol—Aceton 8:2): 0,46.

Reaktion nach R e i η d e 1 und Hoppe (Ber., 87, S. 1103 [1954]): gelb mit violettem Hof.

Reaktion mit Jod-Stärke-Essigsäure (R. Thomas, Nature, 191, S. 1161 [1961]; P. H. A. S η e a t h und Z. F. Collins, Biochem. J., 79, S. 512 [1961]): positiv. . ίο

140 mg N-tert.-Butyloxycarbonyl-cephalosporin C-dibenzylester (0,2 mMol) werden mit 2 ml Trifluoressigsäure 5 Minuten bei 25° stehengelassen. Man entfernt hierauf die Trifluoressigsäure im Vakuum. Der ölige Rückstand wird in 20 ml Methylenchlorid aufgenommen, zweimal mit 10 ml eiskalter n-Natriumcarbonatlösung, dann zweimal mit 10 ml lO°/oiger Natriumchloridlösung gewaschen. Die wäßrigen Phasen werden noch zweimal mit 5 ml Methylenchlorid nachextrahiert. Aus den mit Natriumsulfat getrockneten Methylenchloridlösungen erhält man beim Eindampfen im Vakuum 120 mg (Ausbeute quantitativ) Cephalosporin C-dibenzylester, welcher im Dünnschichtchromatogramm folgende Rf-Werte aufweist:

Systen Rf

Dioxan—Wasser 0,77

Benzol—Aceton (1:1) 0,29

Chloroform—Methanol (9:1) 0,56

tert.-Benzylalkohol—i-Propanol—

Wasser (100:40:55) 0,62

n-Butanol—Essigsäure—Wasser

(100:100: gesättigt) 0,57;

Reaktion mit Jod-Stärke-Essigsäure ... positiv Reaktion nach R e i η d e 1 und

Hoppe gelb

Reaktion mit Ninhydrin-Collidin kirschrot

Rf-Werte im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel

Ausgangsmaterial Extrakt Nr. 2

Extrakt Nr. 3

Extrakt Nr. 4

System

n-Butanol—Essigsäure 10:1 gej sättigt mit Wasser

System
Benzol—Aceton 6:4

!Indikator

Ninhyd rin-Collidin
Indikator

Jodstärke

0,60

0,16

rotviolett

positiv (0,61)
0,80 bis 0,95

O₅O bis 0,22

fleischfarben

positiv

0,61

(0,47)

0,36

0,15
0,0

rotviolett
positiv

0,67

0,62

dunkelgelb positiv

Das Reagens wird nach R. T h ο m a s, Nature, 191, S. 1161 (1961), hergestellt Schwache Flecke sind durch Klammern angedeutet.

B e i s ρ i e 1 2 -·■·..■

2,61 g Cephalosporin C-dibenzylester werden in 520 ml Methylenchlorid gelöst, mit 5,2 ml eines äquimolekularen Gemisches von Pyridin und Eisessig versetzt und 4 Tage im Dunkeln bei 22° stehengelassen. Die wie im Beispiel 1 durchgeführte Aufarbeitung ergibt folgende Extrakte:

945 mg Extrakt Nr. 1 [Chloroform—Äther-(1:3)-Anteil], bestehend aus o-Carbobenzoxy-o-amino-valejrolactam.

I 680 mg Extrakt Nr. 2 (chloroformlöslicher Niederschlag).

J 136 mg Extrakt Nr. 3 (aus Anteil Puffer pH 3,3), bestehend aus Cephalosporin C-dibenzylester.

604 mg (38 % der Theorie) einheitlichen 7-Amino- ^cephalosporansäure-benzylester in Extrakt Nr. 4 (2% Phosphorsäureanteil) auf Cephalosporin C bezogene !Ausbeute: 21,9%.

Die Charakterisierung aller Produkte erfolgt wie im Beispiel 1 mittels IR-Absorptionsspektrum und Dünnschichtchromatogramm (vgl. Tabelle).

Beispiel 3

100 mg Cephalosporin C-dibenzylester werden in 20 ml Methylenchlorid gelöst, mit 0,02 ml eines äquimolekularen Gemisches von Pyridin und Eisessig sowie mit 0.02 ml Wasser versetzt und 7¹/, Tage im Dunkeln bei 22° stehengelassen. Aufarbeitung analog Beispiel 1 gibt folgende Extrakte:

46,2 mg Extrakt Nr. 1

15,5 mg Extrakt Nr. 2

9,5 mg Extrakt Nr. 3

32,1 mg Extrakt Nr. 4

bestehend aus einheitlichem 7-Amino-cephalospofansäurebenzylester. Ausbeute: 53%, auf Cephalosporine bezogen: 30,5%.

Beispiel 4

100 mg Cephalosporin C-dibenzylester, gelöst in 20 ml Methylenchlorid, versetzt man mit 0,02 ml 2 η-Essigsäure und läßt I¹I₂ Tage bei 22° stehen. Aufarbeitung wie im Beispiel 1 liefert

42,8 mg Extrakt Nr. 1

20,0 mg Extrakt Nr. 2

15,2 mg Extrakt Nr. 3 und

^6<> 30,9 mg (Ausbeute r 51 %, auf Cephalosporin C bezogen: 29,4%) 7-Amino-cephalosporansäure-benzylester in Extrakt Nr. 4

Beispiel 5

In gleicher Weise, wie im Beispiel 1 bis 4 beschrieben, werden Cephalosporin C-dimethylester, Cephalo-

Claims (1)

1. 5 6

   sporin C-diäthylester und Cephalosporin C-di-n-butyl- ester, der aus Chloroform—Äther (1:4) gelbliche ester behandelt. Man erhält so 7-Aminocephalospo- Kristalle bildet. Nach Umkristallisation schmilzt der ransäure-methylester, -äthylester und -n-butylester. Ester bei 104 bis 106°. Gemäß Dünnschichtchromato-Diese haben folgende Rf-Werte im Papierchromato- gramm an Silicagel ist die Verbindung einheitlich, gramm, System I (n-Butanol—Essigsäure 10:1, ge- 5 Der Rf-Wert im System Chloroform—Methanol sättigt mit Wasser): Methylester: Rf I = 0,13; Äthyl- (95:5) ist 0,79, in Cyclohexan—Essigester (1:1) 0,19. ester: Rf I = 0,15; n-Butylester: Rf I = 0,16; gelb- Man erhält gelbe Flecke mit Natronlauge, farblose braune Färbung mit Ninhydrin-Collidin oder bioauto- Flecke mit Jod-Stärke-Reagens. Die tert.-Butyloxygraphischer Nachweis mit Staph. aureus nach Besprü- carbonylgruppe wird, wie im Beispiel 1 beschrieben, hen mit lmolarem Pyridin in Aceton—Wasser (1:1) io mit Trifluoressigsäure abgespalten,
   und l°/_oigem Phenylacetylchlorid in Aceton. Das

   UV-Spektrum zeigt ein Maximum bei 263 Γημ. Beispiel 7

   Die als Ausgangsstoffe verwendeten Diester werden 12,6 g Cephalosporin C-di-benzhydrylester werden

   wie folgt hergestellt: 15 in 2 Liter absolutem Methylenchlorid gelöst, mit 2 ml

   1 g N-tert.-Butyloxycarbonyl-cephalosporin C wird 2normaler wäßriger Essigsäure versetzt und 8 Tage bei in 20 ml Methanol gelöst, auf 0° gekühlt und unter 22° im Dunkeln stehengelassen. Man dampft im Va-Umschwenken mit 15 ml einer ätherischen, 4°/₀igen kuum ein und nimmt den Rückstand in einem Ge-Diazomethanlösung (bzw. Diazoäthan- oder Diazo- misch von 5 Teilen Toluol, 2 Teilen Essigester, 3 Teibutanlösung) versetzt. Nach etwa 5 Sekunden stoppt 20 len Alkohol und 3 Teilen 2normaler wäßriger SaIzman die Reaktion durch Zugabe von 3 ml Eisessig. säure auf. Nach vollständiger Lösung bei kräftigem Das im Vakuum stark eingeengte, dann in 200 ml Essig- Schütteln werden die Phasen getrennt und die Unterester aufgenommene Gemisch wird mit 1 η-Natrium- phase mit zwei weiteren Oberphasen (5 Teile Toluol bicarbonat und gesättigter Kochsalzlösung gewaschen, und 2 Teile Essigester) ausgeschüttelt. Die drei Oberüber Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum ein- 25 phasen werden noch viermal mit Alkohol—2 n-Salzgedampft. Man erhält so den N-tert.-Butyloxycarbo- säurej[(l: 1) nachextrahiert. Die produkthaltigen Unternylcephalosporin C-dimethylester (bzw. -diäthyl- oder phasen werden vereinigt, mit 50°/₀iger wäßriger Trika- -dibutylester) als amorphen farblosen Rückstand. liumphosphatlösung auf pH 6 gestellt und im Vakuum

   Die Rf-Werte der Verbindungen im System I vom Alkohol befreit. Hierauf stellt man mit der Trika-[n-Butanol—Essigsäure (10:1), gesättigt mit Wasser] 30 liumphosphatlösung auf pH 8,0 und extrahiert dreimal bzw. System III (n-Butanol, gesättigt mit Wasser + 1% mit Essigester. Der über Natriumsulfat getrocknete ExEisessig) sind: Dimethylester: Rf I = 0,89; RfIII trakt gibt beim Eindampfen den 7-Amino-cephalo- = 0,84; Diäthylester: Rf I = 0,91; Dibutylester: sporansäure-benzhydrylester, der aus Äther in zu RfIII = 0,70 (bioautographischer Nachweis mit Drusen vereinigten Nadeln kristallisiert; F. 122 bis Staph. aureus). 35 124°; er zeigt im Dünnschichtchromatogramm an

   Die tert.-Butyloxycarbonylgruppe wird mittels Tri- Silicagel im System n-Butanol—Eisessig (10:1) gefiuoressigsäure, wie im Beispiel 1 beschrieben, abge- sättigt mit Wasser einen Rf-Wert von 0,64 (schmutzigspalten, gelber Fleck mit Ninhydrin-Collidin).

   Der Ester kann wie folgt in die freie 7-Amino-

   Beispielö 40 cephalosporansäure übergeführt werden: man löst

   6,8 g = 1 Teil Ester in 1 Teil Anisol und versetzt mit

   Wenn man Cephalosporin C-di-p-nitrophenylester, 5 Teilen Trifluoressigsäure. Man dampft anschließend wie im Beispiel 1 bis 4 beschrieben, hydrolysiert, so sofort bei 0,2 mm Quecksilbersäule innerhalb 20 Mierhält man 7-Amino-cephalosporansäure-p-nitrophe- nuten ein, nimmt in 30 ml Essigester auf und gießt die nylester. Die Verbindung wandert bei der Papier- 45 Lösung gleichzeitig mit etwa 13 ml 50 %iger wäßriger elektrophorese (pH 4,5; 2000VoIt, I¹I₇. Stunden) Trikaliumphosphatlösung unter Rühren auf 20 ml 8,2 cm in Richtung Kathode. 3°/_oige wäßrige Dikaliumhydrogenphosphatlösung.

   Der als Ausgangsmaterial verwendete Cephalosporin Die beiden Zuflüsse sind dabei so zu bemessen, daß C-di-p-nitrophenylester kann wie folgt hergestellt das pH zwischen 6 und 8 pendelt und am Ende auf 7 werden: 50 stehenbleibt. Die abgetrennte wäßrige Phase wird

   6,47 g tert. - Butyloxycarbonyl - cephalosporin C, noch zweimal mit je 10 ml Essigester und die drei Essig-4,24 g p-Nitrophenol und 8,56 g Dicyclohexylcarbo- esterphasen werden zweimal mit je 5 ml 3°/_oiger wäßdiimid werden in 300 ml Acetonitril gelöst und im riger Dikaliumhydrogenphosphatlösung gewaschen. Dunkeln unter Stickstoffatmosphäre 17 Stunden bei Man verwirft die organischen Phasen, vereinigt die 22° stehengelassen. Dann filtriert man vom ausgefal- 55 wäßrigen und stellt mit etwa 4 ml konzentrierter SaIzlenen Dicyclohexylharnstoff (4,38 g) ab und dapft im säure auf pH 3,5. Das nach 15 Stunden Stehen bei 0^c Vakuum ein. Durch dreimaliges Verreiben des Ein- abgeschiedene Produkt wird abfiltriert, mit wenig Eisdampfrückstande's mit je 100 ml Petroläther wird das wasser gewaschen und getrocknet. Man erhält 3,90 g überschüssige Dicyclohexylcarbodiimid herausgelöst (Ausbeute 92%) reine 7-Aminocephalosporansäure. (2,94 g) und vom unlöslichen Produkt abfiltriert. 60
   Dann löst man das Material in Aceton, wodurch weiterer Dicyclohexylharnstoff (0,19 g) abgeschieden wird. ^ Patentanspruch:
   Eindampfen des Filtrats, Aufnehmen in Chloroform

   und erschöpfendes Ausschütteln mit 0,5molarem Phos- Verfahren zur Herstellung von 7-Amino-cephalo-

   phatpuffer pH 7,0 gibt nach Waschen (gesättigte 65 sporansäureestern, dadurch gekennzeich-Kochsalzlösung), Trocknen (Natriumsulfat) und Ein- net, daß man Diester des Cephalosporins C mil

   dampfen der organischen Phase 0,92 g rohen tert- niedermolekularen Alkylalkoholen, p-Nitrophe-

   Butyloxycarbonyl-cephalosporin C-di-p-nitrophenyl- nol, 2,4-Dinitrophenol, 2,4,6-Trinitrophenol, Ben·

   7 8

   zylalkohol, p-Nitrobenzylalkohol, p-Methoxyben- bei Zimmertemperatur, gegebenenfalls in Gegen-

   zylalkohol, Benzhydrol oder ρ,ρ-Dimethoxybenz- wart von Essigsäure oder wäßriger Essigsäure,

   hydrol mit freier Aminogruppe in Benzol, Nitro- gewünschtenfalls zusammen mit Pyridin, einige

   methan, Dioxan oder chlorierten Kohlenwasser- Tage stehenläßt und den 7-Amino-cephalosporan-

   stoffen in einer Konzentration von etwa 0,2 bis 1 % 5 säureester isoliert.